本发明公开了一种冬虫夏草真菌(Cordyceps sinensis)的无性型-中国被毛孢(Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng)采用工业化发酵生产方法，特别涉及一种中国被毛孢菌粉的生产方法。本发明所提供的方法，在不同的培养阶段采用不同的培养基，既保证了为中国被毛孢菌正常生长提供了动态的营养物质，又降低了工业化生产的成本，而且确保了与天然冬虫夏草相近的质量。
A.各阶段的培养基按重量体积比(g/ml)配方如下：
(1)斜面培养基：蚕豆粉2～5％、葡萄糖2～5％、玉米粉1～4％、蛋白胨0.5～2％、琼脂0.5～2％、麸皮0.5～4％、硫酸镁0.05～1％、磷酸氢二钾0.05～1％，其余为水；
(2)一级发酵和二级发酵培养基：葡萄糖2～5％、酵母膏0.1～4％、蛋白胨0.5～
2％、硫酸镁0.05～1％、磷酸氢二钾0.05～1％，其余为水；
(3)摇床培养、三级发酵和四级发酵培养基：蚕豆粉2～5％、玉米粉1～4％、葡萄糖
2～5％、蛋白胨0.5～2％、酵母膏1～5％、硫酸镁0.05～1％、磷酸氢二钾0.05～1％，其余为水；
先将中国被毛孢菌种接种于斜面培养基，在13～17℃条件下发酵20～30天，将菌种接种于三、四级发酵用培养基的摇床上，在13～17℃条件下发酵7～9天，然后接种于盛有培养基的一级种子罐，在13～17℃条件下发酵7～9天，再转至盛有培养基的二级发酵罐在13～17℃条件下发酵7～9天，再转至盛有培养基的三级发酵罐，在13～17℃条件下发酵3～5天，补充该培养基至罐体体积的2/3继续发酵3～5天，再转至盛有培养基的四级发酵罐，在13～17℃下发酵2～3天，补充该培养基至罐体体积的2/3后继续发酵，待罐内菌浓达到30～50％时出罐，进行固液分离，将固体烘干粉碎得中国被毛孢菌粉。
2.根据权利要求1所述的一种中国被毛孢菌粉生产方法，其特征在于
A.各阶段的培养基按重量体积比(g/ml)配方如下：
(1)斜面培养基：蚕豆粉3～4％、葡萄糖2.5～4％、玉米粉1.5～3％、蛋白胨0.75～
1.5％、琼脂1～1.5％、麸皮1～3％、硫酸镁0.1～0.8％、磷酸氢二钾0.1～0.9％，其余为水；
(2)一级发酵和二级发酵培养基：葡萄糖3～4％、酵母膏0.5～3％、蛋白胨1～
1.5％、硫酸镁0.1～0.8％、磷酸氢二钾0.1～0.8％，其余为水；
(3)摇床培养、三级发酵和四级发酵培养基：蚕豆粉3～4％、玉米粉1.5～ 3％、葡萄糖2.5～4％、蛋白胨1～1.5％、酵母膏2～4％、硫酸镁0.1～0.9％、磷酸氢二钾0.2～
先将中国被毛孢菌种接种于斜面培养基，在14～15℃条件下发酵22～27天，将菌种接种于三、四级发酵用培养基的摇床上，在14～15℃条件下发酵7～9天，然后接种于盛有培养基的一级种子罐，在14～15℃条件下发酵7～9天，再转至盛有培养基的二级发酵罐在14～15℃条件下发酵7～9天，再转至盛有培养基的三级发酵罐，在14～15℃条件下发酵3～5天，补充该培养基至罐体体积的2/3继续发酵3～5天，再转至盛有培养基的四级发酵罐，在14～15℃下发酵2～3天，补充该培养基至罐体体积的2/3后继续发酵，待罐内菌浓达到30～50％时出罐，进行固液分离，将固体烘干粉碎得中国被毛孢菌粉。
3.根据权利要求1所述的一种中国被毛孢菌粉生产方法，其特征在于：
A.各阶段的培养基按重量体积比(g/ml)配方如下：
(1)斜面培养基：蚕豆粉3％、葡萄糖2.5％、玉米粉1.5％、蛋白胨1％、琼脂0.75％、麸皮1.5％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.2％，其余为水；
(2)一级发酵和二级发酵培养基：葡萄糖3％、酵母膏0.5％、蛋白胨1％、硫酸镁
