一种抗菌重组多肽及其表达载体

摘要

一种抗菌重组多肽及其表达载体，解决了现有的通过人工合成蛋白肽的方法合成的Lactoferampin（Lfcin）和Lactoferampin（Lfampin）的一种嵌合结构肽链（N-FKCRRWQWRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKWILD-N）存在的生产工艺繁琐，成本昂贵，产量低，不适合规模化生产问题。该抗菌重组多肽的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。本发明具有抑菌效果强，生产工艺简单，成本低，产量高，适合规模化生产的优点。

权利要求

1.一种抗菌重组多肽，其特征在于，该抗菌重组多肽的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的一种抗菌重组多肽，其特征在于，所述抗菌重组多肽的表达量为5mg/ml～12mg/ml。

3.如权利要求1所述的一种抗菌重组多肽的基因表达载体，其特征在于，该基因表达载体通过以下方法得到：合成抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc基因，该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，将该基因与pGEM-T Easy Vector连接，转化入大肠杆菌C600感受态细胞，筛选阳性克隆测序，将序列正确的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc基因与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K通过T4DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌C600感受态细胞，筛选阳性克隆，经酶切筛选出正确连接的重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc。

4.根据权利要求3所述的基因表达载体，其特征在于，所述重组质粒

pPIC9K-Lfa-NA-Lfc经过线性化后，转化到巴斯德毕赤酵母菌中表达。

5.根据权利要求3所述的基因表达载体，其特征在于，所述巴斯德毕赤酵母为毕赤酵母宿主菌GS115。

说明书

一种抗菌重组多肽及其表达载体

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种抗菌重组多肽及其表达载体。

背景技术

[0002] 1928年，英国细菌学家弗莱明发现了青霉素，从此拉开了人类使用抗生素的序幕。抗生素自使用以来，虽然挽救了无数生命，但是抗生素具有一定的毒副作用，长期不规范使用很容易使菌、毒株产生抗药性，同时使机体免疫功能受到抑制。世界卫生组织建议，抗生素在医院内使用率不得超过30%，而中国却高达74%。

[0003] 近年来，抗生素不仅在疾病防治中大量使用，在食品、卫生保健品和动物饲料等方面也被无限制使用，致使抗生素的使用效果逐年下降，一些抗药的超级病菌、抗药病毒不断涌现，给疾病防治带来极大困难，严重损害了人以及动物的健康。目前，亚洲和欧洲都成为了耐药性菌的高发地区，而在我国三级医院中，耐药性细菌发生率在30%～40%，甚至达到50%。从世界卫生组织了解到，在中国，诊断为结核病的病例当中，有6.8%为耐药性结核，远远高于大多数发达国家2%的比例。据统计资料显示，我国每年有8万人死于过度使用抗生素，7岁以下儿童因不合理使用抗生素造成耳聋的数量高达30万人。

[0004] 在动物疾病防治方面，仅以奶牛乳房炎为例，我国奶牛乳房炎呈阳性率为46.4%～85.7%，发病率为20%～70%，抗生素一直是治疗奶牛乳房炎的重要手段，自从1945年试用青霉素治疗奶牛乳房炎以来，因其疗效显著而使抗生素治疗奶牛乳房炎得到了不断的发展，但是，长期大量使用抗生素不仅导致耐药性细菌的产生、治疗效果降低，同时还使奶牛免疫功能受到抑制，容易造成重复感染，更严重的是，耐药性细菌还可以通过乳汁传染给人，牛奶中残留的抗生素也会诱发人体产生超敏反应。人类正面临失去这些宝贵药物的危险，而失去这些药物的速度已经超过替代药物的开发速度，世界将进入所谓的后抗生素时 代。在合理使用抗生素的同时，研制安全、高效、不易产生抗药性的新型药物替代和辅助传统抗生素成为新一代药物研究的必然要求。

