一种采用多次转化发酵法生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法

摘要

本发明涉及一种使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法，该方法包括平板活化培养、种子培养、发酵培养、由菌体提取脂肪与由发酵上清液提取脂肪等步骤。本发明采用二次补加葡萄糖的菌体培养模式，显著提高了重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9的生物量。同时，采用利用同一批菌体多次转化红花籽油的转化模式，大大提高了t10，c12-CLA产量。因此，本发明使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法具有非常好的工业化应用前景。

权利要求

1.一种采用多次转化发酵法生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法，其特征在于该方法的步骤如下：A、平板活化培养

使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装在平板中的固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度20～32℃的条件下平板活化培养2～6天，得到斜面培养物；重组耶氏解脂酵母菌株(Yarrowia lipolytica)CCFM-JU277-9已于2013年3月06日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.7284；

B、种子培养

使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度20～32℃与150～250rpm的条件下培养40～52小时；

C、发酵培养

按照以发酵培养基体积计0.5％～2.0％接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度20～32℃与150～250rpm的条件下震荡培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第一个生长稳定期，继续培养至葡萄糖浓度下降至0.1g/L；接着往该发酵培养基中第一次补加葡萄糖，使该发酵培养液中葡萄糖浓度达到10g/L～20g/L，继续培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第二个生长稳定期，至葡萄糖达到0.1g/L；然后往该发酵培养基中第二次补加葡萄糖，使该发酵培养液达到10g/L～20g/L葡萄糖，继续培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第三个生长稳定期，添加终浓度为20-70g/L的乳化红花籽油，继续培养35-60小时，得到一种发酵培养物，它在7500～

8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到一次转化的菌体与发酵上清液；

一次转化后的菌体用新鲜培养基重悬，然后添加终浓度为20-70g/L的乳化红花籽油，置于发酵锥形瓶中在温度20～32℃与150～250rpm的条件下继续震荡培养35-60小时，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到二次转化的菌体与发酵上清液；

二次转化后的菌体再次用新鲜培养基重悬，然后添加终浓度为20-70g/L的乳化红花籽油，并重复上述步骤，得到三次转化的菌体与发酵上清液；

三次转化后的菌体再次用新鲜培养基重悬，然后添加终浓度为20-70g/L的乳化红花籽油，并重复上述步骤，得到四次转化的菌体与发酵上清液；

所述的多次转化后的菌体使用以重量计0.70～1.00％NaCl水溶液洗涤2～3次，得到的洗涤液与所述的第四次转化后的发酵上清液合并，合并的发酵上清液与前三次转化后的发酵上清液分别用于后续处理；洗涤的菌体接着进行冻干；

D、由菌体提取脂肪

按照以mg计冻干菌体与以ml计8～12％盐酸-甲醇溶液之比为20～50：0.5～1.5，让步骤C所得到的冻干菌体与8～12％盐酸-甲醇溶液在温度45～65℃的条件下进行甲酯化2.5～3.5小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在5000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的总脂肪酸甲酯；

E、由发酵上清液提取脂肪

按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:8.0～12.0，用按照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液2～4次，提取液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的8～12％盐酸-甲醇溶液在温度45～65℃的条件下进行甲酯化

0.5～3小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在3000～

7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的总脂肪酸甲酯。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的发酵培养步骤C如下：按照菌体量为所述新发酵培养基总体积计0.5％～2.0％，使用新发酵培养基将第三个生长稳定期后继续发酵培养所得到的菌体制成悬菌液，再添加终浓度为20g/L-70g/L的乳化红花籽油，继续在温度20～32℃与150～250rpm的条件下震荡培养48小时，分离得到菌体与发酵上清液，按照同样方式重复发酵培养2～4次，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到菌体与发酵上清液；

所述的菌体使用以重量计0.70～1.00％NaCl水溶液洗涤2～3次，得到的洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理；洗涤的菌体接着进行冻干。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的平板固体培养基制备方法如下：

