兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1在制备诊断或检测兔脑炎微孢子虫感染试剂中的应用

摘要

本发明公开了兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1在制备诊断或检测兔脑炎微孢子虫感染试剂中的应用。本发明根据NCBI数据库发表的兔脑炎微孢子虫SWP1基因序列设计特异性引物，在感染微孢子的狐狸肾脏样品中，扩增得到的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的SWP1序列。将融合表达的SWP1-GST用于样品的检测，结果表明该融合表达的SWP1-GST蛋白对于检测兔脑炎微孢子虫感染的狐狸血清具有良好的特异性，但与弓形虫，新孢子虫，隐孢子虫感染的阳性血清没有交叉反应。而且研究结果表明使用SWP1蛋白作为检测抗原，其敏感性明显高于用PTP2蛋白作为检测抗原的敏感性。因此，本发明为诊断或检测兔脑炎微孢子虫病提供了一种敏感性更高的方法，从而进一步推动了兔脑炎微孢子虫病的诊断和预防技术的发展。

权利要求

1.兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)孢壁蛋白SWP1在制备诊断狐狸兔脑炎微孢子虫感染试剂中的应用；其中，所述的兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1为与GST融合表达的重组蛋白SWP1-GST，其中兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1与GST融合表达的重组蛋白SWP1-GST是通过以下方法制备得到：(1)根据NCBI数据库发表的兔脑炎微孢子虫SWP1基因序列设计特异性引物，在感染兔脑炎微孢子虫的狐狸肾脏样品中，扩增出编码SEQ ID NO.1所示的孢壁蛋白SWP1的核苷酸序列，或通过序列合成的方法直接合成编码SEQ ID NO.1所示的孢壁蛋白SWP1的核苷酸序列；

(2)从PGEX-4T1载体上扩增得到GST标签序列，并将其插入到PcoldIII载体的NdeI位点中，然后将所扩增或合成得到的SWP1基因序列插入到pColdIII原核表达载体的XhoI和EcoRI位点之间，与GST标签进行融合表达，用GST纯化树脂纯化，即得SWP1-GST。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的编码SEQ ID NO.1所示的孢壁蛋白SWP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

说明书

兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1在制备诊断或检测兔脑炎

微孢子虫感染试剂中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种诊断或检测兔脑炎微孢子虫感染的方法，特别涉及一种以兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1作为抗原，利用ELISA方法诊断或检测兔脑炎微孢子虫的方法，以期提高诊断的敏感性，本发明属于兽类的疾病诊断技术领域。

背景技术

[0002] 兔脑炎微抱子虫病是由兔脑炎微孢子虫（又名兔脑炎原虫，Encephalitozoon cuniculi）引起的1种慢性、隐性或亚临床人畜共患的原虫病。兔脑炎原虫具有广泛的宿主，包括无脊椎动物、啮齿类动物、兔形动物、草食动物、肉食动物和灵长类动物等，已报道的有兔、大鼠、小鼠、豚鼠、野鼠、家犬、牛、狐狸、猪、貂及昆虫（蝉）等，其中家兔的感染率最高，可达76%。人类亦可感染。多数动物通常为隐住感染而不表现临床症状，但可作为传染源而传播疾病，有的可引发致命性疾病。

[0003] 本病广泛分布于世界各地，我国亦有发生本病的报道。近年来，出现了大量有关兔脑炎微抱子虫引起艾滋病患者致死性临床感染的报道，致使该人畜共患病受到医学界的广泛关注和高度重视。

[0004] 动物最容易被侵害的器官是中枢神经和肾脏。对于食肉动物来说，微孢子虫病是新生动物的一种严重神经性疾病，也是圈养狐狸地方性流行病，能够造成很大的经济损失。

[0005] 圈养的狐狸可能通过摄取污染鼠类尿液或者粪便的食物以及垂直传播获得感染。因本病的血清学检测是活体动物或者人类重要的诊断方法，因为通常情况下不可能通过组织学进行检测，而且检测尿液或者粪便病原体敏感性很低。目前已经发表的血清学诊断方法有直接凝集实验，间接免疫荧光和酶联免疫吸附实验。

[0006] 其中酶联免疫吸附试验主要是以细胞培养的虫体破碎后作为抗原的ELISA。但是虫体培养成本很高，而且虫体生长缓慢，纯化虫体和抗原制备过程费力。

[0007] 也有文献报道使用大肠杆菌表达的重组PTP2蛋白或者PTP3蛋白作为诊断抗原但是PTP2蛋白是该虫体极管蛋白，利用重组PTP2蛋白的特异性和敏感性还有待检验。

发明内容

[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种以更敏感的重组蛋白作为抗原，利用ELISA方法检测或诊断兔脑炎微孢子虫病的方法，以期提高诊断的敏感性。

[0009] 为了达到上述目的，本发明采用的技术手段为：

[0010] 本发明根据NCBI数据库发表的兔脑炎微孢子虫SWP1基因序列设计特异性引物，在感染微孢子的狐狸肾脏样品中，扩增出SWP1基因的部分序列（21位氨基酸到终止密码子），通过序列测定分析基因序列。同GB-M1的SWP1序列相比，本发明所扩增得到的SWP1序列有一段重复序列的缺失（序列已提交到Genebank，序列号为KF169728），扩增得到的SWP1序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0011] 将融合表达的SWP1-GST用于样品的检测。结果表明该融合表达的SWP1-GST蛋白对于检测兔脑炎微孢子虫感染的狐狸血清具有良好的特异性，但与弓形虫，新孢子虫，隐孢子虫阳性血清没有交叉反应。而且结果显示SWP1蛋白的敏感性明显高于PTP2蛋白。