[0005] 如图1所示，乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是一种铁结合性糖蛋白，主要存在于哺乳动物的各种外分泌物中，以乳汁特别是初乳中含量最高，具有广谱的抗菌功能，抗菌机理有别于抗生素，不易产生抗药性，应用前景及市场潜力广阔，越来越受到国内、外科研工作者的关注，但是乳铁蛋白不能单独作为抗菌药物使用，如何增强其抗菌活性成为目前研究的热点。

[0006] 如图2所示，Bolscher等通过人工合成蛋白肽的方法合成了Lactoferampin（Lfcin）和Lactoferampin（Lfampin）的一种嵌合结构肽链（N-FKCRRWQWRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKWILD-N），测得该种肽抗菌活性显著高于Lactoferampin和Lactoferampin及两者混合物。合成方法是：采用Milli-Gen9050肽链合成仪，从赖氨酸（Lys）开始先合成LFcin17～30肽链，到N端的苯丙氨酸（Phe）结束，再通过肼解作用将C末端赖氨酸（Lys）上的保护基团（ivDde）释放，继续合成LFampin265～284肽链，通过这个方法合成的肽链含有一个C末端赖氨酸氨基化合物，两个含N末端的肽链在C末端两侧，采用RP-HPLC进行纯化，收集到的肽采用离子肼质谱（LCQ Deca XP）进行分析检验。

[0007] 现有技术的缺点是：生产工艺繁琐，成本昂贵，产量低，不适合规模化生产。

发明内容

[0008] 为了解决现有的通过人工合成蛋白肽的方法合成的Lactoferampin（Lfcin）和Lactoferampin（Lfampin）的一种嵌合结构肽链

[0009] （N-FKCRRWQWRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKWILD-N）存在的生产工艺繁琐，成本昂贵，产量低，不适合规模化生产问题，本发明提供一种抗菌重组多肽及其表达载体。

[0010] 本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

[0011] 本发明提供的一种抗菌重组多肽，该抗菌重组多肽的基因核苷酸序列如序 列表中的SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

[0012] 本发明还提供上述的抗菌重组多肽的基因表达载体，该基因表达载体通过以下方法得到：合成抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc基因，将该基因与pGEM-T Easy Vector连接，转化入大肠杆菌C600感受态细胞，筛选阳性克隆测序，将序列正确的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc基因与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K通过T4DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌C600感受态细胞，筛选阳性克隆，经酶切筛选出正确连接的重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc，所述重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc经过线性化后，转化到巴斯德毕赤酵母菌中表达，所述巴斯德毕赤酵母为毕赤酵母宿主菌GS115，表达产物在培养物上清中，利用盐培养基，通过发酵罐培养可以获得较高产量，经检测，本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的表达量为5mg/mL～12mg/mL。

[0013] 本发明的有益效果是：

[0014] 1、乳铁蛋白分子中的两个抗菌活性部分Lactoferampin（Lfcin）和Lactoferampin（Lfampin）均位于分子的相似区域N端，本发明根据Lfcin和Lfampin两个肽段在乳铁蛋白中的二级结构和空间排列状态，利用生物软件，设计出抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的氨基酸序列，并且合成了该抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的基因序列，同时，通过真核表达系统制备出一种具有稳定性好、抗菌作用广谱的新型抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc。由于乳铁蛋白抗菌机理的特殊性，使得该抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc具有不易产生抗药性的优点，为新型抗菌药物的研制打下坚实基础。

[0015] 2、通过抗菌活性试验发现，本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、坏死梭杆菌等细菌均具有较强的抗菌活性，与硫酸庆大霉素抗菌活性相当，表明本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc抗菌谱广泛，有希望替代抗生素使用。

[0016] 3、通过金属离子影响活性试验发现，本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的活性不受金属离子即钠、钾、钙、铁、镁离子的影响；通过酸碱度影响活性试验发现，本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对酸碱不敏感，即在pH2～11 范围内其抗菌活性不受影响；通过温度影响活性试验发现，本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对温度不敏感，即在-80℃～120℃范围内其抗菌活性无变化。通过上述实验得知，本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc抗菌活性比较稳定。

