一株重组大肠杆菌及其在制备抗O157:H7的N-糖蛋白疫苗中的应用

摘要

本发明公开了一株重组大肠杆菌，命名为重组大肠杆菌CBEB，是将构建的重组质粒p-pglB-malEM和p-rfb共转化大肠杆菌CLM24中获得，其基因型是W3110Δwaal/p-pglB-malEM+p-rfb。利用本发明所述重组大肠杆菌发酵制备抗O157:H7N-糖蛋白疫苗，生产步骤简单，生产周期短，产量高，生产成本低，可以应用于抗O157:H7N-糖蛋白疫苗的大规模生产；且本发明方法生产的抗O157:H7N-糖蛋白疫苗具有良好的免疫效果，为抗细菌感染的免疫治疗提供了新的选择，提示具有良好的工业开发和应用前景。

权利要求

M

1.一株基因型为W3110Δwaal/p-pglB-malE +p-rfb的重组大肠杆菌的制备方法，其M M特征在于：构建含malE和pglB基因的共表达载体p-pglB-malE ，再构建含rfb基因簇M的表达载体p-rfb，将上述构建的重组表达载体p-pglB-malE和p-rfb共转化大肠杆菌MCLM24，得到能同时表达pglB基因、malE基因和rfb基因簇的重组大肠杆菌W3110Δwaal/Mp-pglB-malE+p-rfb；

M

其中，所述malE来源于质粒pMAL-p5X，所述pglB基因来源于空肠弯曲杆菌MNCTC11168，共表达malE和pglB基因的载体为pBAD24；所述rfb基因簇来源于大肠杆菌O157:H7，表达rfb基因簇的载体为pYES1L；

M

上述malE为malE基因突变体，是通过在malE基因的3’末端插入一段核苷酸序列如M MSEQ ID No.1所示的表达糖基化序列的基因所得，其中malE扩增采用的引物malE -F的核M苷酸序列如SEQ ID No.14所示，引物malE-R的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；

上述rfb基因簇是以O157:H7基因组为模板，分别以O157-1-F和O157-1-R、O157-2-F和O157-2-R、O157-3-F和O157-3-R为引物，分三段PCR克隆出rfb基因簇，再连接获得；所述引物O157-1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，引物O157-1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，引物O157-2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，引物O157-2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，引物O157-3-F的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，引物O157-3-R的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；

上述大肠杆菌CLM24是通过敲除出发菌株大肠杆菌W3110的waal基因而构建的大肠杆菌工程菌，其基因型为W3110Δwaal。

说明书

一株重组大肠杆菌及其在制备抗O157:H7的N-糖蛋白疫苗

中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株重组大肠杆菌及构建方法以及该重组菌株在生产抗大肠杆菌O157:H7N-糖蛋白疫苗中的应用。属于生物技术、基因工程和微生物发酵领域。

背景技术

[0002] 肠出血性大肠杆菌O157:H7在临床感染中常常引起血样腹泻、贫血和肾衰竭，常常危及患者生命。我国已分离出大肠杆菌O157∶H7，表明我国也有该病爆发流行的潜在危险性，应引起足够重视。我国已将肠出血性大肠杆菌列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一,仅次于艾滋病病毒(HIV)，排列第二。由于采用抗生素疗法能够导致大肠杆菌O157:H7的细胞壁溶解，促进细胞毒素的释放，从而加重病程。目前在临床中针对大肠杆菌O157:H7感染的治疗以预防和保守疗法为主。

[0003] 糖蛋白疫苗被认为是最有效和最安全的抗病原菌疫苗之一，具有广阔应用前景。糖蛋白疫苗通过将细菌多糖如O抗原或荚膜多糖连接到具有免疫原性的载体蛋白上，此糖蛋白能引发依赖于T细胞的免疫应答，可以给予儿童以抵抗细菌感染并且也可以给成年人提供长时间持续的免疫应答。

[0004] 目前，合成糖蛋白疫苗的方法主要是化学法。即通过基因工程技术表达和纯化载体蛋白，然后同提纯的病原菌表面多糖进行化学耦联。但是由于糖链化学激活的随机性，交联产生的糖蛋白具有高度不均一性；同时，此方法还存在着步骤繁杂、操作困难等问题。基于此，急待建立和开发新的可以大幅降低生产成本的糖蛋白疫苗生产方法。

发明内容

[0005] 针对现有方法的不足，本发明要解决的问题是提供一株重组大肠杆菌及其在制备抗O157:H7的N-糖蛋白疫苗中的应用。

[0006] 本发明的技术方案基于空肠弯曲菌N-连接糖基化途径同大肠杆菌脂多糖合成途径相似的特点，采用在大肠杆菌中表达来源于大肠杆菌中的rfb基因簇（O157:H7rfb基因簇：GI:3435170），并过量表达来源于大肠杆菌中的malE基因（来源NEB公司的质粒pMAL-p5X）突变体和来源于空肠弯曲菌的pglB基因（PglB NCBI-GeneID:905417），在改良TB培养基中发酵生产抗O157:H7的N-糖蛋白。

[0007] 本发明所述的重组大肠杆菌命名为重组大肠杆菌CBEB，其特征在于：所述重组大M M肠杆菌由如下方法制得：构建含malE和pglB基因的共表达载体p-pglB-malE ，再构建含M
rfb基因簇的表达载体p-rfb，然后将上述构建的重组质粒p-pglB-malE和p-rfb共转化M
大肠杆菌CLM24中，得到能同时表达pglB、malE基因和rfb基因簇的重组大肠杆菌CBEB，M
其基因型是W3110Δwaal/p-pglB-malE+p-rfb；

