一种通用型重组表达载体及其构建方法和应用

摘要

本发明提供了一种通用型重组表达载体，该表达载体携带有多功能标签的编码基因，所述多种功能标签为His,c-myc,flag,HA,GST和GFP标签中的至少一种；本发明还提供了一种通用型重组表达载体的构建方法和应用，所述构建方法，简单，制备成本低；本发明构建的通用型重组表达载体可用于外源蛋白的生产，便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化。

权利要求

1.一种通用型重组表达载体，其特征在于，所述通用型重组表达载体为将多功能标签的编码基因插入到原核表达质粒或真核表达质粒的多克隆位点后得到的重组载体；

所述多功能标签的编码基因中顺次连接有GFP，HA，Flag，GST，c-myc标签的编码基因；

所述GFP标签和HA标签的编码基因之间插入有SGSG氨基酸序列的基因编码序列；所述HA标签和Flag标签的编码基因之间插入有GG氨基酸序列的基因编码序列；所述Flag标签和GST标签的编码基因之间插入有GGGGSGGGGS氨基酸序列的基因编码序列；所述GST标签和c-myc标签的编码基因之间插入有氨基酸G的基因编码序列；

其中，所述多功能标签的编码基因为SEQ ID No.7所示氨基酸序列的编码基因；

所述原核表达质粒为pET28，pET32或pGEX，所述真核表达质粒为pcDNA3.1或pPICZ。

2.根据权利要求1所述的通用型重组表达载体，其特征在于，所述pET32质粒为pET32a、pET32b或pET32c质粒，所述多功能标签的编码基因插入到所述pET32a、pET32b或pET32c质粒的NcoI位点和NotI位点之间。

3.一种通用型重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提供质粒载体，所述质粒载体为原核表达质粒或真核表达质粒，所述原核表达质粒为pET28，pET32或pGEX，所述真核表达质粒为pcDNA3.1或pPICZ；

(2)提供多功能标签的编码基因；

(3)将步骤(2)所述的多功能标签的编码基因插入到所述质粒载体的多克隆位点后得到所述通用型重组表达载体；所述多功能标签的编码基因中顺次连接有GFP，HA，Flag，GST，c-myc标签的编码基因；所述GFP标签和HA标签的编码基因之间插入有SGSG氨基酸序列的基因编码序列；所述HA标签和Flag标签的编码基因之间插入有GG氨基酸序列的基因编码序列；所述Flag标签和GST标签的编码基因之间插入有GGGGSGGGGS氨基酸序列的基因编码序列；所述GST标签和c-myc标签的编码基因之间插入有氨基酸G的基因编码序列；

其中，所述多功能标签的编码基因为SEQ ID No.7所示氨基酸序列的编码基因。

4.一种利用权利要求1～2任一项所述的通用型重组表达载体在外源重组蛋白的表达、示踪、纯化、和检测中的应用。

说明书

一种通用型重组表达载体及其构建方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种通用型重组表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

[0002] 蛋白标签大体可分为三大类：遗传标签、in vivo标签和in vitro标签。使用带有遗传标签（如c-Myc、FLAG）的载体表达蛋白是分子克隆的常用技术，将目的基因对框克隆到含有标签的载体上，可便于下游通过抗体或荧光检测。此外，还有促进蛋白质可溶性表达的标签、便于蛋白质纯化的标签等。Sigma-Aldrich和安捷伦（原Stratagene公司）提供了一些常见的带有FLAG、c-Myc或CBP（钙调蛋白结合肽段）的载体系统。

[0003] 蛋白标签的作用巨大，所以有必要提供一种携带多种标签的通用载体，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。

发明内容

[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种通用型重组表达载体，该表达载体携带有多种功能标签；本发明还提供了一种通用型重组表达载体的构建方法和应用，将构建的通用型重组表达载体应用于外源蛋白的生产，便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化。

[0005] 本发明采用的英文缩写及其中文释义或Genebank登录号如下：

[0006] His：组氨酸标签；c-myc：本发明采用的c-myc标签的的氨基酸序列为EQKLISEEDL；

[0007] flag：本发明采用的flag标签的氨基酸序列为DYKDDDDK；

[0008] HA：本发明采用的HA标签的氨基酸序列为YPYDVPDYA；

[0009] GST：谷胱甘肽S-转移酶标签，本发明采用的GST标签的Genebank登录号为：L29345；

[0010] GFP：绿色荧光蛋白标签，本发明采用的GFP标签的Genebank登录号为：U12472。

[0011] 第一方面，本发明提供了一种通用型重组表达载体，所述通用型重组表达载体为将多功能标签的编码基因插入到原核表达质粒或真核表达质粒的多克隆位点后得到的重组载体；所述多功能标签的编码基因包括His,c-myc,flag,HA,GST和GFP标签的编码基因中的至少一种，所述原核表达质粒为pET28，pET32或pGEX，所述真核表达质粒为pcDNA3.1或pPICZ。

