抑制HIV病毒与宿主细胞融合的非对映体多肽及其用途

摘要

本发明涉及一种抑制HIV病毒与宿主细胞融合的非对映体多肽及其用途。所述非对映体多肽为序列表中序列1所示多肽CT105；或者序列表中序列2所示多肽CT106；或者序列表中序列3所示多肽CT107。还包括应用所述多肽得到的化合物或者聚合物或者组合物。该类多肽的作用位点与现有的药物不同，并且水溶性较好、活性高、不易被蛋白酶水解。

权利要求

1.抑制HIV病毒与宿主细胞融合的非对映体多肽，其特征在于：所述非对映体多肽为下述a)或b)或c)：a)序列表中序列1所示多肽CT105；

b)序列表中序列2所示多肽CT106；

c)序列表中序列3所示多肽CT107。

2.应用权利要求1所述抑制HIV病毒与宿主细胞融合的非对映体多肽得到的化合物，其特征在于：所述化合物为下述A)或B)或C)；

A)上述a)或b)或c)所述多肽的氨基端连接氨基保护基和/或羧基端连接羧基保护基得到的化合物；

B)上述a)或b)或c)所述多肽的羧基端连接亲脂性基团得到的化合物；

C)上述a)或b)或c)所述多肽被聚乙二醇、马来酰亚胺修饰得到的化合物。

3.一种组合物，它由两部分构成，第一部分为权利要求1中所述抑制HIV病毒与宿主细胞融合的非对映体多肽；或者第一部分为权利要求2中所述的化合物；或者第一部分为上述非对映体多肽和上述化合物的组合；另一部分为载体或辅料。

4.如权利要求1所述非对映体多肽在制备治疗或预防艾滋病的产品上的应用，其特征在于：至少应用于如下一种产品：c1)治疗艾滋病病人的产品；

c2)预防艾滋病病毒感染的产品。

5.如权利要求2所述化合物在制备治疗或预防艾滋病的产品上的应用，其特征在于：至少应用于如下一种产品：c3)治疗艾滋病病人的产品；

c4)预防艾滋病病毒感染的产品。

6.如权利要求3所述的组合物在制备治疗或预防艾滋病的产品上的应用；其特征在于：至少应用于如下一种产品：

c5)治疗艾滋病病人的产品；

c6)预防艾滋病病毒感染的产品。

说明书

抑制HIV病毒与宿主细胞融合的非对映体多肽及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抑制HIV病毒与宿主细胞融合，不易被蛋白酶水解、低免疫原性的非对映体多肽。本发明还涉及所述多肽的用途。

背景技术

[0002] 获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）感染引起的。艾滋病目前在世界范围内流行，对人类的健康造成了严重的威胁。HIV1型（HIV-1）是造成AIDS感染的主要病原体。接种疫苗是预防HIV-1感染的最佳途径，然而艾滋病疫苗的研发屡受挫折，迄今没有取得突破性的进展。

[0003] HIV-1感染宿主细胞是一个复杂的过程，包括吸附、进入、脱壳、逆转录、整合、复制、转录、翻译、装配、成熟等各个阶段。上述过程的每个阶段均涉及特异性的酶或蛋白参与作用，他们都可能成为药物的有效靶点。目前临床上治疗HIV感染的药物分为4大类：逆转录酶抑制剂（包括核苷类逆转录酶抑制剂和非核苷类逆转录酶抑制剂）、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂、进入抑制剂（辅助受体CCR5拮抗剂）和融合抑制剂。

[0004] 美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准上市的融合抑制剂仅有2003年上市的T20。临床使用时发现，HIV病毒融合抑制剂单独应用即可降低病毒的荷载量，并且副作用较低。与逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂联合使用，不仅可以降低这两种药的使用量，降低副作用，是当前抗HIV药物研究的热点方向。