(3)摇床培养、三级发酵和四级发酵培养基：蚕豆粉3％、玉米粉1.5％、葡萄糖2.5％、蛋白胨1％、酵母膏2％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.2％，其余为水；
先将中国被毛孢菌种接种于斜面培养基，在14℃条件下发酵27天，将菌种接种于三、四级发酵用培养基的摇床上，在15℃条件下发酵8天，然后接种于盛有培养基的一级种子罐，在14℃条件下发酵8天，再转至盛有培养基的二级发酵罐在14℃条件下发酵8天，再转至盛有培养基的三级发酵罐，在15℃条件下发酵3天，补充该培养基至罐体体积的2/3继续发酵3天，再转至盛有培养基的四级发酵罐，在15℃下发酵2天，补充该培养基至罐体体积的2/3后继续发 酵，待罐内菌浓达到30～50％时出罐，进行固液分离，将固体烘干粉碎得中国被毛孢菌粉。
一种中国被毛孢菌粉生产方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种冬虫夏草真菌(Cordyceps sinensis)的无性型-中国被毛孢(Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng)采用工业化发酵生产方法，特别涉及一种中国被毛孢菌粉的生产方法。
背景技术
[0002] 冬虫夏草是鳞翅目蝙蝠蛾属的虫草蝙蝠蛾(Hepialus armoricamus Oberthur)幼虫感染中国被毛孢真菌后，在体内大量繁殖后形成的虫菌复合体，即中国被毛孢菌以蝙蝠蛾幼虫为营养源不断在其体内繁殖，直至僵死成为僵虫，最后长出子座形成天然冬虫夏草。从天然冬虫夏草的形成过程来看，中国被毛孢在蝙蝠蛾幼虫体内繁殖过程中不断通过幼虫摄取营养物质，即营养补给呈动态形式。
[0003] 中国专利CN200710024324.9公开的一种用于生产冬虫夏草菌丝体的培养基，该专利公开了斜面培养基与发酵阶段两种不同的培养基，其中斜面培养基主要原料为葡萄糖、玉米粉、土豆汁、酵母粉、麸皮、蚕蛹粉、蛋白胨、氯化钠、氯化镁、硫酸镁、氯化锰、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸锰中的一种或多种；发酵培养基主要原料为葡萄糖、玉米浆、糖蜜、蚕蛹粉、黄豆饼粉、酵母膏、氯化钠、氯化镁、硫酸镁、氯化锰、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸锰中的一种或多种。在工业生产中，先将菌种接种于斜面培养基，在12～16℃培养25～35天，然后将菌种接种于发酵培养基于摇床上，温度12～16℃培养8～10天，然后接种于一级种子罐，温度12～16℃培养8～10天，然后以培养基量的8～10倍扩大，逐级发酵，直至达到所需的量，出罐后进行固液分离，将固体烘干、粉碎而成。
[0004] 该专利只是公开了斜面培养基和发酵培养基的配方，培养基主要原料蚕蛹市场价16～18元/公斤，价格昂贵，导致工业化生产冬虫夏草菌粉成本高。而且该专利公开的发酵工艺基本沿用了中国专利CN97110448.4公开的中国冬虫夏草真菌的发酵生产方法和CN200410101728.X公开的冬虫夏草大规模发酵生产及菌粉加工工艺，采用上述两件专利所述的发酵工艺沿用传统抗生素发酵工艺，在冬虫夏草中国被毛孢活体菌发酵时没有动态补给营养物质，使菌种没有得到完全转换，从而导致发酵后干物质收率低，产品中主要成分总氨基酸、甘露醇和腺苷含量低。
发明内容
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，从培养基和工艺两方面同时改进，提供一种成本低、菌丝体收率高、产品营养物质含量高的中国被毛孢菌粉生产方法。