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌

20min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的种子培养基制备方法如下：

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的发酵培养基制备方法如下：

按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的用于多次转化的新鲜培养基制备方法如下：按照5g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨，3.7g/L磷酸二氢钾，8.3g/L磷酸氢二钠，将葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾与磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述的无机酸选自硫酸或盐酸；所述的无机碱选自氢氧化钠或氢氧化钾；所述无机酸或无机碱水溶液的浓度是2.0～4.0mol/L。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的乳化红花籽油制备方法如下：

把红花籽油添加到以重量计0.6％吐温80水溶液中，直到红花籽油的浓度达到150～

250g/L，接着使用超声设备在功率200W的条件下进行超声处理4～6分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的洗涤菌体在温度-10℃～-30℃与真空度1.0～10.0Pa的条件下进行冻干。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤D中，所述共轭亚油酸的t10，c12-CLA含量是5.1g/L～6.6g/L；在步骤E中，所述共轭亚油酸的t10，c12-CLA含量是

7.9g/L～17.1g/L。

说明书

一种采用多次转化发酵法生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲

酯的方法

【技术领域】

[0001] 本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种使用含金属离子培养基生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法。【背景技术】

[0002] 共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）是具有共轭双键的十八碳二烯酸混合物的统称，是必须脂肪酸亚油酸（Linoleic acid，LA）的立体几何异构体，也可看作是亚油酸的次生衍生物。在过去的三十年中，CLA由于其多样的生理活性功能而受到广泛的关注，CLA具有的主要生理功能包括抗癌、抗动脉粥样硬化、抑制脂肪积累、促进生长、刺激免疫等。其中c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA是迄今为止确认具有生理活性的三种共轭亚油酸单体。

[0003] 在自然界中，CLA存在于来源于反刍动物的肉制品和乳制品中，但是含量极低。目前，CLA的合成广泛采用化学异构法，即将红花油或葵花籽油通过碱催化异构法。但是通过此种方法获得的产物是多种异构体的混合物，其中包含许多生理功能及安全性未知的异构体，活性异构体难以分离纯化。所以，研究生物转化法获得成分单一的功能CLA具有重要的现实意义。

[0004] 到目前为止，c9，t11-CLA生物合成的最高产量是Shimizu研究小组通过Delacroixia coronata菌 株 的delta-9脱 饱 和酶 作 用，以33.3mg/mL异 油 酸（trans-11-octadecenoic acid，t-OA）为底物转化生成10mg/mL的CLA，其中c9，t11-CLA纯度高达98%；由江南大学食品生物技术中心陈卫研究小组构建的重组耶氏解脂酵母菌株（CCFM-JU277-9），通过添加20g/L的大豆油，在5L发酵罐中发酵38.5h得到4g/L的CLA，其中t10，c12-CLA的纯度高达100%，是目前微生物发酵法合成t10，c12-CLA的最高产量。由于CCFM-JU277-9能够在胞内合成亚油酸异构酶（PAI），并催化LA形成专一的t10，c12-CLA单体形式。因此提高PAI蛋白总量将提高t10，c12-CLA的产量，CCFM-JU277-9合成t10，c12-CLA的产量仍具有提高空间。

[0005] 所以本发明希望通过采用补料发酵方法以提高生物量继而提高PAI蛋白总量，并通过多次转化实验从而实现提高t10，c12-CLA产量及缩短微生物培养时间降低发酵成本的目标。【发明内容】

[0006] [要解决的技术问题]

[0007] 本发明的目的是提供一种采用多次转化发酵法生产含有共轭亚油酸的总脂肪酸的方法。

[0008] [技术方案]

[0009] 本发明是通过下述技术方案实现的。

[0010] 本发明涉及一种采用多次转化发酵法生产含有共轭亚油酸的总脂肪酸的方法。

[0011] 所述生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法的步骤如下：

[0012] A、平板活化培养

[0013] 使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装在平板中的固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度20～32℃的条件下平板活化培养2～6天，得到斜面培养物；