[0005] 尽管T20的发现开辟了利用肽类药物控制HIV的新领域，但是由于T20本身的不足限制了其发展。首先是耐药性，因为T20完全衍生于HIV-1跨膜蛋白gp41的天然序列，对靶标突变的敏感性较高，靶标序列单个氨基酸残基的突变就会导致T20的活性降低。其次，T20易被胃酸破坏，只能进行皮下注射。第三T20在体内的生物利用度极低，成人给药量为180mg/人，每日两次。

[0006] C34是一种衍生于gp41C端重复序列（C-terminal heptad repeat，CHR）的多肽，与T20不同之处的是C34的N端含有Trp628、Trp631和Ile635，这三个残基能够与gp41N端的疏水口袋结合，从而抑制gp41形成三聚体。而且这三个残基具有高度的序列保守性，病毒不易对C34产生耐药性。然而C34水溶性极差，很难发展成药物，但由于拥有CHR的核心序列，所以可以作为新型抗病毒多肽的设计模板。T1249是T20的第二代产品，它的氨基端类似于C34的N端，羧基端类似于T20的C端，是一个嵌合序列39肽，由HIV-1、HIV-2以及猿免疫缺陷病毒（SIV）CHR区域相关序列构成，与T20相比，在N端增加了与HIV的N端疏水口袋结合的序列。尽管T1249的活性比T20高出一个数量级，但gp41N端重复序列(N-terminal heptad repeat，NHR)突变仍然对其产生耐药性，出于对制剂和市场等方面的考虑，Trimeris/Roche公司终止了T1249的临床研究。基于C34的序列，国内设计了抗HIV多肽西夫韦肽（Sifuvirtide）,安全性和耐受性良好，于2010年顺利完成了Ⅱb期临床研究。

[0007] 由于第一、第二代多肽融合抑制都存在较大的问题，因此研发第三代或下一代高效的融合抑制剂多肽具有重要的理论意义和应用价值。

[0008] 参考文献：

[0009] [1]Peisajovich SG,Gallo SA,Blumenthal R,Shai Y.C-terminal octylation rescues an inactive T20mutant-Implications for the mechanism of HIV/simia nimmunodeficiency virus-induced membrane fusion.J Biol Chem,2003,278(23):21012-21017.

[0010] [2]Tan JJ,Ma XT,Liu C,Zhang XY,Wang CX.The Current Status and Challenges in the Development of Fusion Inhibitors as Therapeutics for HIV-1Infection.Curr Pharm Des,2013,19(10):1810-1817.

[0011] [3]Tan JJ,Cong XJ,Hu LM,Wang CX,Jia L,Liang XJ.Therapeutic strategies underpinning the development of novel techniques for the treatment of HIV infection. Drug Discov Today,2010,15(5-6):186-197.

[0012] [4]Nomura W,Hashimoto C,Suzuki T,Ohashi N,Fujino M,Murakami T,Yamamoto N,Tamamura H.Multimerized CHR-derived peptides as HIV-1fusion inhibitors.Bioorg Med Chem,2013,21(15):4452-4458.

[0013] [5]Hollmann A,Matos PM,Augusto MT,Castanho M,Santos NC.Conjugation of Cholesterol to HIV-1Fusion Inhibitor C34Increases Peptide-Membrane Interactions Potentiating Its Action.PLoS One,2013,8(4).

[0014] [6]Chong HH,Yao X,Qiu ZL,Sun JP,Zhang M,Waltersperger S,Wang MT,Liu SL,Cui S,He YX.Short-peptide fusion inhibitors with high potency against wild-type and enfuvirtide-resistant HIV-1.FASEB J,2013,27(3):1203-1213.[0015] [7]Qi Z,Shi WG,Xue N,Pan CG,Jing WG,Liu KL,Jiang SB.Rationally Designed Anti-HIV Peptides Containing Multifunctional Domains as Molecule Probes for Studying the Mechanisms of Action of the First and Second Generation HIV Fusion Inhibitors.J Biol Chem,2008,283(44):30376-30384.[0016] [8]Li LZ,Ben YY,Yuan SH,Jiang SB,Xu JQ,Zhang XY.Efficacy,Stability,and Biosafety of Sifuvirtide Gel as a Microbicide Candidate against HIV-1.PLoS One,2012,7(5).

