作为抗癌剂的乙酰基丹参酮IIA(ATA)

摘要

本发明涉及式I化合物在制造用于治疗或预防受试者癌症的药物中的用途。

权利要求

1.式I化合物在制造用于治疗或预防受试者的乳腺癌的药物中的用途，包括对所述受试者施以治疗有效量的所述化合物，其中所述乳腺癌是雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌

2.如权利要求1所述的用途，其中所述乳腺癌是雌激素受体阳性/HER2阳性(ER+/HER2+)乳腺癌。

3.如权利要求1或2所述的用途，还包括对所述受试者施以第二抗癌剂。

4.如权利要求3所述的用途，其中所述第二抗癌剂在式I化合物给药之前、同时或之后给药。

5.如权利要求3所述的用途，其中所述第二抗癌剂选自由以下物质组成的组：紫杉醇、阿霉素、赫赛汀、拉帕替尼、吉非替尼、埃罗替尼、他莫昔芬、氟维司群、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、法倔唑及它们的组合。

6.如权利要求1所述的用途，其中所述受试者已在式I化合物给药之前经受过利用不同的抗癌剂或抗癌剂组合的抗癌治疗。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述受试者之前已用抗癌剂治疗，之前所用的抗癌剂选自由以下物质组成的组：选择性雌激素受体调节剂、雌激素受体下调剂、芳香酶抑制剂、HER2抑制剂、蒽环类抗生素及它们的组合。

8.如权利要求7所述的用途，其中所述抗癌剂选自由以下物质组成的组：阿霉素、紫杉醇、赫赛汀、拉帕替尼、吉非替尼、埃罗替尼、他莫昔芬、氟维司群、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、法倔唑及它们的组合。

9.如权利要求1所述的用途，其中所述受试者未被之前的治疗治愈。

10.如权利要求9所述的用途，其中所述受试者已对一种或多种之前给药的抗癌剂产生耐药性。

11.如权利要求1所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物。

12.如权利要求11的用途，其中所述受试者是人。

13.用于抑制细胞中雌激素受体信号传导的方法，包括使有效量的式I化合物与所述细胞接触，其中所述细胞为乳腺癌细胞

14.如权利要求13所述的方法，其中雌激素受体信号传导通过雌激素受体蛋白降解、降低的雌激素受体mRNA水平和/或雌激素受体响应性基因表达的抑制而被抑制。

15.用于降低细胞的HER2表达的方法，包括使有效量的式I化合物与所述细胞接触，其中所述细胞为乳腺癌细胞

16.如权利要求15所述的方法，其中所述细胞是雌激素受体阳性/HER2阳性(ER+/HER2+)乳腺癌细胞。

17.用于诱导细胞的细胞凋亡的方法，包括使有效量的式I化合物与所述细胞接触，其中所述细胞为乳腺癌细胞

18.如权利要求17所述的方法，其中通过产生活性氧物质而诱导细胞凋亡。

说明书

作为抗癌剂的乙酰基丹参酮IIA(ATA)

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2011年4月7日提交的美国临时申请No.61/472,870的优先权的利益，其全部内容据此通过引用合并于此以用于所有目的。

技术领域

[0003] 本发明属于抗癌症治疗的领域，且特别涉及通过使用乙酰基丹参酮IIA(ATA)治疗和预防多种类型的癌症(包括乳腺癌)。本发明还涉及通过使用ATA在细胞中诱导细胞凋亡或干扰雌激素受体信号传导的方法。

背景技术

[0004] 乳腺癌是第二常见的癌症类型，在大多数国家中女性的相关死亡率为仅在2004年就导致全球范围内519,000例死亡。两种主要的乳腺癌类型是雌激素受体(ER)阳性癌(其中ER被过量表达)和HER2阳性癌(其中与正常乳腺组织细胞相比，人表皮生长因子受体2(HER2)被过量表达)(M.Nadji,C.Gomez-Fernandez,P.Ganjei-Azar,A.R.Morales,Immunohistochemistry of estrogen and progesterone receptors reconsidered:experience with5,993breasts.Am J Clin Pathol123(2005)21-27)。大多数的乳腺癌是ER阳性的且需要有一定量的雌激素以促进癌细胞的生长和进展。雌激素与ER结合后改变其构象并导致受体从热激蛋白(HSP)释放，这种释放促进ER由单体形成二聚体。二聚化的ER募集它们的共激活剂以刺激靶基因表达。经该编码的蛋白可促进细胞分裂，导致快速增殖和形成转移(K.A.Green,J.S.Carroll,Estrogen-receptor-mediated-transcription and the influence of co-factors and chromatin state.Nat Rev Cancer7(2007)713-722)(图1)。

[0005] 乳腺癌细胞中HER2受体的过量表达与疾病复发的增加和预后差相关。HER2是细胞膜表面结合的酪氨酸激酶受体；且通常涉及导致细胞生长和分化的信号传导途径。它被一种已知的原癌基因HER2/neu编码。HER2被认为是孤儿受体，没有一个EGF家族的配体能够激活它。然而，其它ErbB家族受体经配体结合而二聚体化，且HER2是ErbB家族的其它成员的优选的二聚化伴侣。

[0006] 目前，用于治疗ER阳性乳腺癌的最常用的药物是他莫昔芬，它可与ER结合并抑制其与受体的共激活剂的结合，因此防止靶基因转录。尽管，他莫昔芬在治疗ER阳性乳腺癌中非常有效，但是它具有一定的局限性。首先，他莫昔芬对约30%的乳腺癌患者是无效的。其次，在治疗经15个月后，在80%的患者中观察到他莫昔芬耐药性(A.Howell,D.DeFriend,J.Robertson,R.Blarney,P.Walton,Response to a specific antioestrogen(ICI182780)in tamocifen-resistance breast cancer.Lancet345(1995)29-30)。第三，临床证据表明过量表达HER2的细胞很有可能对他莫昔芬产生耐药性。尽管已开发了靶定HER2的疗法，包括单克隆抗体曲妥珠单抗和酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼，但是该疗法非常昂贵，且也报道了对这些药物在使用过程中的的耐药性。

[0007] 因此，仍存在着对克服上述已知问题的乳腺癌替代治疗方案的需要。

发明内容

[0008] 本发明是基于下述发明人的发现：乙酰基丹参酮IIA(ATA)可用作抗癌剂且由此具有治疗或预防癌症的作用，特别是针对乳腺癌。由于已意外发现ATA干扰ER信号传导且在雌激素阳性乳腺癌中特别有效，因此ATA提供了可用于治疗对他莫昔芬疗法缺乏响应的癌症的新方法。ATA的有效性已被下述意想不到的发现进一步所证实：ATA也同时干扰HER2的表达。

[0009] 因此，在第一方面，本发明涉及用于治疗或预防受试者癌症的方法，包括对有需要的受试者施以有效量的乙酰基丹参酮IIA(ATA)。乙酰基丹参酮1IA(ATA)的结构在式I中描绘。

[0010]

[0011] 在另一方面，本发明涉及式I化合物在制造用于治疗或预防受试者癌症的药物中的用途。所述用途包括对所述受试者施以治疗有效量的所述化合物。

[0012]

[0013] 在又一方面，本发明涉及用于制造用于治疗或预防受试者癌症的药物的式I化合物

[0014]

[0015] 在多个实施方式中，被治疗或预防的癌症是乳腺癌，优选ER阳性和/或HER2阳性癌。

[0016] 因此，在另一方面，本发明涉及式I化合物在制造用于治疗或预防受试者雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌的药物中的用途。这种用途包括对所述受试者施以治疗有效量的所述化合物。