[0006] 本发明所需的菌种为：中国被毛孢(Hirsutella sinensis)。现保存在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2012年8月29日，保藏号是CGMCC6444。
[0007] 本发明的技术解决方案是通过以下方法来实现的：一种中国被毛孢菌粉生产方法包括如下步骤：
[0008] 先将中国被毛孢菌种接种于斜面培养基，在13～17℃条件下发酵20～30天，将菌种接种于三、四级发酵用培养基的摇床上，在13～17℃条件下发酵7～9天，然后接种于盛有培养基的一级种子罐，在13～17℃条件下发酵7～9天，再转至盛有培养基的二级发酵罐在13～17℃条件下发酵7～9天，再转至盛有培养基的三级发酵罐，在13～17℃条件下发酵3～5天，补充该培养基至罐体体积的2/3继续发酵3～5天，再转至盛有培养基的四级发酵罐，在13～17℃下发酵2～3天，补充该培养基至罐体体积的2/3后继续发酵，待罐内菌浓达到30～50％时出罐，进行固液分离，将固体烘干粉碎得中国被毛孢菌粉。
[0009] 上述斜面培养基，按重量体积比(g/ml)计，包括蚕豆粉2～5％、葡萄糖2～5％、玉米粉1～4％、蛋白胨0.5～2％、琼脂0.5～2％、麸皮0.5～4％、硫酸镁0.05～1％、磷酸氢二钾0.05～1％，其余为水。
[0010] 更优选的斜面培养基，按重量体积比(g/ml)计，包括蚕豆粉3～4％、葡萄糖2.5～4％、玉米粉1.5～3％、蛋白胨0.75～1.5％、琼脂1～1.5％、麸皮1～3％、硫酸镁0.1～0.8％、磷酸氢二钾0.1～0.9％，其余为水。
[0011] 最优选的斜面培养基，按重量体积比(g/ml)计，包括蚕豆粉3％、葡萄糖2.5％、玉米粉1.5％、蛋白胨1％、琼脂0.75％、麸皮1.5％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.2％，其余为水。
[0012] 上述一级发酵和二级发酵培养基，按重量体积比(g/ml)计，包括葡萄糖2～5％、酵母膏0.1～4％、蛋白胨0.5～2％、硫酸镁0.05～1％、磷酸氢二钾0.05～1％，其余为水。
[0013] 更优选的一级发酵和二级发酵培养基，按重量体积比(g/ml)计，包括葡萄糖3～4％、酵母膏0.5～3％、蛋白胨1～1.5％、硫酸镁0.1～0.8％、磷酸氢二钾0.1～0.8％，其余为水。
[0014] 最优选的一级发酵和二级发酵培养基，按重量体积比(g/ml)计，包括葡萄糖3％、酵母膏0.5％、蛋白胨1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.2％，其余为水。
[0015] 上述摇床培养、三级发酵和四级发酵培养基，按重量体积比(g/ml)计，包括蚕豆粉2～5％、玉米粉1～4％、葡萄糖2～5％、蛋白胨0.5～2％、酵母膏1～5％、硫酸镁0.05～1％、磷酸氢二钾0.05～1％，其余为水。
[0016] 更优选的摇床培养、三级发酵和四级发酵培养基，按重量体积比(g/ml)计，包括蚕豆粉3～4％、玉米粉1.5～3％、葡萄糖2.5～4％、蛋白胨1～1.5％、酵母膏2～4％、硫酸镁0.1～0.9％、磷酸氢二钾0.2～0.9％，其余为水。
[0017] 最优选的摇床培养、三级发酵和四级发酵培养基，按重量体积比(g/ml)计，包括蚕豆粉3％、玉米粉1.5％、葡萄糖2.5％、蛋白胨1％、酵母膏2％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.2％，其余为水。
[0018] 本发明的效果是：生产成本低，原料来源广泛，在不同的发酵阶段根据中国被毛孢生长需要采用不同的培养基，而且在三四级发酵阶段通过补料的形式为中国被毛孢提供充足的营养，从而使最终发酵产品干菌丝体收率大幅度提高，产品中主要营养成分含量大幅度提高。
具体实施方式