[0017] 4、利用盐培养基，通过发酵罐培养就可以获得较高产量，大大降低了研制成本。经检测，本发明抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的表达量为5mg/ml～12mg/mL，并且表达产物在培养物上清液中。该方法不仅成本低廉，而且生产工艺简单，适合规模化生产，有利于工业规模的分离和下游加工。因此，可以推断，这种廉价、简便、高效的制备方法为抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的产业化生产提供了条件。

[0018] 5、本发明中，将第36位和第75位氨基设计为半胱氨酸，便于形成二硫键，同时在LfampinB和LfcinB两个肽链之间加入一定长度的寡肽-NA，有利于肽段的折叠。

[0019] 6、本发明中所设计的基因也可以克隆到其他表达系统中表达生产，也可以利用蛋白质合成方法制备本发明中所设计的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc。

附图说明

[0020] 图1为乳铁蛋白（lactoferrin，LF）的结构示意图及Lactoferampin（Lfcin）和Lactoferampin（Lfampin）位置分布示意图。

[0021] 图2中，图2A为Lactoferampin（Lfcin）和Lactoferampin（Lfampin）在乳铁蛋白（lactoferrin，LF）中的位置分布示意图，图2B为Lactoferampin（Lfcin）和Lactoferampin（Lfampin）的一种嵌合结构肽链

[0022] （N-FKCRRWQWRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKWILD-N）的结构示意图。

[0023] 图3为本发明的抗菌重组多肽的表达载体结构示意图。

[0024] 图4为本发明中重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc的酶切鉴定结果图；

[0025] 图中：M为DNAMarkerDL2000，1为重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc EcoR Ⅴ酶切。

[0026] 图5为本发明中酵母转化子的PCR鉴定结果图；

[0027] 图中：M为100bp DNA Ladder，1为空载体pPIC9K PCR产物，2为酵母转化子PCR产物。

[0028] 图6为本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对大肠杆菌抑菌检测效果图。

[0029] 图7为本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对鼠伤寒沙门氏杆菌抑菌检测效果图。

[0030] 图8为本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对金黄色葡萄球菌抑菌检测效果图。

[0031] 图9为本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对绿脓杆菌抑菌检测效果图。

[0032] 图10为本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对无乳链球菌抑菌检测效果图。

[0033] 图6至图10中：A为50ug/ml的硫酸庆大霉素，B为不同浓度的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc（其中1x和原倍是指50ug/ml浓度，其他数字是指50ug/ml浓度的倍数）。

[0034] 图11为不同金属离子（Ca2+，Fe2+，Na+，Mg2+，K+）对本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc活性影响抑菌检测效果图；

[0035] 图中：A为50ug/ml的硫酸庆大霉素，B为50ug/ml的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc，C为不同金属离子作用后的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc（C高离子浓度为50mmol/L，C中离子浓度为10mmol/L，C低离子浓度为1mmol/L）。

[0036] 图12为酸碱度对本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc活性影响抑菌检测效果图；

[0037] 图中：A为50ug/ml的硫酸庆大霉素，B为50ug/ml的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc，C2～C11分别指pH2～11对应的样品。

[0038] 图13为温度对本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc活性影响抑菌检测效果图；

[0039] 图中：A为50ug/ml的硫酸庆大霉素，B为50ug/ml的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc，其中B1～B5分别指经过-80℃、-20℃、25℃、100℃、120℃处理后的样品。