[0017] 在又一方面，本发明涉及用于抑制细胞中雌激素受体信号传导的方法，包括使有效量的式I化合物与所述细胞接触。

[0018] 在另一方面，本发明涉及用于降低细胞中的HER2水平的方法，包括使有效量的式I化合物与所述细胞接触。

[0019] 在另一方面，本发明涉及用于诱导细胞中的细胞凋亡的方法，包括使有效量的式I化合物与所述细胞接触。

[0020] 此外，本发明在另一个方面涉及用于合成式I化合物的方法，包括以下步骤：

[0021] (a)将丹参酮IIA(1,6,6-三甲基-8,9-二氢-7H-萘并[1,2-g][1]苯并呋喃-10,11-二酮)、醋酸盐和无水锌粉加入至醋酸酐中以提供反应混合物；

[0022] (b)加热所述反应混合物；

[0023] (c)过滤所述反应混合物以去除不溶残留物；

[0024] (d)将水加入至所得滤液并加热所得溶液；

[0025] (e)过滤所得溶液以获得固体的式I化合物。

[0026] 本发明允许乙酰基丹参酮IIA(ATA)作为新抗癌剂的应用。而且，本发明允许ATA在治疗过量表达雌激素受体(ER)和/或人表皮生长因子受体2(HER2)的乳腺癌中的应用。

附图说明

[0027] 与非限制性实施例和附图结合来参考详述将更好地理解本发明，在附图中：

[0028] 图1示意性地例示了ER激活的雌激素依赖性信号传导途径的原理和ATA在抑制ER阳性细胞生长中的作用机理。

[0029] 图2描述了丹参酮IIA(TIIA，C19H18O3)和乙酰基丹参酮IIA(ATA,C23H24O5)的结构。

[0030] 图3显示(A)通过MTT测定，以不同浓度的ATA处理72h后由乳腺癌细胞ER-MDA-MB-231、ER+MCF-7和ER+T47D细胞测量的ATA的生长抑制率。(B)通过免疫印迹分析检测的ERα的蛋白水平。(C)通过MTT测定，以3.13μΜATA处理72h后所测量到的生长抑制率。

[0031] 图4显示通过MTT测定，72h时由ER+乳腺癌MCF-7细胞测量的三种浓度的他莫昔芬和ATA的生长抑制率。

[0032] 图5描述了ATA、HTA和雌激素的结构。

[0033] 图6显示以6μΜATA处理3h后，MCF-7细胞中的ERα的定量免疫染色结果。

[0034] 图7显示(A)以不同化合物处理，不同时间中由活性炭纯化的培养基培养的MCF-7细胞中ERα水平的免疫印迹分析。(B)以6μΜATA处理，不同时间中在正常培养基培养的MCF-7细胞中ERα水平的免疫印迹分析。

[0035] 图8显示(A)以100pM雌激素(E2)或100pM雌激素+6μΜATA处理，不同时间中活性炭纯化的培养基培养的MCF-7细胞中相对ESR1mRNA水平的实时PCR分析。(B)以100pM雌激素、100pM雌激素+6μΜATA或100pM雌激素+6μΜ他莫昔芬处理，24h时活性炭纯化的培养基或正常培养基培养的MCF-7细胞中相对ESR1mRNA水平的实时PCR分析。

[0036] 图9显示(A)以100pM雌激素(E2)或100pM雌激素+6μΜATA处理，不同时间中活性炭纯化的培养基培养的MCF-7细胞中相对GREB1mRNA水平的实时PCR分析。(B)以100pM雌激素、100pM雌激素+6μΜATA或100pM雌激素+6μΜ他莫昔芬处理，24h时正常培养基培养的MCF-7细胞中相对GREB1mRNA水平的实时PCR分析。

[0037] 图10显示通过MTT测定，以(A)不同浓度及(B)3.13μΜ的ATA处理，ER-/HER2-MDA-MB-231、ER+/HER2-MCF-7和ER+/HER2+BT474乳腺癌细胞中测量的ATA的生长抑制率。(C)免疫印迹结果显示三种乳腺癌细胞系中不同水平的ERα和HER2蛋白。β-微管蛋白作为加载对照被探测。

[0038] 图11显示ATA降低乳腺癌BT474细胞中ERα和HER2的水平。氟维司群仅降低ERα，而非HER2。将细胞用6μΜATA或1μΜ氟维司群处理指定的时间并通过免疫印迹分析。

[0039] 图12显示ATA在导致癌细胞死亡方面比TIIA更有效。将四种类型的癌细胞用10μΜ或20μΜ的ATA或TIIA处理且通过MTT测定在添加化合物48h后测量细胞存活率。*p<0.01。

[0040] 图13显示ATA抑制来源于人黑色素瘤MDA-MB-435细胞的异种移植肿瘤在裸鼠中的生长。ATA(▲30mg/kg)、依托泊苷(■ETS,20mg/kg)和对照(o)以3x/周经由腹腔注射到小鼠中。测量五只小鼠的平均肿瘤大小(A)和小鼠体重(B)。

[0041] 图14显示ATA抑制来源于人黑色素瘤MDA-MB-435细胞的异种移植肿瘤在裸鼠中的生长，其中H&E染色揭示肿瘤组织形态学(A和B)。

[0042] 图15显示紫杉醇在浓度范围为1x10-3μΜ至10μΜ时针对HER2阴性MCF-7细胞的生长抑制率比针对过量表达HER2的MCF-7/HER2细胞的生长抑制率高得多，这表明MCF-7/HER2对紫杉醇的耐药性比MCF-7细胞强(A和B)。与它们对紫杉醇的耐药性相比，MCF-7/HER2细胞对ATA表现出略高的灵敏度(C)。

[0043] 图16显示ATA与紫杉醇或阿霉素的组合效应。该效应通过使用MTT测量细胞生长抑制率来确定。(*p<0.01，与用紫杉醇单独处理或用ATA单独处理的细胞相比)。

[0044] 图17显示ATA在癌细胞中诱导半胱天冬酶依赖性细胞凋亡。(A)在ATA处理后观察到细胞核染色体凝缩和断裂。将HeLa细胞用10μΜATA处理24h。将细胞核染色质用DNA染料Hoechst33342染色。比例尺=50μm。(B)半胱天冬酶-3活性在ATA处理后增加。将四种类型的癌细胞用或不用10μΜATA处理48h并且使用体外半胱天冬酶-3活性测定来测量它们的半胱天冬酶-3活性。(*p<0.01)。

[0045] 图18显示ATA诱导癌细胞发生半胱天冬酶依赖性细胞凋亡。(A)通过免疫印迹分析观察到在ATA处理后半胱天冬酶-3的激活和PARP的裂解。将HeLa细胞用10μΜATA处理12、24、36和48h。微管蛋白作为加载对照被探测。(B)泛-半胱天冬酶抑制剂防止ATA诱导的细胞凋亡。将HeLa细胞在添加ATA之前用2μΜ泛-半胱天冬酶抑制剂(z-VAD-fmk)预处理2h。然后加入10μΜ或20μΜATA。24h和48h处理后，在显微镜下对死亡细胞数进行计数。(*p<0.01，与仅用ATA处理的细胞相比)。对照：无任何处理的细胞。

[0046] 图19显示ATA经由线粒体依赖性途径诱导细胞凋亡。Bcl-2的过量表达抑制ATA诱导的细胞凋亡。将用黄色荧光蛋白(YFP)(载体对照)或YFP-Bcl-2(Bcl-2)转染的HeLa细胞用10μΜ或20μΜ的ATA处理。通过在荧光显微镜下细胞计数来确定来自YFP阳性细胞的细胞死亡的百分比。(*p<0.01，与载体对照组相比)。

