一种禽流感H9亚型灭活疫苗及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种禽流感H9亚型灭活疫苗，由2株H9亚型禽流感病毒经灭活后和油佐剂混合组成，2株H9亚型禽流感病毒分别为HZ株和FJ株，HZ株的HA基因序列如SEQ ID NO:1所示，FJ株的HA基因序列如SEQ ID NO:2所示。其通过制备H9亚型禽流感病毒HZ株毒液和FJ株毒液，灭活H9亚型禽流感病毒HZ株毒液和FJ株毒液，制备油相溶液，制备水相溶液以及乳化制得。本发明利用2株不同地方分离的H9亚型禽流感毒株制备一种免疫原性强、交叉保护性好的灭活疫苗，能够应用于预防鸡H9亚型禽流感疾病中。该疫苗接种鸡后，抗体效价高，使得鸡对不同地方流行的H9亚型毒株攻毒保护力好，并且安全性高、效力稳定。

权利要求

1.一种禽流感H9亚型灭活疫苗，其特征在于：由2株H9亚型禽流感病毒经灭活后和油佐剂混合组成，2株H9亚型禽流感病毒分别为HZ株和FJ株，其保藏登记号分别为CGMCC：

8355和CGMCC：8354，HZ株的HA基因序列如SEQ ID NO:1所示，FJ株的HA基因序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种权利要求1所述的禽流感H9亚型灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：-4

1)制备H9亚型禽流感病毒HZ株毒液：将H9亚型禽流感病毒HZ株用生理盐水作10稀释，接种9～11日龄SPF鸡胚，无菌收获24～96小时内死亡及96小时后仍存活的HA≥8log2的鸡胚尿囊液作为H9亚型禽流感病毒HZ株毒液；

-4

2)制备H9亚型禽流感病毒FJ株毒液：将H9亚型禽流感病毒FJ株用生理盐水作10稀释，接种9～11日龄SPF鸡胚，无菌收获24～96小时内死亡及96小时后仍存活的HA≥8log2的鸡胚尿囊液作为H9亚型禽流感病毒FJ株毒液；

3)灭活H9亚型禽流感病毒HZ株毒液：在HZ株毒液中加入终浓度为0.2％甲醛溶液，

37℃摇床灭活24小时；

4)灭活H9亚型禽流感病毒FJ株毒液：在FJ株毒液中加入终浓度为0.1％甲醛溶液，

37℃摇床灭活24小时；

5)制备油相溶液：将白油和司本-80按照体积比为18～20:1混合均匀，加热溶解后经121℃灭菌20分钟；

6)制备水相溶液：将灭活的HZ株毒液和灭活的FJ株毒液按照体积比为6：4混合均匀，加入占混合毒液体积比0.75％的高压灭菌的吐温-80，用磁力搅拌器混匀搅拌至吐温完全溶解；

7)乳化：将油相溶液和水相溶液按照体积比为1～2:1混合均匀，在乳化搅拌机中搅拌，即制成所述禽流感H9亚型灭活疫苗。

3.根据权利要求2所述的一种禽流感H9亚型灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤

5)中的白油和司本-80按照体积比为18.5:1混合。

4.根据权利要求2所述的一种禽流感H9亚型灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤

7)中的油相溶液和水相溶液按照体积比为1.5:1混合。

5.一种如权利要求1所述的禽流感H9亚型灭活疫苗在制备预防鸡禽流感疾病的药物中的应用。

说明书

一种禽流感H9亚型灭活疫苗及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于动物用生物制品技术领域，具体涉及一种禽流感H9亚型灭活疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 禽流感（Avian Influenza，AI），是由流感病毒属的A型流感病毒引起的禽类感染和疾病的总称。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染，而对家养的鸡和火鸡引起的危害最为严重，候鸟、观赏鸟、散禽携带病毒迁徙可能是禽流感世界性流行的主要原因，猪等也可作为“混合器”传播本病。