[0019] 实施例1
[0020] 先按重量体积比(g/ml)取蚕豆粉2％、葡萄糖5％、玉米粉1.5％、蛋白胨1％、琼脂0.75％、麸皮0.5％、硫酸镁0.05％、磷酸氢二钾0.1％、水89.1％制作斜面培养基，并接中国被毛孢菌种后13℃发酵30天，然后将菌种接种于按重量体积比(g/ml)以蚕豆粉2％、葡萄糖2.5％、玉米粉1％、蛋白胨2％、酵母膏5％、硫酸镁0.05％、磷酸氢二钾1％、水86.95％配置的培养基摇床上，17℃发酵7天，然后接种于一级种子罐，培养基按重量体积比(g/ml)为葡萄糖2％、酵母膏0.5％、蛋白胨1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.8％、水
95.6％，13℃发酵9天，再转至盛有同一级发酵培养基的二级发酵罐中13℃发酵9天，再转至盛有按重量体积比(g/ml)以蚕豆粉2％、葡萄糖2.5％、玉米粉1％、蛋白胨2％、酵母膏
5％、硫酸镁0.05％、磷酸氢二钾1％、水86.95％的培养基的三级发酵罐，17℃发酵3天，补充该培养基至罐体体积的2/3继续发酵5天，再转至盛有同三级发酵培养基的四级发酵罐中17℃发酵2天，补充该培养基至罐体体积的2/3后继续发酵，待罐内菌丝体浓度达到
30～50％时出罐，进行固液分离，将固体烘干粉碎得中国被毛孢菌粉。
[0021] 实施例2
[0022] 先按重量体积比(g/ml)取蚕豆粉3％、葡萄糖4％、玉米粉1％、蛋白胨0.5％、琼脂1％、麸皮4％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.05％、水86.35％制作斜面培养基，并接中国被毛孢菌种后17℃发酵20天，然后将菌种接种于按重量体积比(g/ml)以蚕豆粉3％、葡萄糖4％、玉米粉4％、蛋白胨0.5％、酵母膏1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.05％、水87.35％配置的培养基摇床上，13℃发酵9天，然后接种于一级种子罐，培养基按重量体积比(g/ml)为葡萄糖3％、酵母膏4％、蛋白胨0.5％、硫酸镁1％、磷酸氢二钾1％、水90.5％，
17℃发酵7天，再转至盛有同一级发酵培养基的二级发酵罐中17℃发酵7天，再转至盛有按重量体积比(g/ml)以蚕豆粉3％、葡萄糖4％、玉米粉4％、蛋白胨0.5％、酵母膏1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.05％、水87.35％的培养基的三级发酵罐，13℃发酵5天，补充该培养基至罐体体积的2/3继续发酵3天，再转至盛有同三级发酵培养基的四级发酵罐中13℃发酵3天，补充该培养基至罐体体积的2/3后继续发酵，待罐内菌丝体浓度达到30～50％时出罐，进行固液分离，将固体烘干粉碎得中国被毛孢菌粉。
[0023] 实施例3
[0024] 先按重量体积比(g/ml)取蚕豆粉4％、葡萄糖2.5％、玉米粉4％、蛋白胨2％、琼脂0.5％、麸皮1％、硫酸镁0.8％、磷酸氢二钾1％、水84.2％制作斜面培养基，并接中国被毛孢菌种后15℃发酵22天，然后将菌种接种于按重量体积比(g/ml)以蚕豆粉4％、葡萄糖5％、玉米粉3％、蛋白胨1％、酵母膏2％、硫酸镁0.9％、磷酸氢二钾0.2％、水83.9％配置的培养基摇床上，14℃发酵8天，然后接种于一级种子罐，培养基按重量体积比(g/ml)为葡萄糖4％、酵母膏3％、蛋白胨1.5％、硫酸镁0.05％、磷酸氢二钾0.1％、水91.35％，15℃发酵8天，再转至盛有同一级发酵培养基的二级发酵罐中15℃发酵8天，再转至盛有按重量体积比(g/ml)以蚕豆粉4％、葡萄糖5％、玉米粉3％、蛋白胨1％、酵母膏2％、硫酸镁0.9％、磷酸氢二钾0.2％、水83.9％的培养基的三级发酵罐，14℃发酵4天，补充该培养基至罐体体积的2/3继续发酵4天，再转至盛有同三级发酵培养基的四级发酵罐中14℃发酵3天，补充该培养基至罐体体积的2/3后继续发酵，待罐内菌丝体浓度达到30～50％时出罐，进行固液分离，将固体烘干粉碎得中国被毛孢菌粉。