[0047] 图20显示ATA诱导线粒体膨胀和膜电位损失。将HeLa细胞用10μΜATA处理24h。然后将0.1μΜ荧光染料MitoTracker Red加至细胞以揭示线粒体形态学和膜电位。

[0048] 图21通过免疫荧光染色显示ATA在MDA-MB-435细胞凋亡期间引发Bax转移和细胞色素C释放。抗氧化剂没食子酸丙酯(PG)防止了该情况。ATA和PG的浓度分别为5μΜ和20μΜ。治疗持续时间为24h。比例尺=10μm。

[0049] 图22通过免疫印迹分析显示，在ATA处理后MDA-MB-435细胞中的Bax转移和细胞色素C释放。CY/MT的值表示胞质级分(CY)的积分条带强度与相应的线粒体级分(MT)的积分条带强度的比率。该比率通过对照组标准化。使用两种蛋白作为内部标记来判断细胞分级分离实验的质量：Cox IV用于线粒体，β-微管蛋白主要用于胞质。

[0050] 图23通过使用免疫染色显示，ATA诱导HeLa细胞中的Bax转移和细胞色素C释放。

[0051] 图24显示ATA诱导的细胞凋亡通过HeLa细胞中的Bax转移和细胞色素C释放而引发。在该免疫印迹实验中，使用10μΜATA。数字(h)指示以小时计的处理持续时间。CY/MT的值表示胞质级分的积分条带强度与相应的线粒体级分的积分条带强度的比率。该比率通过对照组标准化。使用两种蛋白作为标记来判断细胞分级分离实验的质量：Cox IV用于线粒体，β-微管蛋白主要用于胞质。

[0052] 图25显示ATA相关的ROS产生导致癌细胞死亡。(A)在用10μΜATA处理2h后使用H2DCFDA检测各种癌细胞系中的ROS产生。数字指示ROS水平与对照相比所增加的倍数。(B)抗氧化剂防止ATA诱导的MDA-MB-435细胞死亡。测试指定浓度的各种抗氧化剂针对ATA诱导的MDA-MB-435细胞死亡的保护效应。首先将细胞用每种抗氧化剂预处理1h，然后在抗氧化剂的存在下将ATA加入到培养基中。通过用于细胞毒性确定的磺酰罗丹明B(SRB)比色测定来测量细胞存活力(*p<0.01)。

[0053] 图26显示与ATA相关的ROS的产生导致癌细胞死亡。(A)PG防止ATA诱导的细胞死亡。测试三种浓度的PG对ATA诱导的细胞死亡的保护效应。通过SRB测定来测量细胞存活率(*p<0.01)。(B)PG保护的ROS产生由ATA处理引起(*p<0.01，与5μΜATA处理相比)。所有实验进行至少三次。该图中所示的结果为三个实验的平均值。误差棒表示标准偏差。比例尺=20μm。

[0054] 图27示意性地例示了ATA在产生ROS和诱导癌细胞凋亡方面的机理。

具体实施方式

[0055] 丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)或者也称为丹参(Danshen)的干燥根在中国通常用来治疗诸如肝炎和心脏病的疾病。目前已从该根分离超过40种脂溶性丹参酮化合物，丹参酮IIA、丹参酮I和隐丹参酮是其中的主要组分。

[0056] 本发明的发明人目前已令人惊讶地发现，通过对丹参酮TIIA(TIIA)化学修饰而获得的乙酰基丹参酮IIA(ATA)(图2)呈现出抗癌效应且因此可用作治疗或预防受试者癌症的抗癌剂。此外，发明人已证实ATA对多种癌细胞系具有较强的细胞毒性，但是对正常非癌细胞(包括乳腺细胞、肌细胞和成纤维细胞)则具有较小毒性。

[0057] 在第一方面，本发明由此涉及用于治疗或预防受试者癌症的方法，包括施以有效量的式I化合物。

[0058]

[0059] 在本发明的该方面的多个实施方式中，所述癌症选自乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、结直肠腺癌、成神经细胞瘤、黑色素瘤和白血病。

[0060] 在本发明的该方面的多个实施方式中，所述癌症是雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌。近年来，在个体化药物和个体化癌症治疗的领域中取得了很大的进展。特别是，已发现每种癌症可能需要专门定制的疗法，这种疗法考虑到癌症中的细胞内分子变化，因为表达水平和蛋白活性的某些偏差可使癌症对特定治疗更加敏感或更具有耐受性。特定亚类的乳腺癌对用ATA的治疗特别敏感(如本文所要求保护的)这一发现由此显得更重要，因为这可有助于避免与其它常规治疗形式诸如他莫昔芬治疗的耐药性有关的问题。

[0061] ATA对缺少细胞色素P4502D6酶的乳腺癌患者尤其有效。这种酶将标准抗ER+乳腺癌药物他莫昔芬转化为其活性代谢物4-羟基-N-去甲基他莫昔芬。在健康欧洲人中，6-10%的个体缺乏CYP2D6。这些患者很难使他莫昔芬转化为4-羟基-N-去甲基他莫昔芬且因此不可从中获取全部疗效。如图4中所示，ATA可在这些患者中被用作替代疗法，因为它在乳腺癌细胞中显示了比他莫昔芬明显更高的生长抑制率。

[0062] 本文所用术语"雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌"是指与正常细胞和未显示雌激素受体水平提高的乳腺癌细胞相比过量表达雌激素受体的乳腺癌细胞。"雌激素受体"或"ER"是指被雌激素17β-雌二醇激活的受体。ER是细胞核受体家族内的成员。雌激素受体的主要功能是作为调节基因表达的DNA结合转录因子。当不存在激素的情况下，雌激素受体被位于细胞核中的热激蛋白(HSP)所螯合。激素与受体的结合引发连锁的多个事件：始于从HSP解离、受体的二聚化和随后受体二聚体与共激活剂的结合。ER/共激活剂复合物然后与DNA中的激素响应成分结合，然后募集负责将下游DNA转录为mRNA的其它蛋白和最终导致细胞功能改变的蛋白。

[0063] 本文所用术语"过量表达"是指比以其非患病状态的相同细胞或组织中相同或相关基因的内源性表达更高的基因表达。在某些实施方式中，与正常的未患病细胞中的水平相比，基因的过量表达导致基因产物的至少1.5倍、2倍或2.5倍增加。

[0064] 本文所用术语"治疗有效量"是指单独或与一种或多种其它活性剂组合治疗或预防给定受试者的雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌所需的式I化合物的量。本领域技术人员认识到，所称的有效量尤其是随着给药路径、赋形剂的使用和与其它活性剂的共用以及年龄、体重、其它疾病和受试者特定副作用而变化。给定情形的治疗有效量可通过常规实验容易地确定且在普通临床医师的技能和判断之内。

[0065] 本文所用的术语"施以(administer)"或"给药(administration)"是指在有或没有另外添加剂诸如药用载体的情况下向有需要的受试者应用各化合物。单独的或与其它物质组合的化合物的给药路径可通过任何医学上可接受的方法来进行，所述方法包括但不限于口服、皮下、肌内、静脉内、动脉内、舌下、含服、直肠给药、经腹膜、经鼻、经皮、经粘膜、阴道、经尿道、离子渗入和通过吸入给药。化合物可以按需以含常规的药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的剂量制剂经肠内(例如，口服或直肠)或胃肠外(例如，通过皮下、静脉内、肌内、胸骨内或腹膜注射或输注技术)给药。该化合物可口服递送，如递送至胃肠道的部分。另外的给药方法为本领域已知。