发明内容

[0017] 本发明的目的是提供新型的抑制HIV病毒与宿主细胞融合的非对映体多肽，该类多肽的作用位点与现有的药物不同，并且水溶性较好、活性高、不易被蛋白酶水解。

[0018] 抑制HIV病毒与宿主细胞融合的非对映体多肽，其特征在于：所述非对映体多肽为下述a)或b)或c)：

[0019] a)序列表中序列1所示多肽CT105；

[0020] b)序列表中序列2所示多肽CT106；

[0021] c)序列表中序列3所示多肽CT107。

[0022] 或者上述a)或b)或c)所述多肽的氨基端连接氨基保护基和/或羧基端连接羧基保护基得到的化合物；

[0023] 或者上述a)或b)或c)所述多肽的羧基端连接胆固醇或亲脂性基团得到的化合物；或者上述a)或b)或c)所述多肽被聚乙二醇、马来酰亚胺修饰得到的化合物。

[0024] 使用上述的多肽和/或化合物形成的聚合物。

[0025] 一种组合物，它由两部分构成，第一种为上述任意的多肽、化合物、和/或聚合物；另一种为载体或辅料。

[0026] 上述的多肽或化合物，或上述的聚合物，或上述的组合物至少应用于如下一种产品：

[0027] c1)治疗艾滋病病人的产品，如药物或治疗性疫苗；

[0028] c2)预防艾滋病病毒感染的产品；

[0029] c3)辅助治疗艾滋病病人的产品；

[0030] c4)抑制艾滋病病毒进入宿主细胞的产品。

[0031] 本发明所述的第一条多肽的名称为CT105，其残基酸序列如序列表中序列1所示。

[0032] 为了提高多肽的稳定性，所述序列1的第1位氨基酸残基连接有氨基酸保护基，所述序列1的第38位氨基酸残基连接有羧基保护基。

[0033] 本发明所述的第二条多肽的名称为CT106，其残基酸序列如序列表中序列2所示，在序列中加入了D-型氨基酸。

[0034] 为了提高多肽的稳定性，所述序列2的第1位氨基酸残基连接有氨基酸保护基，所述序列2的第38位氨基酸残基连接有羧基保护基。

[0035] 本发明所述的第三条多肽的名称为CT107，其残基酸序列如序列表中序列3所示。

[0036] 为了提高多肽的稳定性，所述序列3的第1位氨基酸残基连接有氨基酸保护基，所述序列3的第38位氨基酸残基连接有羧基保护基。

[0037] 上述氨基端保护基可为：叔丁氧羰基、苄氧羰基、2-联苯基-2-丙氧羰基、邻苯二甲酰亚胺基、对甲苯磺酰基、三苯甲基、甲酰基、三氟乙酰基；所述羧基保护基可为：叔丁基，甲基，乙基，苄基，烯丙基，五氟带苯基，对甲氧苄基，等。

附图说明

[0038] 图1为用非变性凝胶电泳分析HIV-1gp415-helix、6-helix与C34标（A）或CT105（B）的相互作用。

[0039] 图2 SDS对HIV-1gp415-helix与C34标（A）以及HIV-1gp415-helix与CT105（B）相互作用的影响。

[0040] 图3是CT105感染细胞的抑制率（假病毒法）。

[0041] 图4是CT106感染细胞的抑制率（假病毒法）。

[0042] 图5是CT107感染细胞的抑制率（假病毒法）。

具体实施方式

[0043] 下述实施例中所使用的实验方法如果没有特别说明，均为常规方法。

[0044] 下述实施例中所使用的试剂、材料等，如果没有特别说明，均为从商业途径获得。

[0045] 以下的优先实施例对本发明作详细说明，但不意味着限制本发明的内容。

[0046] 实施例1.多肽合成及修饰

[0047] 1.1材料及仪器

[0048] 所需的化学试剂均来源于化学试剂供应商，使用前未纯化。仪器设备有固相合成管，TS-2摇床，Multifuge X1R离心机，DZF6050型真空干燥器等。