[0012] 优选地，所述pET28为pET28a或pET28b。

[0013] 优选地，所述pET32为pET32a、pET32b或pET32c。

[0014] 优选地，所述pGEX为pGEX4T-1、pGEX4T-2。

[0015] 优选地，所述pcDNA3.1为pcDNA3.1/His A、pcDNA3.1/His B或pcDNA3.1/His C。

[0016] 优选地，所述pPICZ为pPICZαA、pPICZαB或pPICZαC。

[0017] 优选地，所述多功能标签的编码基因插入到所述pET32a、pET32b或pET32c质粒的NcoI位点和NotI位点之间。

[0018] 优选地，所述多功能标签的编码基因中顺次连接有所述GFP，HA，Flag，GST，c-myc标签的编码基因。

[0019] 更优选地，所述GFP标签和HA标签的编码基因之间插入有SGSG氨基酸序列的基因编码序列。

[0020] 更优选地，所述HA标签和Flag标签的编码基因之间插入有GG氨基酸序列的基因编码序列。

[0021] 更优选地，所述Flag标签和GST标签的编码基因之间插入有GGGGSGGGGS氨基酸序列的基因编码序列。

[0022] 具体的，所述GGGGSGGGGS氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0023] 更优选地，所述GST标签和c-myc标签的编码基因之间插入有氨基酸G的基因编码序列。

[0024] 在此优选条件下，所述多功能标签的编码基因插入到所述pET32a、pET32b或pET32c质粒的NcoI位点和NotI位点之间；得到可表达GFP、HA、flag、GST和c-myc共5种标签的通用型重组表达载体；由于pET32a、pET32b或pET32c质粒本身还带有His标签，在此优选条件下，所述的表达5种标签的通用型重组表达载体还可以通过选择合适的酶切位点，在要表达的目标外源蛋白的N端或C端带上His标签。

[0025] 此外，在此优选条件下，采用本发明提供的所述的表达5种标签的通用型重组表达载体，由于所述GFP、HA、flag、GST和c-myc标签之间采用多种亲水氨基酸序列进行连接，比如SGSG、GG、GGGGSGGGGS和G等亲水氨基酸序列，可以增强标签之间的柔性和可折叠性，降低各标签之间功能位点的相互影响，充分发挥标签的功能。

[0026] 另一方面，本发明提供了一种通用型重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：

[0027] （1）提供质粒载体，所述质粒载体为原核表达质粒或真核表达质粒，所述原核表达质粒为pET28，pET32或pGEX，所述真核表达质粒为pcDNA3.1或

[0028] pPICZ；

[0029] （2）提供多功能标签的编码基因，所述多功能标签为His,c-myc,flag,HA,GST和GFP标签的至少一种；

[0030] （3）将步骤（2）所述的多功能标签的编码基因插入到所述质粒载体的多克隆位点后得到所述通用型重组表达载体。

[0031] 优选地，步骤（1）中所述pET28为pET28a或pET28b。

[0032] 优选地，步骤（1）中所述pET32为pET32a、pET32b或pET32c。

[0033] 优选地，步骤（1）中所述pGEX为pGEX4T-1、pGEX4T-2。

[0034] 优选地，步骤（1）中所述pcDNA3.1为pcDNA3.1/His A、pcDNA3.1/His B或pcDNA3.1/His C。

[0035] 优选地，所述pPICZ为pPICZαA、pPICZαB或pPICZαC。

[0036] 优选地，步骤（2）中所述多功能标签的编码基因中顺次连接有所述GFP，HA，Flag，GST，c-myc标签的编码基因。

[0037] 更优选地，所述GFP标签和HA标签的编码基因之间插入有SGSG氨基酸序列的基因编码序列。

[0038] 更优选地，所述HA标签和Flag标签的编码基因之间插入有GG氨基酸序列的基因编码序列。

[0039] 更优选地，所述Flag标签和GST标签的编码基因之间插入有GGGGSGGGGS氨基酸序列的基因编码序列。

[0040] 具体的，所述GGGGSGGGGS氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0041] 更优选地，所述GST标签和c-myc标签的编码基因之间插入有氨基酸G的基因编码序列。