[0003] 根据禽流感病毒AIV对禽类致病性的差异，可将AIV分为高致病性禽流感病毒（HPAIV）和低致病性禽流感病毒（LPAIV）。H9亚型禽流感属于低致病性流感病毒，是目前我国鸡群中存在的AIV主要亚型，该病毒发病后虽然致死率不高（一般不超过30%），但常导致呼吸道症状，蛋鸡的产蛋下降，并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病，影响家禽生产性能。目前其流行特点是：H9亚型仍是当前流行的主要亚型；H9亚型已发生变异；H9亚型成散发或地方性流行；H9亚型呈现出条件性致病的特性；H9亚型对肉仔鸡危害日益严重。

[0004] AIV遗传变异极为频繁，血清亚型众多。研究发现，AIV可通过基于的点突变、基因重组和节段重排而发生不同程度的变异，从而使流感病毒的抗原性和致病性发生改变。AIV的变异主要发生在HA和NA基因上，尤其是HA基因，其分子机理主要有：抗原漂移、抗原转变、RNA重组和缺损性病毒颗粒的产生等。近些年，随着反向遗传学的发展，禽流感遗传变异和其机制逐步得到证实。 就H5亚型而言，根据当前H5亚型的变异情况，采用反向遗传技术获得了Rec-1、Rec-4、Rec-5和Rec-6疫苗株，在高致病性禽流感的防控方面取得了一定的成绩。关于H9亚型的变异研究也一直在进行中。刘岩对1998-2002年间分离的H9亚型禽流感病毒的抗原性变异进行了研究，经交叉HI试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验、交叉攻毒保护试验及HA基因分析，证明了H9亚型禽流感病毒已经发生了抗原性漂移。而姜北宇等人的研究则表明，1998-2008年在北京及河北省分离的4株H9亚型禽流感流行毒株间大多产生了较好的交叉保护力，用1998-2006年分离的流行毒株制备的灭活疫苗能够保护2008年流行毒株的攻击。可见，对于H9亚型禽流感病毒流行毒株抗原性是否发生变异的问题，不同报道得出的试验结论存在较大的差异。

[0005] 疫苗免疫仍是目前防控H9亚型禽流感有效办法之一。随着H9亚型禽流感灭活疫苗单苗或者联苗的广泛应用，近些年来，在免疫压力的作用下，开始出现以前使用的疫苗毒株对现地分离毒株的免疫保护力下降，许多养殖单位根据自身免疫需要纷纷采用现地流行毒株制成灭活疫苗来防控H9亚型禽流感的发生，但这些疫苗不能正规生产、销售和大面积推广，并且不能保证其安全性。因此，针对疫病现在的流行特点，重新筛选安全、有效、稳定的禽流感H9亚型病毒株制备H9亚型灭活疫苗显得非常必要。

发明内容

[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用2株不同地方分离的H9亚型禽流感毒株制备成一种免疫原性强、交叉保护性好的灭活疫苗，用于预防鸡H9亚型禽流感。

[0007] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

[0008] 一种禽流感H9亚型灭活疫苗，由2株H9亚型禽流感病毒经灭活后和油佐剂混合 组成，2株H9亚型禽流感病毒分别为HZ株和FJ株，其保藏登记号分别为CGMCC NO.8355和CGMCC NO.8354；HZ株的HA基因序列如SEQ ID NO:1所示，FJ株的HA基因序列如SEQ ID NO:2所示。HZ株和FJ株于2013年10月15日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该中心于2013年10月18日收到上述保藏菌株，保藏日期为2013年10月18日，该中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。

[0009] 一种禽流感H9亚型灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

[0010] 1）制备H9亚型禽流感病毒HZ株毒液：将H9亚型禽流感病毒HZ株用生理盐水作-410 稀释，接种9～11日龄SPF鸡胚，无菌收获24～96小时内死亡及96小时后仍存活的HA≥8log2的鸡胚尿囊液作为H9亚型禽流感病毒HZ株毒液；