[0066] 单独的或与其它物质组合的化合物可以固体形式或以液体形式给药。该化合物以片剂、丸剂、粉末混合物、胶囊、颗粒、注射剂、霜剂、溶液、栓剂、灌肠剂、结肠灌注剂、乳液、分散体、食物预混物、动物饲料和以其它适合的形式给药。

[0067] 单独的或与其它物质组合的式I化合物也可被配制成持续释放或延迟释放制剂以及可注射制剂。

[0068] 用于口服给药的液体剂型可包括药学上可接受的乳液、溶液、混悬液、糖浆和酏剂，它们含有本领域常用的惰性稀释剂，诸如水。此类制剂也可包含佐剂，诸如润湿剂、乳化和悬浮剂、环糊精和甜味剂、调味剂以及芳香剂。

[0069] 单独或与其它物质组合的式I化合物给药的频率和持续时间将取决于个体的病状等。可对个体一次或多次施以单独或与其它物质组合的式I化合物，例如2、3、4、5、10、15、20、50、75、100或更多次。可对个体施以该制剂，例如，一天一次，一天两次、一天三次或一天三次以上。也可对个体施以该制剂，例如，一天少于一次，例如，每隔一天一次、每三天一次、每周一次或频率更低。该制剂可给药数天、数周、数月、数年的时间或长期给药，诸如终生给药。对给药的剂量和频率的确定属于主检医生的能力范围内。

[0070] 在本发明的该方面的多个实施方式中，所述癌症是HER2阳性(HER2+)乳腺癌。

[0071] 除过量表达雌激素受体的乳腺癌类型之外，另一亚类的乳腺癌是过量表达人类表皮生长因子受体2(HER2)的乳腺癌。已在近30%乳腺癌中检测到HER2过量表达并且通常发现具有高水平的HER2的患者对他莫昔芬疗法有耐药性。HER2也被称为原癌基因Neu、受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2、CD340或p185。HER2是人类中被ERBB2基因编码的蛋白。它是ErbB蛋白家族成员，所述家族更常称为表皮生长因子受体家族。HER2是细胞膜表面结合的受体酪氨酸激酶且通常涉及导致细胞生长和分化的信号传导途径。HER2被认为是孤儿受体，没有一个EGF家族的配体能够激活它。然而，如上文已公开，ErbB受体经配体结合而二聚化，并且HER2是ErbB家族的其它成员的优选的二聚化伴侣。在临床应用中，HER2/neu作为单克隆抗体曲妥珠单抗(以赫赛汀市售)的靶点是重要的。曲妥珠单抗仅在其中HER2/neu受体被过量表达的的癌症中有效。曲妥珠单抗在与HER2结合后作用的机理之一是通过增加p27(一种停止细胞增殖的蛋白)来发挥作用。抑制HER2和HER3受体的二聚化的另一种单克隆抗体帕妥珠单抗处于临床试验后期。HER2/ERBB2蛋白的表达通过雌激素受体调节。此外，通过雌激素受体起作用的雌二醇和他莫昔芬通常下调HER2/ERBB2的表达。然而，在某亚组的患者中，在存在他莫昔芬的情况下HER2/ERBB2的表达被上调，导致形成他莫昔芬耐药性乳腺癌。

[0072] 本发明的发明人首次说明，ATA在抑制具有高水平HER2的乳腺癌细胞的生长方面更有效。这是有意义的，因为其不仅表明过量表达HER2的乳腺癌亚类对用ATA的治疗特别敏感，而且强调ATA在治疗对他莫昔芬疗法有耐药性的ER过量表达乳腺癌方面的有效性。因此在本发明的某些实施方式中，所治疗的癌症是过量表达雌激素受体以及HER2的乳腺癌(ER+/HER2+乳腺癌)。因此本文所用术语"雌激素受体阳性/HER2阳性(ER+/HER2+)乳腺癌"是指与未显示提高的雌激素受体和人类表皮生长因子受体2两者的水平的乳腺癌细胞或正常乳腺组织细胞相比，过量表达雌激素和人类表皮生长因子受体2(HER2)的乳腺癌细胞。

[0073] 在本发明的多个实施方式中，该方法还包括对受试者施以第二抗癌剂。

[0074] 本文所用术语"第二抗癌剂"是指除式I化合物之外的有效用于治疗或预防癌症(例如由于其快速杀死分裂细胞、抑制或减缓细胞分裂或对抗异常蛋白的能力)的试剂。

[0075] 在本发明的该方面的多个实施方式中，第二抗癌剂在式I化合物给药之前、同时或之后给药。

[0076] 这些不同给药方式，尤其是用于减少副作用并且增加生物利用度和/或患者依从性。

[0077] 在本发明的该方面的多个实施方式中，所述第二抗癌剂选自由以下物质组成的组中：紫杉醇、阿霉素、赫赛汀、拉帕替尼、吉非替尼、埃罗替尼、他莫昔芬、氟维司群、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、法倔唑及它们的组合。在使用此类组合疗法的情况下，所述癌症可以是乳腺癌，例如ER+乳腺癌。

[0078] 在本发明的该方面的多个实施方式中，所述受试者已在式I化合物给药之前经受过利用不同的抗癌剂或抗癌剂组合的抗癌治疗。

[0079] 在本发明的该方面的多个实施方式中，所述受试者之前已用抗癌剂治疗，之前所用的抗癌剂选自由以下物质组成的组中：选择性雌激素受体调节剂、雌激素受体下调剂、芳香酶抑制剂、HER2抑制剂、蒽环类抗生素及它们的组合。在本发明的该方面的多个实施方式中，用于受试者早期治疗的抗癌剂选自由以下物质构成的组合：阿霉素、紫杉醇、赫赛汀、拉帕替尼、吉非替尼、埃罗替尼、他莫昔芬、氟维司群、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、法倔唑及它们的组合。

[0080] 根据本发明的该方面的一个实施方式，所述受试者未被之前的治疗治愈。本文所用术语"未被之前的治疗治愈"是指之前的治疗已证明对特定受试者显示无效的情况，例如，因为受试者未如预期的显示出响应之前的治疗或之前的治疗显示特定受试者中的副作用过于严重以致不能继续治疗。

[0081] 之前的治疗可尤其包括早期化疗，例如通过上文列出的已知抗癌剂之一的治疗，而且还可视为经过放疗和/或手术治疗。

[0082] 在本发明的该方面的多个实施方式中，所述受试者已对一种或多种以前所用的抗癌剂产生耐药性。

[0083] 本文所用的术语"耐药性(resistance)"是指治疗(例如药物)在治愈癌症过程中效率的降低，导致所述治疗不再被认为是有益的或不再被认为是所谈及患者的最佳的可用治疗。

[0084] 在其它实施方式中，本文公开的用ATA的治疗用于与其它癌症治疗策略(诸如手术干预、放疗或用另一种抗癌剂的疗法)的组合，以增强这种常规治疗形式的效力。

[0085] 在本发明的该方面的多个实施方式中，所述受试者是指哺乳动物。

[0086] 在本发明的该方面的多个实施方式中，所述受试者是指人类。

[0087] 在另一方面，本发明涉及式I化合物在制造用于治疗或预防受试者的雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌的药物中的用途。这种用途可包括对所述受试者施以治疗有效量的所述化合物。

[0088] 在本发明的多个实施方式中，所述乳腺癌是雌激素受体阳性/HER2阳性(ER+/HER2+)乳腺癌。

[0089] 在本发明的多个实施方式中，所述用途还包括对所述受试者施以第二抗癌剂。

[0090] 在本发明的多个实施方式中，第二抗癌剂在式I化合物给药之前、或同时给药或之后给药。在本发明的多个实施方式中，所述第二抗癌剂选自由以下物质组成的组：紫杉醇、阿霉素、赫赛汀、拉帕替尼、吉非替尼、埃罗替尼、他莫昔芬、氟维司群、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、法倔唑及它们的组合。