具体实施方式

[0040] 一、抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的设计与表达载体构建

[0041] （一）材料

[0042] pGEM-T Easy Vector（Promega公司）；分泌型表达载体pPIC9K和毕赤酵母宿主菌GS115（Invitrogen公司）；大肠杆菌（上海北诺生物科技有限公司）；绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和坏死梭杆菌（国家兽医微生物菌种保藏中心）；TaKaRaLA Taq DNA聚合酶、dNTP Mixtures、DNA Ladder Marker（15000）、DNA Ladder Marker（2000）、蛋白质分子量标准（低）、蛋白质分子量标准、琼脂粉、甘氨酸（宝生物工程有限公司）；限制性内切酶（HindⅢ、SnaBⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、SalI、DraⅠ）、T4DNA Ligase、KlenowFragment、小鼠牛小肠碱性磷酸酶（MBI Fermentas公司）；D-山梨醇和L-谷氨酸（Amresco）；D-生物素、L-亮氨酸、L-赖氨酸和L-蛋氨酸（上海生工生物工程公司）；氨基糖苷类抗生素G418（GIBCO公司）；酵母氮源碱（Difco公司）；Tris饱和酚和Biospin胶回收试剂盒（杭州博日公司）；BCA试剂盒（上海生工生物工程公司）；酵母提取物和胰化蛋白胨（英国OXOID）；氨苄青霉素和硫酸庆大霉素（华北制药）；NaCl、氯仿、甲醇和无水乙醇（北京化工厂）；LiCl（国药集团化学试剂有限公司）；羧苄青霉素（美国INALCO公司）；SDS（电泳级）、Pepsin1（胃蛋白酶1：10000）、PEG3350（W/V）、L-异亮氨酸和Salmon spermDNA（Sigma公司）；其他常规试剂均为进口或国产分析纯。

[0043] （二）主要仪器

[0044] PTC-100型PCR仪（MJResearch公司）；W-9403C型紫外透射仪（北京六一仪器厂）；79-B-60型电热恒温培养箱（吉林省农安县柴岗医疗器械厂）Centifuge5415R型低温冷冻离心机（EPPENDORF公司）；DYY-10C型电泳系统（北京六一仪器厂）；ALPHA2-4LP Plus型冷冻干燥机（CHRIST公司）；AKTA Purifier10蛋白纯化系统（美国GE Healthcare公司）。

[0045] （三）技术实施方案

[0046] 如图3所示，本发明利用巴斯德毕赤酵母中分泌型表达载体pPIC9K的SnaBI多克隆位点，将合成的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc基因插入到分泌型表达载体pPIC9K中，转化入毕赤酵母宿主菌GS115，筛选到G418高抗性的甲醇利用型Mut+转化子。

[0047] 以合成的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc基因序列为模板，以P1、P2为上、下游引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定后，与pGEM-T Easy Vector连接，转化入大肠杆菌C600感受态细胞，筛选阳性克隆测序；用限制性内切酶EcoRⅠ酶切重组质粒TE-Lfa-NA-Lfc，回收Lfa-NA-Lfc片段，用Klenow Fragment酶补平；巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K用限制性内切酶SnaBⅠ酶切回收，2种回收产物经T4DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌C600感受态细胞；提取重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc，通过限制性内切酶EcoRⅤ酶切鉴定出正向连接克隆质粒，用P2、P3引物对其进行PCR扩增，PCR扩增产物送交生物公司测序；将重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc用限制性内切酶SalI酶切后回收，立即转化入制备的毕赤酵母感受态细胞，筛选His+转化子；将筛选到的His+转化子培养物均匀涂布于含不同浓度G418的YPD平板培养至单菌落出现，挑取含高浓度G418培养板中生长出的单菌落分别接种在MM平板和MD平板上，30℃培养观察，筛选Mut+表型转化子；提取Mut+表型转化子的DNA，以P3、P2作为上、下游引物，同时以转化有pPIC9K载体的酵母DNA作为阴性对照，进行PCR扩增鉴定，实现组合的Mut+表型转化子。

[0048] 1、抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的设计

[0049] 本发明根据美国国家生物技术信息中心（GenBank）中已报道的乳铁蛋白基因（登录号NM180998）序列，利用生物软件设计出本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc，为使LfampinB和LfcinB两个肽链能正确折叠并呈现出原有的结构特性，对这两个肽链中的个别氨基酸进行了替换，并将第36位和75位氨基设计为半胱氨酸，便于形成二硫键，同时在LfampinB和LfcinB两个肽链之间加入一定长度的寡肽-NA，有利于肽段的折叠。