[0014] B、种子培养

[0015] 使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度20～32℃与150～250rpm的条件下培养40～52小时；

[0016] C、发酵培养

[0017] 按照以发酵培养基体积计0.5%～2.0%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度20～32℃与150～250rpm的条件下震荡培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第一个生长稳定期，继续培养至葡萄糖浓度下降至0.1g/L；接着往该发酵培养基中第一次补加葡萄糖，使该发酵培养液中葡萄糖浓度达到10g/L～20g/L，继续培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第二个生长稳定期，至葡萄糖达到0.1g/L；然后

[0018] 往该发酵培养基中第二次补加葡萄糖，使该发酵培养液达到10g/L～20g/L葡萄糖，继续培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第三个生长稳定期，添加终浓度为20-70g/L的乳化红花籽油，继续培养35-60小时，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到一次转化的菌体与发酵上清液；

[0019] 一次转化后的菌体用新鲜培养基重悬，然后添加终浓度为20-70g/L的乳化红花籽油，置于发酵锥形瓶中在温度20～32℃与150～250rpm的条件下继续震荡培养35-60小时，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到二次转化的菌体与发酵上清液；

[0020] 二次转化后的菌体再次用新鲜培养基重悬，然后添加终浓度为20-70g/L的乳化红花籽油，并重复上述步骤，得到三次转化的菌体与发酵上清液；

[0021] 三次转化后的菌体再次用新鲜培养基重悬，然后添加终浓度为20-70g/L的乳化红花籽油，并重复上述步骤，得到四次转化的菌体与发酵上清液；

[0022] 所述的多次转化后的菌体使用以重量计0.70～1.00%NaCl水溶液洗涤2～3次，得到的洗涤液与所述的第四次转化后的发酵上清液合并，合并的发酵上清液与前三次转化后的发酵上清液分别用于后续处理；洗涤的菌体接着进行冻干；

[0023] D、由菌体提取脂肪

[0024] 按照以mg计冻干菌体与以ml计8～12%盐酸-甲醇溶液之比为20～50：0.5～1.5，让步骤C所得到的冻干菌体与8～12%盐酸-甲醇溶液在温度45～-65℃的条件下进行甲酯化2.5～3.5小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在5000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的总脂肪酸甲酯；

[0025] E、由发酵上清液提取脂肪

[0026] 按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:8.0～12.0，用按照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液2～4次，提取液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的8～12%盐酸-甲醇溶液在温度45～65℃的条件下进行甲酯化0.5～3小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在
3000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的总脂肪酸甲酯。

[0027] 根据本发明的一种优选实施方式，所述的发酵培养步骤C如下：按照菌体量为所述新发酵培养基总体积计0.5%～2.0%，使用新发酵培养基将第三个生长稳定期后继续发酵培养所得到的菌体制成悬菌液，再添加终浓度为20g/L-70g/L的乳化红花仔油，继续在温度20～32℃与150～250rpm的条件下震荡培养48小时，分离得到菌体与发酵上清液，按照同样方式重复发酵培养2～4次，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到菌体与发酵上清液；

[0028] 所述的菌体使用以重量计0.70～1.00%NaCl水溶液洗涤2～3次，得到的洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理；洗涤的菌体接着进行冻干。

[0029] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的平板固体培养基制备方法如下：

[0030] 按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

[0031] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的种子培养基制备方法如下：

[0032] 按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

[0033] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵培养基制备方法如下：

[0034] 按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

[0035] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的用于多次转化的新鲜培养基制备方法如下：

[0036] 按照5g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨，3.7g/L磷酸二氢钾，8.3g/L磷酸氢二钠，将葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾与磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

[0037] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的无机酸选自硫酸或盐酸；所述的无机碱选自氢氧化钠或氢氧化钾；所述无机酸或无机碱水溶液的浓度是2.0～4.0mol/L。