[0091] 本领域技术人员认识到，所有这些制剂是可靠的并且经过充分测试的抗癌剂。

[0092] 在本发明的多个实施方式中，所述受试者已在式I化合物给药之前经受过利用不同的抗癌剂或抗癌剂组合的抗癌治疗。

[0093] 本发明还涵盖式I化合物的用途，其中所述受试者之前已用抗癌剂治疗，之前所用的抗癌剂选自由以下物质组成的组：选择性雌激素受体调节剂、雌激素受体下调剂、芳香酶抑制剂、HER2抑制剂、蒽环类抗生素及它们的组合。在其中所述受试者之前已用抗癌剂治疗的本发明的多个实施方式中，该抗癌剂选自由以下物质组成的组：紫杉醇、阿霉素、赫赛汀、拉帕替尼、吉非替尼、埃罗替尼、他莫昔芬、氟维司群、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、法倔唑及它们的组合。在本发明的多个实施方式中，所述受试者未被之前的治疗所治愈。在本发明的多个实施方式中，所述受试者已对其中之一或多种以前所用的抗癌剂产生了耐药性。

[0094] 类似地，与治疗癌症的方法相关的上文公开的特定实施方式可用于所要求保护的用途。

[0095] 在另一方面，本发明所涉及用于抑制细胞中的雌激素受体信号传导的方法，包括使有效量的式I化合物与所述细胞接触。该方法可为体内或体外方法。关于这一点，"体外方法"是指这样的实施方式，其中细胞不再存在于生物活体中，而例如被培养。

[0096] 在所要求保护的用于抑制细胞中的雌激素受体信号传导的方法的多个实施方式中，雌激素受体信号传导通过使式I化合物与位于细胞核或胞质中的雌激素受体结合而被抑制。因为雌激素是甾体激素，所以它可通过细胞的磷脂膜，因此，受体无需通过膜结合便直接能与雌激素结合。所述结合，例如雌激素与核受体的结合连锁地引发多个事件：始于从热激蛋白解离、受体的二聚化和随后受体二聚体与共激活剂的结合。ER/辅助激活剂复合物然后与DNA中的激素响应成分结合，然后募集负责将下游DNA转录至mRNA的其它蛋白和最终导致细胞功能变化的蛋白。

[0097] 本文所用术语"复合物"是指多蛋白复合物，即，一组两个或更多个相关的多肽链。

[0098] 在本发明的多个实施方式中，通过促进雌激素受体蛋白降解和降低ERα的mRNA水平来下调ERα水平，从而抑制雌激素受体信号传导。降低的ERα蛋白水平然后导致降低的雌激素受体响应性基因表达的水平。

[0099] 本文所述的"水平"涉及给定试剂的浓度。下调蛋白水平可例如通过干扰编码所述蛋白基因的表达或直接靶向该蛋白(例如通过使用中和抗体或降解酶)而发生。下调基因可通过抑制其表达来实现。当用于与基因相关时，术语"水平"一般涉及所述基因的表达水平。当用于蛋白相关时，术语"水平"涉及所述蛋白的浓度，例如细胞浓度。

[0100] 本文所用的术语"蛋白降解"是指通常通过酶经由蛋白水解被直接消化，这使在形成蛋白的多肽链中将氨基酸连在一起的肽键断裂。然而，蛋白降解也可经由断裂肽键的其它机理诸如加热和pH值的变化而发生。

[0101] 本文所用的术语"降低的mRNA水平"是指信使RNA(mRNA)的水平，该水平低于在抑制雌激素受体信号传导之前的水平。

[0102] 本文所用的术语"受体响应性基因表达"是指作为与受体相互作用的结果的基因表达，其中所述基因表达为在合成功能性基因产物中使用来自基因的信息的过程。功能性基因产物通常是指蛋白，但在某些情况下也可以是指RNA分子。

[0103] 在又一方面，本发明涉及用于降低细胞中的HER2表达的方法，包括使有效量的式I化合物与所述细胞接触。

[0104] 本文所用的术语"降低HER2表达"是指HER2(人类表皮生长因子受体2)的水平的降低。.

[0105] 在另一方面，本发明涉及用于在细胞中诱导细胞凋亡的方法，包括使用有效量的式I化合物与所述细胞接触。

[0106] 本文所用术语"细胞凋亡"是指程序性细胞死亡的过程，如本领域技术人员已知和理解的。通常，在细胞凋亡中，生化事件导致特征性细胞变化和死亡。这些变化包括起泡、细胞皱缩、核断裂、染色质凝集和染色体DNA断裂。通常，细胞凋亡产生被称为凋亡小体的细胞碎片，所述凋亡小体能够被吞噬细胞吞食并在细胞内含物能够溢出到周围细胞上且对这些细胞产生损害之前被快速去除。

[0107] 在本发明的多个实施方式中，通过产生活性氧物质而诱导细胞凋亡。

[0108] 本文所用术语"活性氧物质"是指含有氧的化学活性分子。由于存在未配对的价层电子，因此活性氧物质(ROS)是高度活泼的。ROS形成为氧的正常代谢的天然副产物并且在细胞信号传导和体内平衡方面具有重要作用。活性氧物质的实例包括超氧离子和过氧化物。在环境压力(例如，UV或热暴露)期间，ROS水平可急剧增加。这可对细胞结构产生显著性损坏。这蓄积成被称为氧化应激的情况。ROS也通过外源性来源诸如电离辐射而产生。

[0109] 本发明的发明人已发现，ATA诱导ROS产生，可导致癌细胞的细胞凋亡。

[0110] 此外，本发明涉及用于合成式I化合物即ATA的方法，其包括以下步骤：

[0111] (a)将丹参酮IIA(1,6,6-三甲基-8,9-二氢-7H-萘并[1,2-g][1]苯并呋喃-10,11-二酮)、醋酸盐和无水锌粉加入至醋酸酐以提供反应混合物；

[0112] (b)加热所述反应混合物；

[0113] (c)过滤所述反应混合物以去除不溶残留物；

[0114] (d)将水加入至所得滤液并加热所得溶液；

[0115] (e)过滤所得溶液以获得固体的式I化合物。

[0116] 本文所用术语"过滤"是指通过放置仅可通过流体的介质而从流体(液体或气体)分离固体的过程。

[0117] 在本发明的多个实施方式中，所述醋酸盐为碱金属醋酸盐，诸如醋酸钠或醋酸钾。

[0118] 在本发明的多个实施方式中，步骤(b)包括加热至约80-120℃例如100℃，持续数小时，例如约1至5小时、或约3小时。在本发明的该方面的多个实施方式中，步骤(d)包括加热至约80-120℃，例如100℃。

[0119] 在本发明的多个实施方式中，所述方法还包括在95%乙醇中重结晶固体产物。

[0120] 在该方面的一个特定实施方式中，如下合成ATA：

[0121] 将TIIA(2.04g)、醋酸钠(2.5g)、醋酸酐(18ml)和无水锌粉(6g)在沸水浴中搅拌3h，然后立即通过使用真空过滤系统过滤以去除不溶残留物。将滤液用水(300ml)稀释，然后加热至沸腾。将所得溶液在室温下冷却并过滤，得到固体产物(1.80g)。产物可使用95%乙醇进一步结晶以产生最终产物(1.51g)乙酰基丹参酮IIA(ATA)，其化学名称为1,6,6-三甲基-8,9-二氢-10,11-二乙酰氧基-7H-萘并[1,2-g][1]苯并呋喃(图2)。ATA为白色，这完全不同于其初始的红色。ATA在DMSO和PBS中的溶解度为TIIA的22倍。