[0042] 优选地，步骤（3）中所述多功能标签的编码基因插入到所述pET32a、pET32b或pET32c质粒的NcoI位点和NotI位点之间。

[0043] 本发明提供的通用型重组表达载体在pET、pGEX、pcDNA3.1或pPICZ载体的MCS位点插入了至少一种His,c-myc,flag,HA,GST和GFP标签的编码基因，由于所采用的pET、pGEX、pcDNA3.1和pPICZ载体的本身至少带有一种纯化标签，故采用本发明提供的通用型重组表达载体表达目的蛋白，有助于目的蛋白的表达、纯化、示踪和检测。

[0044] 此外，本发明选用的多功能标签的编码基因序列兼顾了各标签的功能、大小和插入的位点对目的蛋白的影响，便于表达目的蛋白时插入位点的选择；所述多功能标签的编码基因中还插入有亲水性的氨基酸序列，有利于多功能标签蛋白的可溶性表达；此外，多标签串联的方式，有利于采用两种以上的纯化标签中进行两步或多步法纯化，以产生高纯蛋白。

[0045] 第三方面，本发明提供了一种通用型重组表达载体在蛋白质的表达、示踪、纯化、和检测中的应用。

[0046] 本发明提供的一种通用型重组表达载体及其构建方法和应用具有如下有益效果：

[0047] （1）所述通用型重组表达载体携带多个常用蛋白质标签（His,c-myc,Flag,HA，GST和GFP中的至少一种）的编码基因，可用于对目的蛋白进行可溶性表达、并便于纯化和检测；

[0048] （2）所述通用型重组表达载体的构建方法简单，制备成本低。

附图说明

[0049] 图1为本发明实施例采用的pET32a（+）载体的质粒图谱；

[0050] 图2为本发明实施例制得的通用型重组表达载体pET32a（+）-multi-tag进行菌液PCR的琼脂糖凝胶电泳图；

[0051] 图3为本发明实施例制得的通用型重组表达载体pET32a（+）-multi-tag的质粒图谱；

[0052] 图4和图5分别为本实施例制得的multi-tag融合蛋白纯化前和纯化后的SDS-PAGE图；

[0053] 图6为本发明实施例中制得的multi-tag融合蛋白的Western Blot图。

具体实施方式

[0054] 下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecμlar Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook,J.,Russell,David rd
W.,Molecμlar Cloning:A Laboratory Manual,3 edition,2001,NY,Cold Spring Harbor）。

[0055] 本发明实施例采用的pET32a（+）载体的质粒图谱如图1所示；所使用的质粒载体pET32a(+)、所使用的菌株DH5α、BL21均为市售商品，所使用的试剂均为市售商品；所用引物及DNA序列均由上海Invitrogen公司合成。

[0056] 实施例1

[0057] 本发明实施例提供了一种通用型重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：

[0058] 一、构建pET32a(+)-GFP-GST载体

[0059] （1）GFP基因的克隆

[0060] a）提供上游引物和下游引物；其中，

[0061] 上游引物GFP-F:

[0062] 5’-TCTCCATGGCTAGCAAGGGCGAGGAGC-3’（SEQ ID No.2）；

[0063] 下游引物GFP-R:

[0064] 5’-CCGCCAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGCCAGAACCAGACTTGTACAGCTCGTC-3’（SEQ ID No.3）；

[0065] b）以pUC-GFP质粒作为PCR模板，采用PCR扩增GFP基因，配置扩增体系如下，体系中的引物采用步骤（1）所述的上游引物和下游引物：

[0066] PCR反应体系为（100μl）：

[0067]

[0068] 反应参数为：95℃2min、95℃15s、68℃15s、72℃3min共35个循环，最后再72℃延伸8min。

[0069] 然后采用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，胶回收PCR产物，回收产物送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，保存测序结果正确的PCR产物。

[0070] （2）GST基因的克隆

[0071] a）提供上游引物和下游引物；其中，

[0072] 上游引物GST-F（包括HA Tag，Flag Tag）:

[0073] 5’-CAGATTACGCTGGCGGAGACTACAAGGACGATGACGATAAGGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGAGGCGGTAGCCCTATACTAGGTTAT-3’（SEQ ID No.4）；