[0038] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的乳化红花籽油制备方法如下：

[0039] 把红花籽油添加到以重量计0.6%吐温80水溶液中，直到红花籽油的浓度达到150～250g/L，接着使用超声设备在功率200W的条件下进行超声处理4～6分钟，再使用
0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

[0040] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的洗涤菌体在温度-10℃～-30℃与真空度1.0～10.0Pa的条件下进行冻干。

[0041] 根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，所述共轭亚油酸的t10，c12-CLA分别含量是5.1g/L～6.6g/L；在步骤E中，所述共轭亚油酸的t10，c12-CLA分别含量是7.9g/L～17.1g/L。

[0042] 下面将更详细地描述本发明。

[0043] 本发明涉及一种采用多次转化发酵法生产含有共轭亚油酸的总脂肪酸的方法。

[0044] 所述生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法的步骤如下：

[0045] A、平板活化培养

[0046] 使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装在平板中的固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度20～32℃的条件下平板活化培养2～6天，得到斜面培养物；

[0047] 重组耶氏解脂酵母菌株（Yarrowia lipolytica）CCFM-JU277-9已于2013年3月06日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.7284，具体参见CN 103233036 A。

[0048] 所述的平板固体培养基制备方法如下：

[0049] 按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸水溶液或无机碱水溶液，将所得到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

[0050] 在这个步骤中，使用的恒温培养箱是目前市场上销售的产品，例如由上海森信实验仪器有限公司以商品名隔水式恒温培养箱销售的产品。

[0051] 在这个步骤以及后续步骤中，所述的无机酸选自硫酸或盐酸。在本发明中使用的是无机酸水溶液。所述的无机碱选自氢氧化钠或氢氧化钾。使用的是无机碱水溶液。所述无机酸或无机碱水溶液的浓度是2.0-4.0mol/L。

[0052] B、种子培养

[0053] 使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度20～32℃与150～250rpm的条件下培养40～52小时；

[0054] 所述的种子培养基制备方法如下：

[0055] 按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

[0056] 在这个步骤中，所述的种子培养是在培养摇床中进行的，本发明使用的培养摇床是目前市场上销售的产品，例如由上海智诚分析仪器制造有限.公司以商品名恒温培养振荡器销售的产品。

[0057] C、发酵培养

[0058] 按照以发酵培养基体积计0.5%～2.0%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度20～35℃与150～250rpm的条件下震荡培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第一个生长稳定期，继续培养至葡萄糖浓度下降至0.1g/L；接着往该发酵培养基中第一次补加葡萄糖，使该发酵培养液中葡萄糖浓度达到10g/L～20g/L，继续培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第二个生长稳定期，至葡萄糖达到0.1g/L。

[0059] 所述的发酵培养基制备方法如下：

[0060] 按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至4.5-5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

[0061] 在这个步骤中，所述的发酵培养是在震荡培养箱中进行的，本发明使用的震荡培养箱是目前市场上销售的产品，例如由上海智诚分析仪器制造有限.公司以商品名恒温培养振荡器销售的产品。

[0062] 然后，往该发酵培养基中第二次补加葡萄糖，使该发酵培养液达到10g/L～20g/L葡萄糖，继续培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第三个生长稳定期，添加终浓度为20-70g/L的乳化红花籽油，继续培养35-60小时，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到一次转化的菌体与发酵上清液。

[0063] 所述的乳化红花籽油制备如下：

[0064] 把红花籽油添加到以重量计0.6%吐温80水溶液中，直到红花籽油的浓度达到150～250g/L，接着使用超声设备在功率200W的条件下进行超声处理4～6分钟，再使用
0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