[0011] 2）制备H9亚型禽流感病毒FJ株毒液：将H9亚型禽流感病毒FJ株用生理盐水作-410 稀释，接种9～11日龄SPF鸡胚，无菌收获24～96小时内死亡及96小时后仍存活的HA≥8log2的鸡胚尿囊液作为H9亚型禽流感病毒FJ株毒液；

[0012] 3）灭活H9亚型禽流感病毒HZ株毒液：在HZ株毒液中加入终浓度为0.2%甲醛溶液，37℃摇床灭活24小时；

[0013] 4）灭活H9亚型禽流感病毒FJ株毒液：在FJ株毒液中加入终浓度为0.1%甲醛溶液，37℃摇床灭活24小时；

[0014] 5）制备油相溶液：将白油和司本-80按照体积比为18～20:1混合均匀，加热溶解后经121℃灭菌20分钟；

[0015] 6）制备水相溶液：将灭活的HZ株毒液和灭活的FJ株毒液按照体积比为6：4混合均匀，加入占混合毒液体积比0.75%的高压灭菌的吐温-80，用磁力搅拌器混匀搅拌至吐温完全溶解；

[0016] 7）乳化：将油相溶液和水相溶液按照体积比为1～2:1混合均匀，在乳化搅拌机中搅拌，即制成所述禽流感H9亚型灭活疫苗。

[0017] 作为本发明的进一步技术方案，步骤5）中的白油和司本-80按照体积比为18.5:1混合。

[0018] 作为本发明的进一步技术方案，步骤7）中的油相溶液和水相溶液按照体积比为1.5:1混合。

[0019] 一种禽流感H9亚型灭活疫苗在预防鸡禽流感疾病中的应用。

[0020] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：利用2株不同地方分离的H9亚型禽流感毒株制备成一种免疫原性强、交叉保护性好的灭活疫苗，用于预防鸡H9亚型禽流感。该疫苗接种鸡后，抗体效价高，使得鸡对不同地方流行的H9亚型毒株攻毒保护力好，并且安全性高、效力稳定。

[0021] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

[0022] 图1为黄鸡免疫HZ-FJ株灭活疫苗后的禽流感H9亚型血清抗体水平变化；

[0023] 图2为竹丝鸡免疫HZ-FJ株灭活疫苗后禽流感H9亚型血清抗体水平变化。

具体实施方式

[0024] 实施例1：H9亚型禽流感病毒HZ株和FJ株的生物学特性研究

[0025] 本发明所述的H9亚型禽流感病毒HZ株和FJ株分别是2010年在我国浙江湖州地区和福建莆田地区发病鸡场的发病鸡群采集的病料中分离到的，经测序鉴定，都为禽流感病毒H9亚型。其生物学特性研究如下：1）毒种传代：HZ株、FJ株原代种毒（E1代）用灭菌-4生理盐水稀释至10 ，经尿囊腔内接种9日龄SPF鸡胚，每胚0.2mL，于37℃继续孵育96小时，收获24～96小时内死亡及存活 的鸡胚，冻存过夜后逐个收获鸡胚液并检测其HA效价，将检验无菌且HA效价≥8log2的鸡胚液混合，定量分装，注明收获日期、毒种代次等，标记为E2代，留取少量继续传代，其余的置-70℃保存备用。按上述方法连续在SPF鸡胚内传代至第8代（E8代），每一代分别测定各胚的HA效价及其平均数，结果详见表1。

[0026] 表1 毒株E1～E8代的HA效价

[0027]

[0028] 试验结果显示，2株AIV H9亚型毒株在传代过程中HA效价都相当稳定，HA效价平均值均保持在8log2以上，说明HZ株和FJ株均可在鸡胚上稳定地复制传代。

[0029] 2）病毒特异性：按“中国兽药典”HI试验方法，HZ株、FJ株病毒液分别配制4单位抗原，然后用ND、EDS、AIV H5、AIV H7和AIV H9标准阳性血清进行HI试验，结果详见表2。