[0074] 其中，cagattacgctggcgg为HA标签的编码序列，acgatgacgataag为Flag标签的编码序列，ggaggtggcgggtctggtggaggcggtagc编码GGGGSGGGGS氨基酸序列。

[0075] 下游引物GST-R:

[0076] 5’-TCTGCGGCCGCCAGATCTTCTTCAGAAATAAGTTTTTGTTCACCGTCACGATGCGGCCG-3’（SEQ ID No.5）；

[0077] 其中，GST-R包括c-myc的编码序列。

[0078] b）以pGEX质粒作为PCR模板，采用PCR扩增GST基因，配置扩增体系如下，体系中的引物采用步骤（1）所述的上游引物和下游引物：

[0079] PCR反应体系为（100μl）：

[0080]

[0081] 反应参数为：95℃2min、95℃15s、68℃15s、72℃3min共35个循环，最后再72℃延伸8min。

[0082] 然后采用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，胶回收PCR产物在750bp附近的条带，回收产物送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，保存测序结果正确的PCR产物；由于本步骤的引物设计中引入了HA标签，FLAG标签和c-myc标签的编码基因，可知本步骤所得的GST扩增产物序列中同时含有HA标签，FLAG标签和c-myc标签的编码基因。

[0083] （3）multi-tag融合基因的克隆

[0084] 以GFP-F和GST-R引物，利用重叠PCR技术将步骤（1）得到的编码GFP的基因片段和步骤（2）得到的编码GST的基因片段进行融合，得到multi-tag的编码基因，所述multi-tag依次包括：

[0085] GFP-SGSG-HA-GG-FLAG-GGGGSGGGGS-GST-G-c-myc，其中，所述GFP、HA、FLAG、GST和c-myc表示标签序列，所述SGSG、GG、GGGGSGGGGS和G为穿插在各标签之间的亲水氨基酸序列，步骤如下：

[0086] （3）Overlap PCR扩增multi-tag

[0087] 配置扩增体系如下:

[0088]

[0089] PCR扩增程序为：

[0090]

[0091] 循环结束后加入以下引物，继续扩增

[0092] Primer GFP-F（20mM） 0.5ul

[0093] Primer GST-R（20mM） 0.5ul

[0094] PCR扩增程序如下：

[0095]

[0096] PCR完成后，胶回收750bp附件的条带，胶回收步骤参见Genstar货号为D205-04的说明书。回收产物送公司测序，所得测序正确的序列即为multi-tag融合基因的序列，该序列如SEQ ID No.6所示（包括酶切位点）。

[0097] （4）含multi-tag融合基因的重组表达载体pET32a(+)-multi-tag的构建[0098] a）步骤（3）的基因PCR产物与pET32a(+)质粒的酶切；

[0099] 取pET32a(+)质粒，将步骤（3）回收的multi-tag融合基因及所述pET32a(+)质粒分别采用NcoI以及NotI内切酶进行酶切；

[0100] 步骤（3）所得multi-tag融合基因的PCR产物的酶切体系如下：

[0101]

[0102] pET32a(+)质粒酶切体系如下：

[0103]

[0104] 分别于37℃酶切约2h后胶回收酶切片段。

[0105] b）multi-tag融合基因和pET32a(+)质粒的连接；

[0106] 将步骤a）所得双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，将酶切后的multi-tag融合基因同pET32a(+)质粒进行连接，22℃连接1h，连接反应体系如下：

[0107]

[0108] c）菌液PCR以及测序鉴定

[0109] 将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含Kan的LB固体平板培养基，37℃培养过夜，挑取10个单菌落培养后菌液PCR进行鉴定，菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，在图2中，在图2中，泳道从左到右分别为：M泳道为Marker（Takara，wide range DNA marker），泳道1为Negative control（以H2O为模板），泳道2～11为PCR产物，由图2可知，除泳道4为假阳性克隆外，泳道2、3以及5～11在750kb左右具有明显条带，与GFP-SGSG-HA-GG-Flag-GGGGSGGGGS-GST-G-c-myc融合基因的大小一致，进一步表明multi-tag融合基因成功构建到pET32a(+)载体中。

[0110] 将鉴定的阳性克隆进行测序，将本实施例制得的阳性克隆的载体命名为pET32a(+)-multi-tag，该pET32a(+)-multi-tag载体的质粒图谱如图3所示。

[0111] 实施例2

[0112] 本实施例提供了一种pET32a(+)-multi-tag载体中标签蛋白的表达和纯化的方法，包括如下步骤：

[0113] （1）multi-tag融合标签在大肠杆菌E.Coli中的表达

[0114] 按实验室分子克隆常规方法将pET32a(+)-multi-tag质粒转化到BL21表达菌中，得到E.Coli-pET32a(+)-multi-tag菌种；