[0122] 可使用质谱和核磁共振验证化合物的结构。

[0123] 因此，本发明提供可用于治疗癌症的化合物ATA，尤其如下癌症：

[0124] -表达ER的乳腺癌，其占所有病例的60-70%；

[0125] -呈现出高水平的HER2蛋白的乳腺癌，其占所有病例的20-30%；

[0126] -缺乏细胞色素P4502D6酶的乳腺癌患者；

[0127] -针对他莫昔芬治疗未有响应的乳腺癌，这些为所有病例的约30%；

[0128] -产生对他莫昔芬的耐药性的乳腺癌，因为其为在他莫昔芬治疗15个月后约[0129] 80%的所有患者的情况；

[0130] -由于HER2过量表达而产生对他莫昔芬的耐药性的乳腺癌。

[0131] 其它实施方式在下列非限制性实例的范围之内。

[0132] 实施例

[0133] 实施例1：多种癌细胞系中ATA的细胞毒性

[0134] 为了比较各种癌细胞系中ATA的抗癌功效，测量在48h处理后抑制50%细胞生长(IC50)或杀死50%细胞(LC50)的ATA浓度。如表1中证实，ATA显示对来自乳腺癌、宫颈癌、黑色素瘤和白血病的所有六种癌细胞系的广谱的生长抑制和细胞毒性。

[0135] 表1ATA针对各种癌细胞系和非癌细胞系在48h时的IC50和LC50值

[0136]

[0137] 而且，当比较ATA对于癌细胞与非癌细胞在抑制细胞生长方面的效应时，发现ATA针对过量表达HER2/c-erb-2基因产物的乳腺癌SK-BR-3细胞的IC50低得多，为0.29μΜ，而ATA针对来自正常乳腺组织的MCF-10A细胞的IC50明显更高，为6.64μΜ。该结果指示ATA在杀死癌细胞方面比非癌细胞更有效。此外，ATA呈现出比TIIA更强的针对多种癌细胞的生长抑制效应(图12)。

[0138] 实施例2：ATA对裸鼠中肿瘤生长的抑制

[0139] 在通过将人黑色素瘤MDA-MB-435细胞皮下注射到小鼠中而携带实体肿瘤的裸鼠中检查ATA的抗肿瘤效应(图13和图14)。在四星期的时间内监控肿瘤大小和小鼠体重。在该时间内，在注射ATA的小鼠中观察到对肿瘤生长的显著抑制。此外，与对照小鼠相比，注射ATA的小鼠的平均体重并未显著降低，这表明ATA对动物无显著毒性。该结果表明ATA可有效杀死实体肿瘤内的癌细胞。

[0140] 实施例3：ATA对具有高水平HER2的乳腺癌细胞的效应

[0141] 研究了ATA对具有过量表达的HER2蛋白的MCF-7细胞的功效。显示(图15)在-31x10 μΜ至10μΜ的浓度范围内，紫杉醇针对HER2阴性MCF-7细胞的生长抑制率比MCF-7/HER2细胞高得多，这表明这些MCF-7/HER2细胞对紫杉醇的耐药性比MCF-7细胞更高。与观察到的MCF-7/HER2细胞对紫杉醇的耐药性相反，MCF-7/HER2细胞展示出更高的对ATA的灵敏度。详细地，浓度在0.78μΜ至6.25μΜ范围内的ATA对HER2阳性MCF-7细胞产生比HER2阴性MCF-7细胞更高的生长抑制效应。而且，也计算了两种细胞系在72h时ATA的IC50并且数据显示MCF-7细胞的IC50值为1.48±0.24μΜ，显著高于MCF-7/HER2细胞的IC50值(1.0±0.23μΜ)(p=0.019)。该发现表明，ATA在抑制过量表达HER2蛋白的乳腺癌细胞生长方面更有效。

[0142] 实施例4：与紫杉醇组合的ATA

[0143] 本发明的发明人已首次表明，ATA可增加紫杉醇的细胞毒性效应。在试验中(图16)使用5种浓度的ATA(10μΜ、5μΜ、2.5μΜ、1.25μΜ、0.625μΜ)和5种浓度的紫杉醇的(1000nM、100nM、10nM、1nM、0.1nM)。所测量的细胞生长抑制率显示，当紫杉醇以1nM单独作用时，它仅抑制MCF-7约40%的细胞生长。然而，当与2.5μΜATA组合使用紫杉醇时，两种药物一起抑制约89%的细胞生长，这比由2.5μΜ的单独ATA实现的71%生长抑制率显著更高。

[0144] 实施例5：ATA可在癌细胞中激活的细胞凋亡途径

[0145] 本发明的发明人已首次说明，ATA可在癌细胞中激活的细胞凋亡途径。在初步分析期间发现ATA可在HeLa-C3细胞中诱导半胱天冬酶相关的细胞死亡后，使用其它凋亡性测定测试了它在HeLa细胞中的细胞凋亡能力。使用Hoechst33342染色(图17)，在用10μΜATA处理24h的细胞中发现细胞核染色体凝集和断裂。体外半胱天冬酶-3活性测定结果显示，在来自宫颈癌、肝癌、黑色素瘤和白血病的四种不同类型癌细胞中，在ATA处理后，半胱天冬酶-3活性的水平与对照样品相比增加3.1至5.6倍。ATA处理后半胱天冬酶-3的激活通过免疫印迹分析被进一步验证，其中清楚地显示形成了激活的半胱天冬酶-3，以及半胱天冬酶-3底物蛋白PARP裂解成其更小的片段(图18)。最后，发现ATA诱导的细胞死亡可通过用2μΜ泛-半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk处理细胞来抑制。由于染色质凝集、DNA断裂和半胱天冬酶-3激活已被认为是在凋亡性细胞死亡期间发生的标志性事件，结论是ATA可通过诱导细胞凋亡杀死癌细胞。

[0146] 实施例6：ATA可激活Bax介导的细胞凋亡途径

[0147] 随后发现ATA可激活Bax介导的线粒体依赖性细胞凋亡途径。众所周知的是，细胞凋亡可主要通过两种途径来激活：死亡受体途径(外在途径)、或线粒体依赖性途径(内在途径)。两种途径可汇聚于线粒体以促进凋亡因子诸如细胞色素C、Smac、AIF、EndoG和HtrA2/Omi的释放，这些凋亡因子可激活下游靶点以触发细胞死亡(X.Wang,The expanding role of mitochondria in apoptosis.Genes&Development15(2001)2922-293)。

[0148] 为了区分ATA主要使用哪种途径来激活细胞凋亡，检查了Bcl-2(一种能够阻断线粒体依赖性细胞凋亡的抗凋亡蛋白)的过量表达是否可明显抑制ATA诱导的细胞死亡。将用YFP-Bcl-2或YFPHeLa转染的细胞仅用10μΜ或20μΜATA处理。在处理24h或48h后，通过在荧光显微镜下对活着(以正常细胞形态学附接)的或死亡(以收缩形态学分离)的荧光阳性细胞的数量进行计数，来计算每个样品中细胞死亡的百分比。在ATA处理后，来自过量表达Bcl-2的细胞的细胞死亡的百分比显著低于具有正常Bcl-2水平的细胞(图19)。这种Bcl-2对ATA诱导的细胞死亡的明显保护效应支持ATA可经由线粒体依赖性途径诱导细胞凋亡的概念。