[0049] 1.2多肽合成

[0050] 采用经典的固相合成法合成多肽。以羧基树脂为固相载体，以二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）和二氯甲烷（dimethylformamide，DCM）为洗脱溶剂，以六氢吡啶（piperidine）为脱保护试剂。首先取适量树脂粉末，用DMG溶胀30min，然后用DMF清洗数次后抽干，此时树脂准备完毕，可开始偶联氨基酸。合成步骤如下：（1）脱保护：用DMF配制新鲜的20%的六氢吡啶溶液，取2-3mL上述溶液润洗树脂，抽干后再加入5mL上述溶液，放入摇床高速摇转20min；（2）清洗：抽去废液，依次用DMF，DCM和DMF分别彻底冲洗树脂3-5遍（；3）偶联：用DMF配置新鲜的脲正离子型缩合剂（HATU），取1.6mL加入称量好的氨基酸中（0.1mol），再加入0.4mL N，N-二异丙基乙胺（DIEA），混匀后与树脂混合，置于摇床高速摇转25min；（4）清洗：抽去废液，依次用DMF，DCM和DMF分别彻底冲洗树脂3-5遍。如此反复上述步骤，每个循环结束后，树脂上都会耦合上一个氨基酸残基。直到所有氨基酸残基都耦合完成后，即可将样品真空干燥以备后用。

[0051] 1.3多肽的分离及纯化

[0052] 上述干燥后的样品为连在树脂上的多肽，需将合成的多肽从树脂上分离才可得到完整可用的多肽。分离步骤如下：（1）用三氟乙酸（TFA）润洗干燥的合成管并放入连有多肽产物的树脂（；2）用乙二硫醇（EDT）、苯甲硫醚、苯甲醚和TFA分别以0.3:0.5:0.2:9的比例配置新鲜的切离混合液（1mL混合液可切离50-60mg产物），与多肽产物混合，在摇床上摇转1-2个小时；（3）将反应后液体转移至洁净容器中，加入无水乙醚并静置，直到多肽全部析出并沉淀；弃掉上清，用无水乙醚重悬多肽沉淀，并以7000r的速度离心10min，重复三次（；4）将离心所得沉淀真空干燥即可获得纯化后的多肽。

[0053] 实施例2.多肽的分子量及纯度

[0054] 2.1材料及仪器

[0055] 所需的化学试剂均来源于化学试剂供应商，使用前未纯化。仪器设备有质谱仪（型号：Autoflex MALDI-TOF，厂家：德国Bruker公司），分析型高压液相色谱（型号：Waters2695，厂家：Waters公司）。所用试剂乙腈（acetonitrile）、甲酸（Formic acid）均为HPLC级别，实验用水为MilliQ处理后的三蒸水。

[0056] 2.2多肽的分子量测定。(1)样品制备：取切离后的干燥样品，用含0.1%甲酸的乙腈和含0.1%甲酸的纯水以1:1的比例溶解；(2)点靶：取溶解后样品1μL点于样靶上，待液体挥发干后，取1μL CCA基质点于相同靶点与样品混匀，待自然干燥后置仪器中测定，测定的结果见表1。

[0057] 2.3多肽的纯度的测定。（1）样品准备：秤取适量样品，用含0.1%甲酸的乙腈和含0.1%甲酸的纯水以1:1的比例溶解，并过滤；（2）系统准备：在并不接柱子的情况下，分别用
100%的纯水和ACN清洗系统；只将柱子的入口端与仪器连接，出口端竖直向上放置，用100%ACN冲洗系统并将流速从0.1缓慢上调至1mL/min；待柱子出口端有液滴均匀流出后，将出口端接入系统；缓慢调整流动相比例至洗脱梯度的起始比例（95%水和5%ACN），维持30min左右，至检测器中的基线平稳为止；（3）进样测定：分别取100μL样品溶液和50%ACN溶液（含
0.1%甲酸）加入样品瓶中，将样品瓶置于样品盘中并记录下位置，即可进样。一般在测量样品前会先进行一次空样（纯溶剂）测定作为对照。