[0012] 故本发明申请人提出了兔脑炎微孢子虫（Encephalitozoon cuniculi）孢壁蛋白SWP1在制备诊断或检测兔脑炎微孢子虫感染试剂中的应用。

[0013] 在本发明中，优选的，所述的兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1为与GST融合表达的重组蛋白SWP1-GST，其中兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0014] 在本发明中，优选的，所述的兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1与GST融合表达的重组蛋白SWP1-GST通过以下方法制备得到：

[0015] （1）根据NCBI数据库发表的兔脑炎微孢子虫SWP1基因序列设计特异性引物，在感染兔脑炎微孢子虫的狐狸肾脏样品中，扩增出编码SEQ ID NO.1所示的孢壁蛋白SWP1的核苷酸序列，或通过序列合成的方法直接合成编码SEQ ID NO.1所示的孢壁蛋白SWP1的核苷酸序列；

[0016] （2）从PGEX-4T1载体上扩增GST标签序列，并将其插入到PcoldIII载体的NdeI位点中，然后将所扩增或合成得到的SWP1基因序列插入到pColdIII原核表达载体的XhoI和EcoRI位点之间，与GST标签进行融合表达，用GST纯化树脂纯化，即得SWP1-GST。

[0017] 更优选的，所述的编码SEQ ID NO.1所示的孢壁蛋白SWP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0018] 本发明为诊断或检测兔脑炎微孢子虫病提供了一种敏感性更高的方法，从而进一步推动了兔脑炎微孢子虫病的诊断和预防技术的发展。

附图说明

[0019] 图1为纯化的重组SWP1-GST，PTP2-GST以及GST蛋白的SDS-PAGE分析；

[0020] 1、Marker；2、SWP1-GST；3、PTP2-GST；4、GST；

[0021] 图2为以SWP1-GST为检测抗原通过ELISA检测兔脑炎微孢子虫、弓形虫，新孢子虫以及隐孢子虫阳性血清的结果；

[0022] 图3为分别以SWP1-GST以及PTP2-GST为检测抗原通过ELISA检测狐狸血清样品的结果。

具体实施方式

[0023] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0024] 实施例1重组兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1-GST的制备

[0025] 1、编码重组兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1的核苷酸序列的扩增

[0026] 本发明根据NCBI数据库发表的兔脑炎微孢子虫SWP1基因序列设计特异性引物，在感染微孢子的狐狸肾脏样品中，扩增出SWP1基因的部分序列（21位氨基酸到终止密码子），通过序列测定分析基因序列。同GB-M1的SWP1序列相比，本发明所扩增得到的SWP1序列有一段重复序列的缺失（序列已提交到Genebank，序列号为KF169728），扩增得到的SWP1序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0027] 2、将所扩增得到的序列插入到pColdIII原核表达载体的XhoI和EcoRI位点之间，与GST标签进行融合表达，用GeneScript公司的GST纯化树脂纯化，得到融合蛋白SWP1-GST。同时用同样方法表达GST蛋白和GST蛋白和PTP2蛋白的融合蛋白PTP2-GST。

[0028] 3、纯化后的蛋白经SDS-PAGE分析，结果如图1所示。

[0029] 实施例2重组兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1在诊断或检测狐狸血清中兔脑炎微孢子虫感染中的应用

[0030] 1、待检样品：疑似兔脑炎微孢子虫感染的200份狐狸血清样品、兔脑炎微孢子虫（Encephalitozoon cuniculi）感染的阳性狐狸血清样品3份，弓形虫（Toxoplasma gondii）感染的阳性狐狸血清样品、新孢子虫（Neospora Caninum）感染的阳性狐狸血清样品，隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）感染的阳性狐狸血清样品。

[0031] 2、方法

[0032] （1）将实施例1制备得到的纯化后的融合蛋白SWP1-GST用BCA蛋白浓度试剂盒（Pierce）测定浓度后包被ELISA板（捷特），每孔包被0.1ug，4℃包被过夜。用5%脱脂乳37℃封闭2h后，加入用5%脱脂乳100倍稀释的血清样品，37℃孵育1h。用PBST洗6次之后，加入用5%脱脂乳5000倍稀释的HRP标记的山羊抗狗IgG（Jacson），37℃孵育1h。用PBST洗6次之后，加入TMB底物显色，405nm测定OD值。用实施例1表达并纯化后的GST蛋白和PTP2-GST融合蛋白作为对照。

[0033] （2）结果判定：SWP1-GST及PTP2-GST蛋白包被孔的OD值减去GST蛋白包被孔的OD值即为该样品的实际值。实际值大于0.1的样品判为阳性。

[0034] 3、结果

[0035] 结果表明SWP1-GST蛋白检测狐狸血清具有良好的特异性，和弓形虫，新孢子虫，隐孢子虫阳性血清没有交叉反应，结果如图2所示。

[0036] 应用重组蛋白SWP1-GST以及PTP2-GST包被的ELISA板分别检测200份狐狸血清。结果显示SWP1蛋白的敏感性明显高于PTP2蛋白，结果如图3所示。

[0037] 综上，实验结果表明，通过ELISA方法检测狐狸血清样品，重组SWP1和PTP2蛋白均具有很好的特异性，但是重组SWP1蛋白比PTP2蛋白更为敏感，检出的阳性率较高。