[0149] 接下来检查了ATA是否可通过引起线粒体损伤以释放那些促凋亡因子来激活细胞凋亡。为了测试，使用线粒体-选择性染料Mito Tracker Red在HeLa细胞中观察了ATA处理后的线粒体形态学变化。发现在ATA处理后，一些线粒体改变它们的丝状染色模式以形成聚集物；而一些线粒体失去它们的红色荧光，暗示线粒体受损(图20)。然后研究Bax是否涉及ATA相关的线粒体损伤。据详细报道，在线粒体依赖性细胞凋亡期间，Bax可从胞质转移至线粒体并且形成孔以使线粒体的外膜可渗透，导致细胞色素C的释放。细胞色素C然后与Apaf-1结合以在dATP的存在下激活半胱天冬酶-9酶原，导致半胱天冬酶-3激活和凋亡性细胞死亡(D.M.Finucane,E.Bossy-Wetzel,N.J.Waterhouse,T.G.Cotter,D.R.Green,Bax-induced caspase activation and apoptosis via cytochrome c release from mitochondria is inhibitable by Bcl-xL.J Biol Chem274(1999)2225-2233)。

[0150] 首先使用免疫荧光染色来检查在ATA诱导的细胞凋亡期间Bax和细胞色素C的亚细胞定位变化。这揭示在用5μΜATA处理MDA-MB-435细胞24h后，观察到Bax从胞质转移至线粒体以形成聚集物；与此同时，细胞色素C从线粒体释放到胞质以产生扩散的染色模式(图21)。然后使用基于细胞分级分离的免疫印迹分析来确认该发现(图22)。结果显示，在用5μΜATA处理24h的来自MDA-MB-435细胞的胞质级分中Bax水平减少，但是其线粒体部分中的Bax水平增加。胞质中的Bax水平与线粒体中的Bax水平的比率在24h时从1.0降至<0.1。对细胞色素C观察到相反的现象，其中细胞色素C在线粒体级分中的水平下降，但是在胞质中的水平增加。ATA处理后，在24h时胞质中的细胞色素C水平与线粒体中的细胞色素C水平的比率从1.0增至7.5。在用ATA处理的HeLa细胞中观察到相同的现象(图23和图24)。这些结果指示，ATA可经由涉及其下游靶点细胞色素C的Bax介导的线粒体依赖性途径诱导细胞凋亡。

[0151] 实施例7：ATA诱导ROS产生

[0152] 为了研究ATA如何在各种癌细胞中触发细胞死亡，使用荧光染料H2DCFDA测量各种癌细胞中的ROS水平，所述荧光燃料的荧光强度随ROS水平的升高而增加。结果显示，各种细胞系在添加ATA前具有不同的ROS基线水平，它们的ROS水平在ATA处理后增加4.3至9.9倍(图25A)。

[0153] 由于在所有六种被检查的细胞系中均检测出ROS的产生以及其仅在添加ATA后2h发生(比Bax转移快至少4-6h)，推测ATA介导的ROS产生可能是细胞死亡的原因。如果这种假定正确，则ROS的消除应该能够在添加ATA后防止细胞死亡和Bax转移。为了测试该假设，将MDA-MB-435细胞用不同种类的抗氧化剂预处理1h，所述抗氧化剂包括20μΜ没食子酸丙酯(PG)、1mM谷胱甘肽(GSH)、100μΜ丁基羟基茴香醚(BHA)和1mM N-乙酰基半胱氨酸(NAC)。之后将ATA分别以5μΜ和10μΜ加入到细胞中。使用SRB细胞毒性测定测量ATA处理24h后细胞死亡的百分比。结果显示，抗氧化剂PG可显著增加细胞对5μΜATA的存活力，从35%至近68%。此外，定量分析揭示，在MDA-MB-435细胞中20μΜ PG足以显著防止5μΜATA诱导的细胞死亡(图25B)。

[0154] 进一步测试，PG是否可在ATA处理后预防ROS产生。发现MDA-MB-435细胞中生成高水平的ROS，在添加ATA2h时到达最高水平。并且通过用20μΜPG预处理细胞，完全防止了这种ATA诱导的ROS水平增加(图26)。而且，免疫荧光染色(图21)和免疫印迹分析(图22)的结果显示PG可有效地防止经ATA处理的MDA-MB-435细胞中的Bax转移和细胞色素C释放。总之，该数据显示ATA可通过产生活性氧物质来诱导Bax介导的线粒体依赖性细胞凋亡(图27)。

[0155] 实施例8：癌细胞系和正常细胞中ATA的细胞毒性

[0156] 评估癌细胞系和正常细胞中ATA的细胞毒性。为此，评价72h时多种癌细胞系或正常细胞系(包括肌细胞和成纤维细胞)中ATA的IC50。如表2中所示，ATA在来自宫颈癌、肺癌、结肠癌、肝癌、成神经细胞瘤和白血病得到的癌细胞中具有较低的IC50，但是在非癌细胞(包括来自肌肉的成肌细胞和来自肺组织的成纤维细胞)中具有相对更高的IC50。

[0157] 表272h时ATA针对各种癌细胞系或非癌细胞系的IC50

[0158]细胞类型 器官 IC50(μM)
HeLa 宫颈癌细胞 0.69±0.19
A549 肺癌细胞 0.81±0.13
SK-N-SH 成神经细胞瘤 1.24±0.12
K-562 白血病细胞 1.69±0.34
HCT15 结直肠腺癌 0.56±0.08
HCT116 结直肠腺癌 2.28±0.49
Caco2 结直肠腺癌 2.50±0.45
HepG2 肝癌细胞 4.27±0.73
C2C12(非癌性) 成肌细胞(正常肌肉细胞) 10.15±1.44
IMR-90(非癌性) 成纤维细胞(正常肺细胞) 15.54±0.71

[0159] 实施例9：ATA对不同乳腺癌细胞的效应

[0160] 令人惊讶的是，发现ATA所示的对ER阳性乳腺癌细胞诸如MCF-7和T47D的生长抑制效应比ER阴性乳腺癌细胞诸如MDA-MB-231高得多(图3)。72h时ATA的IC50值在ER阳性和ER阴性细胞之间低约5.4-5.7倍，这表明了ATA针对ER阳性乳腺癌细胞的选择性生长抑制能力(表3)。

[0161] 表372h时ATA对ER+和ER-乳腺癌细胞的IC50值

[0162]

[0163] 此外，图3C的结果也显示，ATA在抑制ER+乳腺癌细胞增殖方面更有特异性，但对正常细胞(包括肌细胞C2C12和成纤维细胞IMR-90细胞)具有较低毒性。

[0164] 实施例10：ATA相比于他莫昔芬的功效

[0165] 他莫昔芬(乳腺组织中的雌激素受体的拮抗剂，经由其活性代谢物4-羟基他莫昔芬和4-羟基-N-去甲基他莫昔芬起效)是绝经前女性的激素受体阳性乳腺癌的常见内分泌(抗雌激素)疗法，并且也是绝经后女性的标准疗法，尽管芳香酶抑制剂也常用于这种情况。因此，为了评价ATA用于乳腺癌疗法的功效，将其对ER阳性MCF-7细胞的抗癌功效与他莫昔芬相比。图4显示，ATA在三种所测试的药物浓度下呈现出57%至74%更高的生长抑制率。该结果经由比较两种药物的对两种ER阳性乳腺癌细胞系的IC50值来确认。如表4所示，抑制50%ER阳性细胞生长所需的ATA比他莫昔芬低6.7倍。

[0166] 表472h时ATA和他莫昔芬对不同乳腺癌细胞的IC50值

[0167]

[0168] 实施例11：ATA的代谢产物

[0169] 为了发现ATA的分子靶标，确定在ATA进入细胞后的其代谢产物。通过使用LC-MS分析，在将ATA加入MCF-7细胞2h内检测出氢醌TIIA(HTA)的出现。一种可能的HTA形成机理是在ATA进入细胞后其乙酰基被细胞中富含的酯酶去除(图5)：