[0065] 在这个步骤中，使用的超声设备是目前市场上销售的产品，例如由美国SONICS.公司以商品名超声波细胞粉碎机销售的产品。

[0066] 在这个步骤中，使用的0.22μm无菌滤膜是目前市场上销售的产品，例如由上海兴亚净化材料厂.公司以商品名微孔滤膜销售的产品。

[0067] 一次转化后的菌体用新鲜培养基重悬，然后添加终浓度为20-70g/L的乳化红花籽油，置于发酵锥形瓶中在温度20～32℃与150～250rpm的条件下继续震荡培养35-60小时，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到二次转化的菌体与发酵上清液。

[0068] 用于一次转化、二次转化以及后续转化的新鲜培养基制备如下：

[0069] 按照5g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨，3.7g/L磷酸二氢钾，8.3g/L磷酸氢二钠，将葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾与磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

[0070] 二次转化后的菌体再次用新鲜培养基重悬，然后添加终浓度为20-70g/L的乳化红花籽油，并重复上述步骤，得到三次转化的菌体与发酵上清液；

[0071] 三次转化后的菌体再次用新鲜培养基重悬，然后添加终浓度为20-70g/L的乳化红花籽油，并重复上述步骤，得到四次转化的菌体与发酵上清液；

[0072] 所述的多次转化后的菌体使用以重量计0.70～1.00%NaCl水溶液洗涤2～3次，得到的洗涤液与所述的第四次转化后的发酵上清液合并，合并的发酵上清液与前三次转化后的发酵上清液分别用于后续处理；洗涤的菌体接着进行冻干；

[0073] NaCl水溶液洗涤的目的在于洗掉菌体细胞表面附着的脂肪酸。

[0074] 所述的冻干是让所述的洗涤菌体在温度-10℃～-30℃与真空度1.0～10.0Pa的条件下进行冷冻干燥。

[0075] 在这个步骤中，进行冻干所使用的设备是目前市场上销售的产品，例如由美国LABCONCO.公司以商品名冻干机销售的产品。

[0076] 本发明人研究表明，菌体细胞的多次转化可以大大缩短培养菌体的时间，对于工业化应用来说可大大减少发酵周期及发酵成本。

[0077] 优选地，按照菌体量为所述新发酵培养基总体积计0.5%～2.0%，使用新发酵培养基将第三个生长稳定期后继续发酵培养所得到的菌体制成悬菌液，再添加终浓度为20g/L-70g/L的乳化红花仔油，继续在温度20～32℃与150～250rpm的条件下震荡培养48小时，分离得到菌体与发酵上清液，按照同样方式重复发酵培养2～4次，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到菌体与发酵上清液；

[0078] 所述的菌体使用以重量计0.70～1.00%NaCl水溶液洗涤2～3次，得到的洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理；洗涤的菌体接着进行冻干。

[0079] D、由菌体提取脂肪

[0080] 按照以mg计冻干菌体与以ml计8～12%盐酸-甲醇溶液之比为20～50：0.5～1.5，让步骤C所得到的冻干菌体与8～12%盐酸-甲醇溶液在温度45～-65℃的条件下进行甲酯化2.5～3.5小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在5000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的总脂肪酸甲酯。

[0081] 在本发明中，采用常规气相色谱定量分析方法（参见文献Baixi Zhang,Chunchi Rong ect.De novo synthesis of trans-10,cis-12 conjugated linoleic acid in oleaginous yeast Yarrowia Lipolytica.Microbial Cell Factories,2012,11:51））分析了在所述脂肪酸甲酯中的共轭亚油酸t10，c12-CLA含量。

[0082] 在这个步骤中，所述脂肪酸甲酯中共轭亚油酸t10，c12-CLA的含量分别是5.8g/L～6.8g/L。

[0083] E、由发酵上清液提取脂肪

[0084] 按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:8.0～12.0，用按照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液2～4次，提取液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的8～12%盐酸-甲醇溶液在温度45～65℃的条件下进行甲酯化0.5～3小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在
3000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的总脂肪酸甲酯。