[0030] 表2 毒株特异性试验结果

[0031]

[0032] 注：本发明中的ND、EDS、AIV H5、AIV H7、AIV H9标准阳性血清和抗 原购自中国兽药监察所和哈尔滨兽医研究所。

[0033] 试验结果显示，HZ株和FJ株毒液凝集鸡红细胞的特性均能被H9亚型禽流感阳性血清特异性中和，不能被ND、EDS和AIV H7阳性血清中和；与AIV H5阳性血清有极微弱的反应，可以忽略；结果表明HZ株和FJ株病毒液均具有很强的病毒特异性。

[0034] 3）病毒的免疫原性：（1）HZ株的免疫原性：将HZ株的E8代毒种分别制成油乳剂灭活疫苗，颈部皮下注射免疫21日龄SPF鸡10只，每只0.3mL，同时设条件相同的对照SPF鸡5只。免疫21日后，连同对照组采集鸡血清检测AIV H9亚型HI抗体，然后各静脉注射6
HZ株病毒液0.2mL（含2×10EID50）。攻毒后第5日，采集每只鸡喉头棉拭子，分别尿囊腔内接种9～10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2mL，37℃孵育96小时，检测所有鸡胚液HA效价。
每个棉拭子样品接种的鸡胚中，只要有1枚鸡胚的HA效价≥4log2，即可判为病毒分离阳性，对病毒分离阴性的样品，盲传一代后再进行判定，结果详见表3。

[0035] 表3 HZ株病毒的免疫攻毒试验结果

[0036]

[0037] 试验结果显示，免疫鸡的HI抗体几何平均值为9log2，而对照鸡HI抗体均为0；攻毒后，免疫组鸡病毒分离阴性率为9/10，而对照组鸡病毒分离阴性率为0/5；表明HZ株具有很好的免疫原性。

[0038] （2）FJ株的免疫原性：检测方法同HZ株的检测方法，结果详见表4。

[0039] 表4 FJ株病毒的免疫攻毒试验结果

[0040]

[0041] 试验结果显示，免疫鸡的HI抗体几何平均值为8.4log2，而对照鸡HI抗体均为0；攻毒后，免疫组鸡病毒分离阴性率为9/10，而对照组鸡病毒分离阴性率为0/5；表明FJ株具有较好的免疫原性。

[0042] 4）病毒HA基因的序列分析：参考已发表的H9亚型AIV序列资料，设计并合成了AIV HA基因的RT-PCR引物，成功扩增了HZ株和FJ株病毒的HA基因序列，得到HZ株的HA基因序列如SEQ ID NO:1所示，FJ株的HA基因序列如SEQ ID NO:2所示。

[0043] 5）抗原相关性分析：将本实验室保存的6株AIV H9亚型毒株，包括HZ株和FJ株，分别制备成油乳剂灭活疫苗，免疫21日龄SPF鸡，在隔离饲养器内制备单因子血清，用于交叉HI试验，检测HZ株和FJ株病毒的抗原谱是否广谱。抗原相关性的判定标准如下：抗原间的相关性 R为2株病毒间的抗原性差异，r1为甲病毒对乙血清的HI滴度/甲病毒对甲血清的HI滴度，r2为乙病毒对甲血清的HI滴度/乙病毒对乙血清的HI滴度；如果R＝1，表明两个毒株间抗原性相同；如果0.67≤R≤1.5，表明两个毒株间抗原性无明显差异；如果0.5≤R＜0.67，表明两个毒株间抗原性有小的差异；如果R＜0.5，表明两个毒株间抗原性的差异明显；R值越小，抗原性差异越大，结果详见表5和表6。试验结果显示，HZ株与其余5株AIV H9病毒的抗原相关性均大于0.94，表明该病毒与其余毒株的抗原相关性很好；FJ株与其余5株AIV H9病毒的抗原相 关性均大于0.95，表明该病毒与其余毒株的抗原相关性很好。