[0058] 测定结果见表1。

[0059] 表1合成多肽的分子量及纯度

[0060]

[0061] 实施例3多肽活性测定

[0062] 3.1实验材料

[0063] 3.1.1细胞株与毒株

[0064] TZMBL细胞：由HeLa细胞衍生而来，为贴壁细胞。可以高水平表达CD4、CCR5、CXCR4受体，并包含可经Tat诱导表达的β-半乳糖苷酶基因。可被各种HIV、SIV、SHIV毒株或分子克隆得到的重组假病毒毒株感染，反映病毒在细胞内进行一个周期复制的情况。该细胞由病毒药理室提供。

[0065] HIV-1重组假病毒：用于HIV-1 细胞内药效检测，为本实验室制备并保存。假病毒包装质粒包括HIV骨架质粒pSG3和△EEnnvv质粒 ,由中国疾病预防控制中心病毒病所提供。

[0066] 3.1.2实验仪器

[0067] 微量移液器（德国eppendorf公司）；超净工作台（LABCONCO purifier vertical clean beach）；倒置显微镜（重庆光学仪器厂，型号XD S-1B）；倒置荧光显微镜（Olympus公司，型号CK40）；CO2培养箱（REVCO公司，型号RC03000T-5-VBC）；酶标仪（Bio-Rad公司，型号550）台式低温离心机（德国eppendorf公司）；高速冷冻离心机（美国Thermo Scientific科技公司）；精密电子天平（丹佛仪器（北京）有限公司）；-20℃低温冰箱（日本SANYO公司）；恒温水浴锅（北京博医康实验仪器公司，型号HX-1050）。

[0068] 3.1.3实验试剂

[0069] 细胞培养用液：（1）DMEM基础培养基：DMEM粉（购自Invitrogen公司），每个小包装（1L量）加入900mL ddH2O，NaHCO32g，用ddH2O定容至1000mL，磁棒搅拌混匀。混匀、过滤除菌，4℃分装保存备用。（2）TZMBL细胞培养用DMEM培养基：上述DMEM基础培养基，加入10%胎牛血清、1%青链霉素、1%谷氨酰胺、200mML-谷氨酰胺，4℃保存使用。（3）1×PBS缓冲液（1L）：
NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.42g，KH2PO40.27g，定容1L，121℃高压20分钟。（4）0.02%EDTA溶液（1L）：1×PBS1L中加入EDTA0.2g，121℃高压20分钟。

[0070] 细胞毒实验所需检测试剂（：1）CCK8：含有WST-8，在电子载体作用下可被还原成甲瓒物，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。（2）1×PBS缓冲液（1L）：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.42g，KH2PO40.27g，定容到1L，121℃高压20分钟。

[0071] 病毒感染产生蓝斑的检测用液：（1）固定液配制：1%甲醛，0.2%戊二醛，溶于PBS，混匀。（2）染色液配制：2%0.2M亚铁氰化钾，2%0.2M铁氰化钾，0.1%2.0M氯化镁，1%40mg/mL X-gal，溶于PBS，混匀。

[0072] 3.2实验方法

[0073] 3.2.1细胞培养

[0074] TZMBL细胞的培养条件为含10%进口胎牛血清、1%青链霉素、1%谷氨酰胺的DMEM培2
养基；用25或75cm细胞培养瓶水平放置培养。细胞平均每2-3天换一次培养液，当长至80%-
90%汇合度时使用0.25%的胰蛋白酶溶液进行消化传代培养。利用倒置显微镜逐日观察细胞生长情况。

[0075] 3.2.2细胞毒性检测实验

[0076] 细胞毒性实验采用CCK-8检测法，CCK-8试剂中含有WST-8[其化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]。它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的色甲瓒染料（Formazandye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。可以通过CCK8确定多肽对TZMBL细胞的最大无毒剂量和半数毒性浓度（TC50）。