[0085] 采用上述常规气相色谱定量分析方法分析，所述脂肪酸甲酯中共轭亚油酸t10，c12-CLA的含量分别是7.9g/L～17.1g/L。

[0086] 通过前面描述与实施例可以清楚地知道，采用本发明方法制备的脂肪酸甲酯中共轭亚油酸t10，c12-CLA的含量远高于现有技术所达到的含量。

[0087] [有益效果]

[0088] 本发明的有益效果是：第一次补加葡萄糖后，生物量达到15.7g/L，比对照组生物量提高了2g/L。在发酵98h时t10，c12-CLA产量是未补加葡萄糖产量的1.95倍，t10，c12-CLA得率也从19.4%提高到37.8%。第二次补加葡萄糖后生物量比第一次添加葡萄糖时明显提高。随着生物量的增加，PAI蛋白表达量也随之增加，CLA的产量及得率进一步得到提高。经过四次转化后菌体细胞中t10，c12-CLA的量为6.8g/L，t10，c12-CLA的总量达到58.0g/L，单位时间合成t10，c12-CLA量为0.23g/L/h，是对照组的1.2倍。菌体细胞的多次转化可以大大缩短培养菌体的时间，对于工业化应用来说可大大减少发酵周期及发酵成本。因此，本发明使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法具有非常好的应用前景。【附图说明】

[0089] 图1是重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9在补充发酵培养基的发酵过程中（不添加红花籽油）的生长曲线。【具体实施方式】

[0090] 通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

[0091] 实施例1：采用补充发酵培养基方式制备含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯[0092] 该实施例的实施步骤如下：

[0093] A、平板活化培养

[0094] 按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用2.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到平板固体培养基。

[0095] 使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装在平板中的平板固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度28℃的条件下平板活化培养4天，得到所述的平板培养物；

[0096] B、种子培养

[0097] 按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用2.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到种子培养基。

[0098] 使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度28℃与200rpm的条件下培养46小时；

[0099] C、发酵培养

[0100] 按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用2.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到发酵培养基。

[0101] 按照5g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨，3.7g/L磷酸二氢钾，8.3g/L磷酸氢二钠，将葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾与磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到用于多次转化的新鲜培养基。

[0102] 把红花籽油植物油添加到以重量计0.6%吐温-80乳化剂水溶液中，直到所述植物油的浓度达到200g/L，接着使用超声设备在功率200W的条件下进行超声处理5分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到相应的乳化植物油。

[0103] 按照以发酵培养基体积计1.0%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度28℃与200rpm的条件下震荡培养，在菌株进入第一个稳定期后往该发酵培养基中第一次补加葡萄糖，使该发酵培养液中葡萄糖浓度达到10g/L，培养51小时使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第二个生长稳定期；然后[0104] 添加终浓度为50g/L的乳化红花籽油，在温度20～32℃与150～250rpm的条件下震荡培养至86小时、98小时或109小时，分别取样，检测在所述发酵液中的t10，c12-CLA的产量，其结果列于表1中。

[0105] 表1 第一次补料添加葡萄糖对t10，c12-CLA产量的影响

[0106]

[0107] a：两次平行试验所得数据

[0108] 按照以发酵培养基体积计1.0%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度28℃与200rpm的条件下震荡培养，在菌株进入第一个稳定期；接着往该发酵培养基中第一次补加葡萄糖，使该发酵培养液中葡萄糖浓度达到10g/L，培养51小时使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第二个生长稳定期后往该发酵培养基中第二次补加葡萄糖，使该发酵培养液达到10g/L葡萄糖，继续培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第三个生长稳定期后，添加终浓度为50g/L的乳化红花籽油，培养至109小时，得到一种发酵培养物，取样，检测在所述发酵液中的t10，c12-CLA的产量，其结果列于表2中。

[0109] 表2：二次补加葡萄糖对t10，c12-CLA产量的影响

[0110]