[0050] 抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的氨基酸序列为：

[0051] EAEAYNSHLEGVSFFDLIWKLKSKAQEKFGKNKSRCFFKRRWQWRMKKLGAPSITVRRAFFKRRWQWRMKKLGACFFVSLADG

[0052] 具体如下：

[0053] Glu Ala Glu Ala Tyr Asn Ser His Leu Glu Gly Val Ser Phe Phe Asp Leu Ile Trp Lys Leu Lys Ser Lys Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asn Lys Ser Arg Cys Phe Phe Lys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Lle Thr Val Arg Arg Ala Phe Phe Lys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Cys Phe Phe Val Ser Leu Ala Asp Gly(SEQ ID NO:2)

[0054] 依据巴斯德毕赤酵母密码子编码的偏好性，合成了本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的基因核苷酸序列：

[0055] GAGGCTGAAGCTTACAATTCCCACTTAGAAGGCGTAAGCTTCTTCGACTTGATCTGGAAACTTAAGAGCAAGGCGCAGGAGAAATTTGGAAAAAACAAGTCTCGGTGCTTCTTTAAACGCCGATGGCAGTGGAGGATGAAGAAGCTGGGTGCTCCCTCTATCACCGTGAGGAGGGCCTTTTTCAAACGCCGATGGCAGTGGAGGATGAAGAAGCTGGGTGCTTGCTTCTTTGTAAGCTTAGCTGATGGT(SEQ ID NO:1)

[0056] 由上海捷瑞生物工程有限公司合成，同时合成其上、下游引物，引物中含有限制性内切酶EcoRⅠ酶切位点；

[0057] 上游引物P1：5'-GTACGAATTCCACTTAGA-3'；

[0058] 下游引物P2：5'-GCTTGGAATTCCACGTGA-3'；

[0059] 同时设计重组PCR鉴定引物：

[0060] 上游引物P3：5'-TTGCCAGCATTGCTGCTA-3'：

[0061] 下游引物P2：5'-GCTTGGAATTCCACGTGA-3'。

[0062] 2、抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc基因表达载体的构建

[0063] 实施例1：重组质粒pGE-Lfa-NA-Lfc的获得

[0064] 由上海捷瑞生物工程有限公司合成本发明所设计的抗菌肽基因，并克隆于pGE载体，将含有pGE-Lfa-NA-Lfc质粒的菌株接种含有50μg/mLAmp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；按照SDS碱裂解法提取重组质粒pGE-Lfa-NA-Lfc，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

[0065] 实施例2：抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc基因与分泌型表达载体pPIC9K的连接及转化

[0066] 以pGE-Lfa-NA-Lfc质粒为模板，以P1和P2为上、下游引物，进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5min，之后94℃变性1min，40℃退火50s，72℃延伸30s，29个循环，最后72℃延伸1min；PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定后，与pGEM-T Easy Vector连接，转化入大肠杆菌C600感受态细胞；用限制性内切酶EcoRⅠ酶切重组质粒TE-Lfa-NA-Lfc，回收Lfa-NA-Lfc基因片段，补平；巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K用限制性内切酶SnaBⅠ酶切回收。两种回收产物通过T4DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌C600感受态细胞，涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃下培养过夜；提取重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc，用限制性内切酶EcoRⅤ对重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc进行酶切筛选，结果如图4所示。以P3和P2为扩增引物，对正向连接的重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc进行PCR扩增，PCR扩增产物送交北京Invitrogen公司进行测序，经序列分析，连接点和序列均正确的质粒命名为：pPIC9K-Lfa-NA-Lfc。

[0067] 实施例3：重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc的线性化

[0068] 用限制性内切酶SalI对重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc进行酶切，回收线性化重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc，并采用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定估测重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc的浓度。