[0077] （1）在96孔培养板中每孔加入15000的TZMBL细胞，待24h长成单层。

[0078] （2）弃培养基，每孔加入100mL含不同浓度药物的无血清DMEM培养基，置于5％CO2、37℃培养箱培养1h后，每孔补加含10%胎牛血清的DMEM培养基

[0079] （3）培养48h后，每孔加入10μL CCK8，2h后在用酶标仪测在450nm下的OD值。根据公式得出药物对细胞的抑制率，进而得到药物最大无毒剂量和TCID50。

[0080] 计算公式：

[0081]

[0082] 式（1）中，A：细胞的OD值，B：加入药物后的OD值。将细胞毒性（抑制率）接近5%时药物的剂量作为最大无毒剂量。

[0083] 3.2.3MAGI测定多肽的活性

[0084] MAGI实验方法中反映病毒在细胞中一个周期的复制情况。所用细胞系由HeLa细胞系衍生，高表达CD4分子，含有一个β-gal（β半乳糖苷酶）基因，该基因由HIV-1长末端重复序列（LTR）调控，用于定量测定实验室源HIV病毒株的感染力，计算样本对病毒的抑制率。

[0085] (1)96孔细胞培养板接种TZMBL细胞，6000～8000cells/孔，37℃、5%CO2培养24h，细胞约50%成层。

[0086] (2)样品处理：药液用高糖DMEM稀释至合适浓度。

[0087] (3)病毒稀释：配制20μg/mL DEAE的DMEM（取100μL2mg/mL DEAE加入到9.9mL DMEM培养基中）；液氮罐内取出病毒，用含20μg/mL DEAE的DMEM稀释（1mL病毒溶液加入21.6mL含20μg/mL DEAE的DMEM培养基中，混匀）。

[0088] (4)加样：取出96孔细胞培养板，轻轻弃去培养基，快速加入100μL/孔待测样品（每个浓度待测样品设4个复孔），然后加入100μL病毒稀释液。同时设立病毒对照组（只加入DMEM培养基和病毒稀释液，100μL/孔）和细胞对照组（只加入DMEM和含20μg/mL DEAE的DMEM培养基，100μL/孔）。37℃，5%CO2培养48h。

[0089] (5)固定染色，显微镜计数蓝斑。

[0090] 按照式2计算多肽的抑制活性。

[0091]

[0092] 式中：R：多肽样品对艾滋病病毒的抑制率（%）；A：药物组蓝斑数；B：细胞对照组蓝斑数；C：病毒对照组蓝斑数。

[0093] IC50的定义为在一定条件下抑制艾滋病病毒一半时所需要的抑制剂浓度。由于抑制率与制剂浓度之间不是一个线性的关系，因此需要按照以下方法获得IC50值：

[0094] (1)以log[样品]对log(R/(1-R))作图（应为一直线），得到方程Y=aX+b，Y为log(R/(1-R))。

[0095] (2)计算Y=0时X的值，X取反对数即得IC50。

[0096] 3.3实验结果

[0097] 分别取2085、521、130、32、8nM剂量的CT105与假病毒混合培养，并设立病毒对照组（VC，只加病毒不加样本）和细胞对照组（CC，不加病毒和样品）。根据在光学显微镜下的蓝斑计数结果，计算出多肽融合抑制剂的抑制效率（图3）,在此基础上根据[0079]、[0080]和[0081]所述获得IC50值。结果表明，CT105具有有效的抗病毒活性，且抑制率随剂量的增加而增加。CT105在521nM剂量时的病毒抑制率可达到95.52%，其IC50值为50.67nM。