[0044] 表5 6株病毒之间交叉血凝抑制试验结果

[0045]

[0046] 表6 6株病毒之间抗原相关性

[0047]

[0048] 6）交叉攻毒保护试验：HZ株和FJ株灭活疫苗免疫后21日，用6株AIV H9亚型毒株进行攻毒，攻毒后第5日采集鸡喉头棉拭子，分别尿囊腔内接种9～10日龄SPF鸡胚进行病毒分离，检测HZ株和FJ株对野毒攻击能否产生较好的免 疫保护效果，结果详见表7。

[0049] 表7 6株毒株之间交叉保护试验

[0050]

[0051] 表7的攻毒试验结果表明，HZ株的交叉保护性最好，除了对自身保护力为9/11和对SN株保护力为8/10以外，其对其余4个毒株为全部保护；FJ株对不同毒株的交叉保护性亦较好，病毒阴性数/攻毒数均能达到8/10及以上，并且对HZ株、SN株的保护力分别可以达到10/11、9/10。

[0052] 结合以上试验数据，本发明选择HZ株和FJ株相配合而制成禽流感H9亚型灭活疫苗。

[0053] 实施例2：禽流感H9亚型灭活疫苗的安全性研究

[0054] 一种禽流感H9亚型灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

[0055] 1）制备H9亚型禽流感病毒HZ株毒液：将H9亚型禽流感病毒HZ株用生理盐水作-410 稀释，接种9～11日龄SPF鸡胚，无菌收获24～96小时内死亡及96小时后仍存活的HA≥8log2的鸡胚尿囊液作为H9亚型禽流感病毒HZ株毒液；

[0056] 2）制备H9亚型禽流感病毒FJ株毒液：将H9亚型禽流感病毒FJ株用生理盐水作-410 稀释，接种9～11日龄SPF鸡胚，无菌收获24～96小时内死亡及96小时后仍存活的HA≥8log2的鸡胚尿囊液作为H9亚型禽流感病毒FJ株毒液；

[0057] 3）灭活H9亚型禽流感病毒HZ株毒液：在HZ株毒液中加入终浓度为0.2%甲醛溶液，37℃摇床灭活24小时；

[0058] 4）灭活H9亚型禽流感病毒FJ株毒液：在FJ株毒液中加入终浓度为0.1%甲醛溶液，37℃摇床灭活24小时；

[0059] 5）制备油相溶液：将白油和司本-80按照体积比为18～20:1混合均匀，加热溶解后经121℃灭菌20分钟；

[0060] 6）制备水相溶液：将灭活的HZ株毒液和灭活的FJ株毒液按照体积比为6：4混合均匀，加入占混合毒液体积比0.75%的高压灭菌的吐温-80，用磁力搅拌器混匀搅拌至吐温完全溶解；

[0061] 7）乳化：将油相溶液和水相溶液按照体积比为1～2:1混合均匀，在乳化搅拌机中以10000r/min的速率，搅拌10分钟，即制成所述禽流感H9亚型灭活疫苗。

[0062] 为了检验本发明制备的禽流感H9亚型灭活疫苗的安全性，按照上述方法制备2批次灭活疫苗，批号分别为01、02。分别接种7日龄SPF鸡、7日龄黄鸡，每组10只，颈背部皮下注射该禽流感H9亚型灭活疫苗，1mL/只（超剂量免疫），另设相同条件SPF、黄鸡不接种作为对照，每组5只。通过观察接种后14日内是否出现由疫苗引起的任何局部和全身反应以及接种后14日、28日疫苗吸收情况，对疫苗安全性进行研究。其中，7日龄SPF鸡购自新兴大华农禽蛋有限公司SPF实验动物中心，7日龄黄鸡购自广东温氏食品集团股份有限公司榄根鸡场。试验结果见表8和表9。

[0063] 表8 SPF鸡免疫疫苗后安全性检测结果

[0064]

[0065] 表9 黄鸡免疫疫苗后安全性检测结果

[0066]