[0115] 在5ml含50mg/L Kan的LB液体培养基中，按1：50接种E.Coli-pET32a(+)-multi-tag菌液，37℃，220rpm振荡培养过夜；次日接种培养过夜的菌液至含50mg/L Kan的新LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养至OD600=0.6～0.8；每管分别加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，28℃诱导表达；分别在诱导2、4和6小时后收集菌液，4℃，12000g高速离心收集菌体；加入2ml磷酸缓冲液重悬洗涤菌体，然后4℃，12000g离心10min，弃上清；重复洗涤菌体一次，加入1ml PBS缓冲液重悬菌体。超声破碎细胞后，12000g离心10min，取上清即为multi-tag融合蛋白粗提液，采用SDS-PAGE电泳分析并鉴定上清液中multi-tag融合蛋白的表达，SDS-PAGE电泳方法参照分子克隆实验指南进行，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％，浓缩胶80V恒压，分离胶120V恒压跑约2小时；

[0116] （2）multi-tag融合标签蛋白的纯化

[0117] 取步骤（1）所得multi-tag融合标签蛋白粗提液，由于pET32a(+)载体本身带有1个Trx标签、2个His标签、1个S标签，故本实施例表达的multi-tag融合标签蛋白还带有1个Trx标签、2个His标签、1个S标签，利用His标签的特异性，采用镍柱亲和层析法进行初步纯化，方法按说明书（GE公司）进行；纯化蛋白经超滤浓缩、过滤除菌后-80℃保存；

[0118] 对纯化后融合标签蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定，SDS-PAGE电泳方法及Western Blot方法参照分子克隆实验指南进行，其中，SDS-PAGE电泳的浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％，浓缩胶80V恒压，分离胶120V恒压跑约2小时；Western Blot鉴定：在转膜缓冲液体系下100V恒压，转膜90分钟，经封闭后分别一抗、二抗、显色，其中，一抗分别为抗GFP、HA、Flag、GST、c-myc和His的抗体，以下为本实施例2的结果：

[0119] 图4和图5分别为本实施例制得的融合标签蛋白纯化前和纯化后的SDS-PAGE图；由图4和图5可以看出，本发明提供的重组载体成功表达了multi-tag融合标签蛋白；从图4可以看出，纯化之前，粗提液中有多种分子量的蛋白存在；在图5中，泳道从左到右分TM
别为：M泳道为Marker（Genstar Direct-load Prestained Protein Marker II），泳道
1、2、3为融合标签蛋白，由图5可知，本发明纯化后的multi-tag融合标签蛋白的条带大小75kD，与multi-tag融合标签蛋白的理论分子量大小一致，说明本发明提供的重组载体的融合标签蛋白multi-tag得到表达和纯化，所述multi-tag融合标签蛋白的氨基酸序列除包括pET32a(+)载体带有的1个Trx标签、2个His标签、1个S标签外，还包括GFP、HA、Flag、GST和c-myc融合标签片段，该段融合标签氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的。

[0120] 具体地，对所述SEQ ID NO:7所述的氨基酸序列进行进一步说明如下：

[0121]

[0122]

[0123] 其中，波浪线区域表示GFP标签的氨基酸序列，虚线区域表示HA标签的氨基酸序列，单下划线的区域表示Flag标签的氨基酸序列，双下划线的区域表示GST标签的氨基酸序列，波浪线并且斜体的区域表示c-myc标签的氨基酸序列。

[0124] 图6为本发明实施例中制得的GFP-GST融合蛋白的Western Blot图，其中，（a）～（f）对应的一抗分别为抗GFP、HA、Flag、GST、c-myc和His的抗体，此外，图（a）中的300ng，图（b）中的500ng，图（c）中的25ng，图（d）中的25ng，图（e）中的400ng、600ng、800ng，和图（f）中的400ng、600ng、800ng，分别表示该蛋白泳道所添加的蛋白样品的质量；图6（a）～（f）的检测结果进一步表明本发明提供的pET32a(+)-multi-tag载体能同时表达GFP、HA、Flag、GST、c-myc和His共6种标签。

[0125] 综上所述，本发明提供的通用型重组表达载体可用于表达带有融合标签的目的蛋白，便于目的蛋白的纯化和细胞内观察。

[0126] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。