[0098] 采用同样的方法取2085、521、130、32、8nM剂量的CT106及CT107与假病毒混合培养，设立病毒对照组和细胞对照组。在光学显微镜下读取病毒蓝斑的数量，计算出多肽融合抑制剂的抑制效率（图4、5）、在此基础上获得IC50值。结果表明，CT106和CT107具有有效的抗病毒活性，且抑制率随剂量的增加而增加。CT106在521nM剂量时的病毒抑制率可达到94.26%，其IC50值为53.25nM；CT107的IC50值为179.93nM。

[0099] 实施例4多肽与HIV的结合部位

[0100] 4.1材料及仪器

[0101] (1)菌株与质粒

[0102] 宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）、DH5α和质粒pUC19购自天根生化科技（北京）有限公司，菌株BL21-RT（HIV-1逆转录酶重组蛋白表达菌株）和质粒pHIV（含有HIV-1HXB2CG株全基因序列）由本实验室保存，克隆载体 18-T购自宝生物工程（大连）有限公司，表达载体pET-28a（+）购自Merck公司。

[0103] (2)工具酶与试剂

[0104] Taq酶、dNTP购自天根生化科技（北京）有限公司，T4DNA连接酶与限制性核酸内切酶Nde I、BamH I、Nhe I、Xho I等均购自美国New England Biolabs公司。AxyPrep质粒小量制备试剂盒与AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒均购自爱思进生物技术（杭州）有限公司，DNA分子量标准购自天根生化科技（北京）有限公司和加拿大Bio Basic公司，胰蛋白胨、酵母提取物购自美国Thermo Fisher Scientific公司，琼脂粉购自北京索莱宝科技有限公司，氯化钠、Na2EDTA、Tris、硫酸卡那霉素、溴酚蓝、EB、二甲苯青FF购自美国Amresco公司，甘油、氨苄青霉素购自德国Merck公司，琼脂糖购自上海YITO公司，异丙醇、醋酸购自北京化工厂。

[0105] (3)PCR引物

[0106] 实验中需要用到的PCR引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。所需的化学试剂均来源于化学试剂供应商，使用前未纯化。

[0107] (4)主要仪器设备

[0108] Adventurer电子天平（美国OHAUS公司），DL-CJ-1N超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）， 基因扩增仪（美国Bio-Rad Laboratories公司），DYY-7C型电泳仪电源与DYCP-31D型水平电泳槽（北京市六一仪器厂），UV-IV紫外透射反射分析仪（北京宾达英创科技有限公司），Gel DocTM XR凝胶成像系统（美国Bio-Rad Laboratories公司），UV-2100紫外可见分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司），Spectrafuge16M台式离心机（美国Labnet International公司），ED-19恒温水浴（德国JULABO Labortechnik公司），Minitron恒温摇床（瑞士Infors公司），KD23B-DE微波炉（美的日用家电集团），DHP-9052电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），MLS-3750全自动高压蒸汽灭菌器（日本SANYO Electric公司），AF100制冰机（意大利Scotsman公司），WaterPro PS超纯水系统（美国Labconco公司），MDF-U32V超低温冰箱（日本SANYO Electric公司），Eppendorf Research系列手动单道移液器（德国Eppendorf公司），accu-jet pro电动移液器（德国BRAND公司）。

[0109] 4.2实验方法

[0110] 4.2.1HIV-1gp415-helix和6-helix基因的获得

[0111] 由于HIV-1gp415-helix和HIV-1gp416-helix基因由NHR衍生多肽基因序列与CHR衍生多肽基因序列交错相连而成，内部重复性很高，很难通过PCR和重叠延伸剪接术（splicing by overlap extension,SOE）获得全长基因序列。为了解决这一问题，本发明将若干不同的酶切位点引入连接子序列，并以“SOE-酶切-连接”为路线逐段搭建得到全长目的基因。首先，以含有HIV-1HXB2CG株全基因序列的pHIV质粒为模板，逐段扩增出单片段序列。然后，以单片段序列为模板，用SOE法扩增出双片段序列。最后对两端均含有酶切位点的单片段序列或双片段序列进行酶切，按顺序连接得到HIV-1gp415-helix和HIV-1gp416-helix全长基因。这种构建策略的优势在于：便于对gp41NHR衍生多肽与CHR衍生多肽进行排列组合，便于在某段多肽上引入特定突变位点。为了方便Nhe I酶切位点的引入，本研究将第二段LC-N的（GSSGG）变为ASSGG，为区别二者，GSSGG记为LC-N1，ASSGG记为LC-N2。引入的酶切位点在HIV-1gp415-helix和6-helix两段基因上的位置分别为：