[0111] a：两次平行试验所得数据；对照组为菌体第一次进入稳定期时添加终浓度为50g/L的红花籽油。

[0112] 表1与表2的结果表明，第一次补加葡萄糖后，生物量达到15.7g/L，比对照组生物量提高了2g/L。在发酵98h时t10，c12-CLA产量达到18.9g/L，是未补加葡萄糖t10，c12-CLA产量的1.95倍，t10，c12-CLA得率也从19.4%提高到37.8%。

[0113] 第二次补加葡萄糖后生物量比第一次添加葡萄糖时提高了3.4g/L，t10，c12-CLA产量及得率分别提高到22.3g/L及44.6%。随着生物量的增加，PAI蛋白表达量也随之增加，CLA的产量及得率进一步得到提高。

[0114] 实施例2：采用多次转化方式制备含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯[0115] 该实施例的实施步骤如下：

[0116] A、平板活化培养

[0117] 按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用4.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到平板固体培养基。

[0118] 使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装在平板中的平板固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度28℃的条件下平板活化培养2天，得到所述的平板培养物；

[0119] B、种子培养

[0120] 按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用4.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到种子培养基。

[0121] 使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度28℃与200rpm的条件下培养40小时；

[0122] C、发酵培养

[0123] 按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用4.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到发酵培养基。

[0124] 把红花籽油植物油添加到以重量计0.6%吐温80水溶液中，直到所述植物油的浓度达到200g/L，接着使用超声设备在功率200W的条件下进行超声处理6分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到相应的乳化植物油。

[0125] 按照以发酵培养基体积计2.0%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度28℃与200rpm的条件下震荡培养，使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第一个生长稳定期；接着往该发酵培养基中第一次补加葡萄糖，使该发酵培养液中葡萄糖浓度达到10g/L，继续培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第二个生长稳定期；然后往该发酵培养基中第二次补加葡萄糖，使该发酵培养液达到10g/L葡萄糖，继续培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第三个生长稳定期后，添加终浓度为50g/L的乳化红花籽油，共发酵培养109小时，得到一种发酵培养物，它在8500rpm的条件下离心分离10分钟，得到一次转化的菌体与发酵上清液；

[0126] 一次转化后的菌体按照上述接种量用上述制备的新鲜培养基重悬，然后添加终浓度为50g/L的乳化红花籽油，置于发酵锥形瓶中在温度28℃与200rpm的条件下继续震荡培养48小时，共发酵培养157小时，得到一种发酵培养物，它在8500rpm的条件下离心分离10分钟，得到二次转化的菌体与发酵上清液；

[0127] 二次转化后的菌体按照上述同样条件重复培养，得到三次转化的菌体与发酵上清液；

[0128] 三次转化后的菌体再次按照上述同样条件重复培养，得到四次转化的菌体与发酵上清液。

[0129] 所述的多次转化后的菌体使用以重量计0.85%NaCl水溶液洗涤2次，得到的洗涤液与所述的第四次转化后的发酵上清液合并，合并的发酵上清液与前三次转化后的发酵上清液分别用于后续处理；洗涤的菌体接着进行冻干。

[0130] t10，c12-CLA的产量检测结果列于表3中。

[0131] 表3：菌体细胞多次转化时t10，c12-CLA产量分析结果

[0132]

[0133]

[0134] a：两次平行试验所得数据

[0135] 表3的结果表明，第一次、第二次、第三次和第四次发酵上清中t10，c12-CLA的量分别达到12.9g/L、12.8g/L、12.66g/L和12.9g/L，经过四次转化后菌体细胞中t10，c12-CLA的量为6.8g/L，t10，c12-CLA的总量达到58.0g/L，单位时间合成t10，c12-CLA量为0.23g/L/h，是对照组的1.2倍。

[0136] 菌体细胞的多次转化可以大大缩短培养菌体的时间，对于工业化应用来说可大大减少发酵周期及发酵成本。