[0067] 上述试验结果显示，7日龄SPF鸡和7日龄黄鸡接种本发明禽流感H9亚型灭活疫苗，14日内未观察到临床异常，采食、饮水正常，健康情况良好，未发现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。接种后14日剖检注射部位，4/5以上接种鸡肉眼可见少量颗粒未被吸收完全；注射后28日剖检，5/5接种鸡疫苗已吸收完全，注射部位均未见由疫苗接种引起的异常反应。因此，本发明的禽流感H9亚型灭活疫苗具有良好的安全性。

[0068] 实施例3：禽流感H9亚型灭活疫苗对SPF鸡免疫效力试验

[0069] 按照实施例2的方法制备禽流感H9亚型灭活疫苗，将制备的禽流感H9亚型灭活疫苗免疫21日龄SPF鸡，0.3mL/只，免后21日采血，分离血清，测定HI抗体效价，同时进行翅下静脉攻击AIV H9亚型不同地方分离毒株，攻毒剂量为0.2mL/只，攻毒后第5日，采集每只鸡喉头拭子，分别经尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚进行病毒分离。每只鸡的喉拭子样品尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚5枚，孵育观察96小时，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，以5枚鸡胚中有1枚鸡胚液红细胞凝集价不低于4log2（微量法）判为感染。对病毒感染为阴性的鸡胚，盲传一次。试验具体分组详见表10，结果见表11。

[0070] 表10 SPF鸡免疫攻毒试验分组情况

[0071]

[0072] 表11 疫苗对SPF鸡的免疫攻毒保护情况

[0073]

[0074] 上述试验结果显示，SPF鸡免疫禽流感H9亚型灭活疫苗后第21日，产生了较高的禽流感H9亚型血清抗体，面对禽流感H9亚型不同地方毒株的攻击， 均产生了很好的免疫保护力，10只鸡均保护9只以上。

[0075] 实施例4：黄鸡免疫禽流感H9亚型灭活疫苗后HI抗体消长规律测定[0076] 按照实施例2的方法制备禽流感H9亚型灭活疫苗，取21日龄黄鸡32只，平均分为2组，每组16只。第1组接种禽流感H9亚型灭活疫苗0.3mL/只，间隔2周后按同样剂量再加强免疫一次；第2组不接种疫苗作为阴性对照。以后定期测定2组H9亚型禽流感抗体水平，分析免疫组抗体变化规律，试验结果见图1，图中HZ-FJ灭活苗表示禽流感H9亚型灭活疫苗。

[0077] 图1的结果显示，黄鸡免疫禽流感H9亚型灭活疫苗后，于免后第7日开始产生免疫应答，在二免后14日抗体水平迅速上升，并于二免后14～28日内达到抗体高峰，直至二免后64日仍可维持在8 log2以上。

[0078] 实施例5：竹丝鸡免疫禽流感H9亚型灭活疫苗后HI抗体消长规律测定[0079] 按照实施例2的方法制备禽流感H9亚型灭活疫苗，取14日龄竹丝鸡32只，平均分为2组，每组16只。第1组接种禽流感H9亚型灭活疫苗0.3mL/只，间隔2周后按同样剂量再加强免疫一次；第2组不接种疫苗作为阴性对照。以后每周测定2组H9亚型禽流感抗体水平，分析免疫组抗体变化规律，试验结果见图2，图中HZ-FJ灭活苗表示禽流感H9亚型灭活疫苗。

[0080] 图2的结果显示，竹丝鸡在首免当天（14日龄）时，体内仍具有一定水平的禽流感H9亚型母源抗体，达4 log2，随着鸡只日龄的增长，其母源抗体迅速降低至趋于0，免疫组鸡从一免后第7日开始，新产生的禽流感H9血清抗体基本呈直线上升，至二免后第7日，疫苗诱导的血清抗体达到峰值，高达11 log2，然后逐渐趋于稳定，至二免后第49日，抗体水平仍可维持在8 log2以上。

[0081] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的 范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。