[0069] 实施例4：线性化重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc转化入巴斯德毕赤酵母

[0070] 利用LiCl方法，将线性化的重组质粒立即转化入刚制备的毕赤酵母宿主菌GS115感受态细胞，30℃水浴30min，42℃水浴热休克25min，8000rpm离心， 弃去上清液，重悬菌体中加入1mL灭菌去离子水，涂布于RDB平板，于28～30℃培养箱中倒置培养3～4d，筛选His+转化子。

[0071] 实施例5：筛选多插入子

[0072] （1）RDB平板上生长出的单菌为His+转化子，挑取所有菌落悬浮于少量灭菌水中，充分混匀后，划线接种于含有0.25mg/mL氨基糖苷类抗生素G418的YPD平板上，30℃倒置培养3～4d至长出单菌落。

[0073] （2）挑取含有0.25mg/mL氨基糖苷类抗生素G418YPD平板上的单菌落，划线接种于含0.5mg/mLG418YPD平板上，30℃倒置培养3～4d，至长出单菌落。依次类推，直至筛选到1.0mg/mLG418YPD平板上长出单菌落。

[0074] 实施例6：毕赤酵母转化子表型的筛选

[0075] （1）将含有1.0mg/mL氨基糖苷类抗生素G418YPD平板上的单菌落挑入少量灭菌水中混匀，分别划线接种到MM和MD平板上，30℃倒置培养2～3d，比较两个平板上的菌落大小；

[0076] （2）在MM和MD平板上均生长正常，且大小一致的菌落为Mut+表型转化子。

[0077] 实施例7：毕赤酵母转化子的PCR鉴定

[0078] （1）利用煮-冻-煮法制备毕赤酵母基因组DNA

[0079] 从MD平板上挑取Mut+表型的转化子，接种于20mLMGY液体培养基中振荡培养过夜，取1.5mL菌液3000g离心5min，弃上清液，沉淀中加入100μL PBS缓冲液悬浮沉淀，2000g离心3min，弃上清液，沉淀溶于100μL TE缓冲液，100℃水浴10min，-80℃30min，再次100℃水浴10min，3000g离心5min，取上清液，加入2倍体积的氯仿/异丙醇，室温10min后10000g离心，沉淀即毕赤酵母基因组DNA，用10μL灭菌去离子水溶解；

[0080] （2）以提取的为模板，P3、P2为引物进行PCR扩增和鉴定。

[0081] 扩增条件为：94℃预变性5min后，94℃变性1min，40℃退火50s，72℃延伸30s，29个循环，最后72℃延伸1min，PCR扩增结束后，1.2%琼脂糖凝胶电泳测定。

[0082] 如图5所示，扩增出约350bp大小的条带，含有空载体pPIC9K的酵母DNA无扩增条带，表明Mut+表型转化子DNA已经整合到酵母基因组中。

[0083] 二、抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的诱导表达与分离纯化

[0084] 将His+Mut+型转化子的单克隆接种于10mLMGY液体培养基中，28～30℃振荡培养至OD600≈3～5，4000g离心10min，重悬菌体于MM液体培养基中振荡培养；每隔24h补加甲醇溶液至终浓度为0.5～1.0%，连续诱导表达4d；收集上清液，BCA试剂盒测定菌体培养物上清液的总蛋白含量。

[0085] 表达上清液经蛋白纯化仪（AKTA Purifier100，GE）分离纯化目的蛋白，纯化参数为：层析柱用阳离子交换柱SP Sepherose XL，起始缓冲液为20～60mM pH4.0～4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，洗脱缓冲液为起始缓冲液与0.8～1M氯化钠的混合溶液，流速1mL/min，具体纯化步骤参见AKTA相关手册，收集流分并脱盐，浓缩10倍，15%SDS-PAGE电泳检测分子量大小，同时利用凝胶薄层扫描方法测定抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的表达量。