[0170] 实施例12：ATA可在乳腺癌MCF-7细胞中引起ERα降解

[0171] 存在两种不同的雌激素受体形式，通常被称为α和β，每种形式被单独的基因(分别为ESR1和ESR2)编码。激素激活的雌激素受体形成二聚体，并且由于两种形式在很多细胞类型中共表达，受体可形成ERα(αα)或ERβ(ββ)均二聚体或ERαβ(αβ)异二聚体。雌激素受体α和β显示出显著的整体序列同源性，并且两者由五个结构域(从N-端至C-端列出；氨基酸序列数是指人ER)：(A-F结构域)组成。

[0172] 因此，使用免疫染色检查ATA处理后在MCF-7细胞中ERα的蛋白水平。观察到，在已于活性炭纯化的培养基中培养4天的对照细胞中，ERα主要位于细胞核中(图6A)。用6μΜATA处理后3小时，细胞核中ERα的水平大幅减少，这可能是由于蛋白降解(图6B)。
然而，胞质中的荧光强度在ATA处理后保持不变(图6C)。该结果指示，ATA可诱导MCF-7细胞中细胞核部分的ERα降解。

[0173] 随后，使用免疫印迹分析来确认这种预测。图7A中的数据显示，ERα的总蛋白水平在ATA处理4h时略微减少且在8h后显著减少，这比他莫昔芬诱导ERα降解的时间快得多。为了确保在生理条件下ATA在MCF-7细胞中产生类似效应，使用免疫印迹来测定在用或不用ATA处理的情况下正常培养基培养的MCF-7细胞中ERα的蛋白水平。如图7B中所示，24和48h时ATA在乳腺癌MCF-7细胞中显著降低ERα蛋白水平。

[0174] 实施例13：ATA对雌激素受体1基因（ESR1）的效应

[0175] 在下一步骤中，使用实时PCR的方法检查ATA是否可影响ESR1(雌激素受体1)的mRNA水平，ESR1为ERα蛋白编码基因。测量非ERα响应性基因GAPDH的mRNA水平且其用作参考。于活性炭纯化的培养基中培养的MCF-7细胞被用作0h样品的对照。MCF-7细胞用100pM雌激素(E2)或100pM雌激素加6μΜATA处理1、4、12、24、36和48h。如图8A中所示，在6μΜATA处理12h后，ESR1mRNA的水平降至对照组的55%。并且在ATA处理24h后，ESR1mRNA的水平降至对照组的31%。这种ATA减少效应可维持在36h和48h时，并且使ATA处理组的ESR1mRNA水平保持在对照组的约50%。而且，将在正常培养基培养的MCF-7细胞中ATA降低ESR1mRNA水平的能力与他莫昔芬相比，如图8B中所示，在正常培养基培养的MCF-7细胞中，ATA使ESR1mRNA水平显著降至对照组的约30%，这与于活性炭纯化的培养基中培养的MCF-7细胞中观察到的降低水平相类似。然而，在活性炭纯化的培养基培养的MCF-7细胞中，他莫昔芬仅使相对ESR1水平降至对照的约70%。并且在正常培养基培养的MCF-7细胞中，他莫昔芬与对照相比仅略微降低ESR1mRNA水平(图8B)。总之，这些结果显示出，ATA不仅引起ERα蛋白降解，还降低了人类乳腺癌MCF-7细胞中的ESR1mRNA表达。

[0176] 实施例14：ATA对ER响应性基因GREB1的效应

[0177] 由于ER是转录因子，其降解应能直接影响mRNA从ER响应性基因的产生。为了测试这种预测，使用实时PCR测量GREB1的mRNA水平(通过乳腺癌1中的雌激素进行生长调节)，GREB1是ER调节途径的早期雌激素响应性基因。

[0178] 为此，测量非ER调节基因GAPDH的mRNA水平并用其作为参考。将于活性炭纯化的培养基中培养的MCF-7细胞用作为对照。将MCF-7细胞用100pM雌激素(E2)或100pM雌激素加6μΜATA处理1、4、12、24、36和48h。如图9A中所示，用雌激素处理MCF-7细胞4h使GREB1mRNA水平增至对照的11.3倍。然而，这种雌激素诱导的GREB1转录的增加通过ATA处理明显降低6.4倍。观察到在ATA处理12h后GREB1mRNA水平更显著降低(从30.8倍至7.9倍)。类似于在下列时间点，ATA有效地抑制雌激素诱导的GREB1基因转录。

[0179] 此外，比较ATA与他莫昔芬减少在正常培养基培养的MCF-7细胞中ERα-响应性基因GREB1表达的效应。如图9B中所示，100pM雌激素(E2)使GREB1mRNA水平增至对照的1.69倍。6μΜ时的ATA有效地抑制雌激素诱导的GRBE1水平增加，甚至进一步使GREB1水平降至对照组的约50%。因此ATA的这种抑制效应也可与他莫昔芬相媲美。因此，总体的结论是，ATA对ER阳性乳腺癌细胞的强抑制效应可归因于ATA诱导的ERα降解以及ESR1mRNA的减少和后续对ERα-响应性基因表达的抑制。

[0180] 实施例15：ATA对ER阳性/HER2阳性乳腺癌细胞的效应

[0181] 令人惊讶的是，还发现ATA显示了对BT474乳腺癌细胞(其在非常高水平的HER2蛋白下为ER阳性)的生长抑制效应非常显著(图10C)。发现ATA在HER2+中所示的生长抑制效应比在HER2-细胞中要强得多(图10A)。具体地，3.13μΜ的ATA的生长抑制率由双阴性231细胞中的32.3%增至HER2-MCF-7细胞中的94.7%并且在HER2+BT474细胞中达到最高水平，为146.3%(图10B)。该结果表明，ATA对ER+/HER2+乳腺癌细胞具有明确的生长抑制能力。此外，在ER+/HER2+乳腺癌BT474细胞中ATA的IC50值减至1.0μΜ，这比他莫昔芬的IC50值(6.20±0.10μΜ)要低6.2倍。最终，我们发现ATA可降低在过量表达HER2的人乳腺癌BT474细胞中HER2蛋白的水平(图11)。综合起来，以上的结果显示ATA在抑制这两种类型的乳腺癌(在ER中呈阳性的和/或在HER2蛋白中过量表达的乳腺癌)的生长方面远比他莫昔芬更为有效。

[0182] 本文引用的所有文献的内容通过引用以其整体并入。

[0183] 本文例示性描述的本发明可在不存在本文未明确公开的任何(一种或多种)元件、(一种或多种)限制的情况下适合地实施。因此，例如，术语"包含"、"包括"、"含有"等应被扩展性地且无限制地理解。此外，本文所用的术语和表述作为描述方式且不限制地使用，并且在使用这些术语和表述中并不旨在排除所示且所述的特征或其部分的任何等效体，但是应认识到各种修改均在所要求保护的本发明的范围之内。因此，应被理解为，尽管本发明已由优选的实施方式明确公开，但是本领域技术人员可采用本文公开的本发明的修改和变更，并且这些修改和变更被认为是在本发明的范围之内。

[0184] 已在本文广义地且一般地描述本发明。属于通用公开的范围的每种较窄的物种和亚属分组也形成本发明的一部分。这包括在从该属排除任何主题的附带条件或否定限制下本发明的通用描述，不论所排除的内容是否明确述于本文中。其它实施方式均在下列权利要求中。此外，在本发明的特征或方面以马库什组的方式描述的情况下，本领域技术人员应明白，本发明由此也以任何单独的成员或马库什组的成员的亚组的方式描述。