[0025] 实施例4
[0026] 先按重量体积比(g/ml)取蚕豆粉5％、葡萄糖2％、玉米粉3％、蛋白胨0.75％、琼脂2％、麸皮1.5％、硫酸镁1％、磷酸氢二钾0.2％、水84.55％制作斜面培养基，并接中国被毛孢菌种后14℃发酵27天，然后将菌种接种于按重量体积比(g/ml)以蚕豆粉5％、葡萄糖2％、玉米粉1.5％、蛋白胨1.5％、酵母膏4％、硫酸镁1％、磷酸氢二钾0.9％、水84.1％配置的培养基摇床上，15℃发酵8天，然后接种于一级种子罐，培养基按重量体积比(g/ml)为葡萄糖5％、酵母膏0.1％、蛋白胨2％、硫酸镁0.8％、磷酸氢二钾0.05％、水92.05％，14℃发酵8天，再转至盛有同一级发酵培养基的二级发酵罐中14℃发酵8天，再转至盛有按重量体积比(g/ml)以蚕豆粉5％、葡萄糖2％、玉米粉1.5％、蛋白胨1.5％、酵母膏4％、硫酸镁1％、磷酸氢二钾0.9％、水84.1％的培养基的三级发酵罐，15℃发酵3天，补充该培养基至罐体体积的2/3继续发酵3天，再转至盛有同三级发酵培养基的四级发酵罐中15℃发酵
2天，补充该培养基至罐体体积的2/3后继续发酵，待罐内菌丝体浓度达到30～50％时出罐，进行固液分离，将固体烘干粉碎得中国被毛孢菌粉。
[0027] 实施例5
[0028] 先按重量体积比(g/ml)取蚕豆粉3％、葡萄糖2.5％、玉米粉1.5％、蛋白胨1％、琼脂0.75％、麸皮1.5％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.2％、水89.45％制作斜面培养基，并接中国被毛孢菌种后14℃发酵27天，然后将菌种接种于按重量体积比(g/ml)以蚕豆粉3％、玉米粉1.5％、葡萄糖2.5％、蛋白胨1％、酵母膏2％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.2％、水89.7％配置的培养基摇床上，15℃发酵8天，然后接种于一级种子罐，培养基按重量体积比(g/ml)为葡萄糖3％、酵母膏0.5％、蛋白胨1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾
0.2％、水95.2％，14℃发酵8天，再转至盛有同一级发酵培养基的二级发酵罐中14℃发酵
8天，再转至盛有按重量体积比(g/ml)以蚕豆粉3％、葡萄糖2.5％、玉米粉1.5％、蛋白胨
1％、琼脂0.75％、麸皮1.5％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.2％、水89.45％的培养基的三级发酵罐，15℃发酵3天，补充该培养基至罐体体积的2/3继续发酵3天，再转至盛有同三级发酵培养基的四级发酵罐中15℃发酵2天，补充该培养基至罐体体积的2/3后继续发酵，待罐内菌丝体浓度达到30～50％时出罐，进行固液分离，将固体烘干粉碎得中国被毛孢菌粉。
[0029] 实施例6
[0030] 对比试验
[0031] 将实施例1、2、3、4和5所制得的产品与按CN200710024324.9公开的实施例生产的产品进行对比试验(详见如下表)，发现本发明方法所制得的中国被毛孢菌粉产量及氨基酸、甘露醇、腺苷含量均高于采用中国专利CN200710024324.9所生产的中国被毛孢菌粉产量，尤其样品8即本发明实施例5制得的样品产量及总氨基酸、甘露醇和腺苷含量明显较高。并按《中华人民共和国药典2005年版》中所记载的测定方法进行测定。
[0032] 对比试验一览表
[0033]