[0086] 通过大肠杆菌抑菌试验，检测从离子交换分离出的组分的抗菌活性，筛选到目的蛋白。浓缩10倍后，15%SDS-PAGE电泳检测抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc分子量大小为9.5KDa左右，与设计蛋白大小一致；凝胶薄层扫描显示，抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc表达量占培养物上清液的总蛋白量的29%；BCA试剂盒测定菌体培养物上清总蛋白量为1.8mg/mL～3.6mg/mL。将经MGY培养基培养出的种子接种到无机盐发酵培养基中，通过甲醇诱导在发酵罐中表达，上清总蛋白量可提高到18mg/mL～43mg/mL。

[0087] 三、抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的抗菌活性检测

[0088] （一）试剂及溶液的配制

[0089] 50μg/mL的硫酸庆大霉素溶液：8万单位（2mL）硫酸庆大霉素12.5μL溶于10mL灭菌去离子水中，-20℃保存备用；

[0090] 营养肉汤培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸出物5g，牛肉浸膏5g，氯化钠5g，去离子水定容至1000mL。若配制固体培养基，则再加入15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌30min，4℃保存备用。

[0091] 葡萄糖磷酸盐缓冲液：牛肉膏0.5g，磷酸氢二钠0.2g，NaCl0.3g，蛋白胨1g，葡萄糖0.1g，琼脂1g，加去离子水至80mL，调节pH为7.4，再加入去离子水定容至100mL。

[0092] （二）抗菌活性检测

[0093] 实施例8

[0094] 采用琼脂扩散法进行抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的抗菌活性检测。将大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌分别培养至对数生长期，每种菌按体积0.5%加入到经高压灭菌后冷却到约40℃左右1%琼脂营养肉汤培养基中，混匀倒入无菌培养皿，凝固后，用打孔器打出直径为5mm小孔，取40μL浓度为50μg/mL的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc加入到小孔中，同时用50μg/mL硫酸庆大霉素作为阳性对照，分别在37℃下培养6～12h。

[0095] 如图6至图10所示，通过比较抑菌环直径大小发现，抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对大肠杆菌的抗菌作用（23mm）与硫酸庆大霉素（24mm）相当；对鼠伤寒沙门氏菌（18mm）弱于硫酸庆大霉素（22mm）；对金黄色葡萄球菌的抗菌作用（25mm）强于硫酸庆大霉素（22mm）；对绿脓杆菌的抗菌作用（21mm）与硫酸庆大霉素相当（21mm）；对无乳链球菌的抗菌作用（22mm）与硫酸庆大霉素（23mm）相当。说明研制出的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc抗菌效果相当于硫酸庆大霉素，有希望替代抗生素使用。

[0096] 实施例9

[0097] 利用试管液体培养法对坏死梭杆菌进行抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的抗菌活性检测：将抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc加入到1mL坏死梭杆菌新鲜培养液中混匀，使其终浓度为50μg/mL，37℃厌氧培养过夜，同时将坏死梭杆菌用同样方法培养作为阳性对照，结果发现
1
接种混有抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的试管液体透明，活菌数为2×10cfu/mL；阳性对照管
9
液体浑浊，活菌数为2.3×10cfu/mL。

[0098] 实施例10

[0099] 将抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc样品分别置于-80℃、-20℃、25℃、100℃、120℃条件下存放24h后取出，做抑菌试验检验温度对抗菌活性的影响；用盐酸和氢 氧化钠将样品pH调节至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，室温静置24h后，测定不同pH条件下样品的抗菌活性；将样品分别置于不同浓度（高离子浓度50mmol/L、中离子浓度10mmol/L、低离子浓度1mmol/L）的氯化钙、氯化镁、氯化钠、氯化钾、三氯化铁溶液中室温放置24h后，检测抗菌活性。

[0100] 结果如图11、12、13所示，本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对不同金属离子浓度、酸碱度、温度均不敏感。

[0101] 以下为本发明专利申请涉及的氨基酸和核苷酸序列表，序列表中各序列依次为：

[0102] SEQ ID NO:1抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的基因核苷酸序列

[0103] SEQ ID NO:2抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的氨基酸序列