[0112] 5-helix：

[0113] (Nde I)-N40-LN-C-C38-(BamHI)-LC-N1-N40-LN-C-C38-(Nhe I)-LC-N2-N40-(Xho I)

[0114] 6-helix：

[0115] (Nde I)-N40-LN-C-C38-(BamH I)-LC-N1-N40-LN-C-C38-(Nhe I)-LC-N2-N40-LN-C

[0116] -C38-(Xho I)

[0117] 4.2.2HIV-1gp415-helix和6-helix重组表达载体的构建

[0118] 利用表达载体pET-28a（+）上的多克隆位点将目的基因克隆入表达载体。经Nde I/Xho I双酶切并回收的gp415-helix和gp416-helix基因片段分别与经同样双酶切回收得到的表达载体pET-28a（+）进行连接，以得到重组表达载体。

[0119] 将连接体系转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，用含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基筛选培养。挑取阳性克隆，用碱裂解法提取质粒DNA进行NdeI/Xho I双酶切鉴定，对含有目的基因片段的克隆进行DNA序列测定。

[0120] 4.3结果

[0121] 4.3.1HIV-1gp415-helix和6-helix重组表达载体的鉴定

[0122] 以含有HIV-1HXB2CG株全基因序列的pHIV质粒为模板，逐段扩增出单片段序列。以单片段序列为模板，用SOE法扩增出双片段序列。最后对两端均含有酶切位点的单片段序列或双片段序列进行酶切，按顺序连接得到HIV-1gp415-helix和HIV-1gp416-helix目的基因。经Nde I/Xho I双酶切并回收的gp415-helix和gp416-helix基因片段分别与经同样双酶切回收得到的表达载体pET-28a（+）进行连接，得到重组表达载体p5-helix和p6-helix。

[0123] 用Nde I/Xho I双酶切鉴定HIV-1gp415-helix和HIV-1gp416-helix重组表达载体p5-helix和p6-helix，经琼脂糖凝胶电泳分析，可切出长度分别约为654bp，783bp的片段，与预期值吻合。

[0124] 进一步对重组表达载体p5-helix和p6-helix进行DNA序列测定，使用Clustal X软件将测序结果与HIV-1gp415-helix和6-helix基因序列进行比对，结果表明重组表达载体p5-helix和p6-helix插入的目的基因序列完全正确。

[0125] 4.3.2多肽CT105与HIV的结合部位

[0126] 以上海强耀生物科技有限公司合成的C34（命名为C34标）作为基准对照，分别将多肽CT105和C34标与HIV-1gp415-helix和6-helix等体积混合，37℃孵育1h，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（图1）。从图1可以看出，C34标及多肽的存在均改变了5-helix条带的位置，而6-helix条带的位置则不受影响，对照蛋白BSA条带的位置同样不受它们存在的影响，表明5-helix与C34标及多肽CT105存在特异性相互作用，而与6-helix则与C34标及多肽CT105没有相互作用。

[0127] 向5-helix与C34标、5-helix与CT105反应体系中加入梯度浓度的表面活性剂SDS，SDS浓度梯度为0、100、200、400μM。用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SDS对5-helix与C34标或CT105相互作用的影响。从图2可以看出，随着SDS浓度的增加，5-helix与C34标或CT105形成的复合物条带逐渐减弱，而C34标或CT105的条带逐渐增强，这表明二者的相互作用受到SDS的抑制，多肽CT105可与5-helix特异性结合。CT105对gp41的抑制机理为与gp41NHR结合从而阻碍gp41形成三聚体，阻断病毒进入宿主细胞。