[0008] 其中，所述malEM来源于质粒pMAL-p5X，所述pglB基因来源于空肠弯曲杆菌MNCTC11168，共表达malE和pglB基因的载体为pBAD24；所述rfb基因簇来源于大肠杆菌O157:H7；表达rfb基因簇的载体为pYES1L；

[0009] 上述malEM为malE基因突变体，是通过在malE基因的3’末端插入一段核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的表达糖基化序列的基因所得；

[0010] 上述大肠杆菌CLM24是通过敲除出发菌株大肠杆菌W3110的waal基因而构建的大肠杆菌工程菌，其基因型为W3110Δwaal，命名为大肠杆菌CLM24。

[0011] 上述重组大肠杆菌CBEB的构建方法概述：

[0012] 1.waal基因的敲除

[0013] 基本方法是通过Red重组系统在大肠杆菌E.coli W3110中敲除基因waal（寡糖基转移酶）。所得缺失waal基因的大肠杆菌E.coli W3110Δwaal命名为CLM24。

[0014] 上述Red重组系统，是通过质粒pSIM19表达λ噬菌体重组酶Gam、Bet和Exo，通过设计带有同源臂的引物扩增带有筛选标记的kan（卡那霉素抗性基因）的重组片段。然后通过电穿孔仪电击，将重组片段转入表达λ噬菌体重组酶Gam、Bet和Exo的大肠杆菌中，重组片段在重组酶的作用下与基因组上的目的基因发生重组，从而将原有的基因置换下来，而抗性基因通过表达FLP内切酶，从基因组上切除掉。

[0015] 2.rfb基因簇的表达载体的构建

[0016] 基本方法是以大肠杆菌O157:H7基因组为模板，克隆rfb基因簇，将所获得的rfb基因簇插入到线性质粒pYES1L中，从而获得rfb基因簇的表达载体p-rfb。

[0017] 3.malEM和pglB基因的共表达载体的构建

[0018] 基本方法是以空肠弯曲菌基因组为模板，克隆pglB基因，将所克隆获得的pglB插M入质粒pBAD24中，从而获得pglB的表达载体p-pglB；以质粒pMAL-p5X为模板，克隆malEM M
基因，将所克隆获得的malE插入质粒p-pglB中，从而获得malE 和pglB的共表达载体M
p-pglB-malE。

[0019] 4.N-糖蛋白发酵重组菌株的构建

[0020] 基本方法是将所构建的重组质粒p-pglB和p-pglB-malEM共转化大肠杆菌CLM24M中，从而获得表达rfb基因簇，过量表达malE和pglB的重组大肠杆菌CBEB。

[0021] 本发明所述重组大肠杆菌在制备抗大肠杆菌O157:H7的N-糖蛋白疫苗中的应用。

[0022] 进一步的，具体的制备抗大肠杆菌O157:H7的N-糖蛋白疫苗方法是：

[0023] 1.摇瓶培养

[0024] 挑取所构建的重组菌株CBEB单菌落至装有3-5mL的改良TB培养基的25mL的三角瓶中，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，壮观霉素终浓度为50μg/mL，37℃，200-225r/min，培养12h。

[0025] 将过夜培养的菌液按照0.5-3％(v/v)的接种量接入装有50mL改良TB培养基的100mL的三角瓶中，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，壮观霉素终浓度为50μg/mL，37℃，
200-225r/min。

[0026] 待菌液OD600=0.4-0.6时，按照0.5-3％(v/v)的接种量接入装有1L改良TB培养基的3L的三角瓶中，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，壮观霉素终浓度为50μg/mL，37℃，200-225r/min。

[0027] 待菌液OD600=0.6-0.8时，加入终浓度为0.2％(v/v)的L-阿拉伯糖，16-37℃，200-225r/min。

[0028] 上述加入L-阿拉伯糖后，发酵温度优选28℃。

[0029] 待4-6h后，补加一次终浓度为0.2％(v/v)的L-阿拉伯糖，16-37℃，200-225r/min，继续培养14-16小时。

[0030] 上述优选6h再次加入L-阿拉伯糖，发酵温度优选28℃，继续培养14h。

[0031] 2.N-糖蛋白纯化

[0032] 将摇瓶发酵的菌液10,000-12,000r/min离心5-10min。离心所得沉淀用1mg/ml溶菌酶4℃处理1h。10,000-12,000r/min离心5-10min，用亲和镍柱纯化，收集N-糖蛋白的洗脱液，超滤脱盐。

[0033] 其中，摇瓶发酵中N-糖蛋白的产量为3mg/L。

[0034] 本发明公开的重组大肠杆菌及其在制备抗O157:H7的N-糖蛋白疫苗中的应用具有非常重要的应用价值。

[0035] 利用本发明提供的重组大肠杆菌发酵制备抗O157:H7N-糖蛋白疫苗，生产步骤简单，生产周期短，产量高，生产成本低，可以应用于抗O157:H7N-糖蛋白疫苗的大规模生产；同时，本发明方法生产的抗O157:H7N-糖蛋白疫苗具有良好的免疫效果，为抗细菌感染的免疫治疗提供了新的选择，提示具有良好的工业开发和应用前景。

附图说明

[0036] 图1.糖蛋白疫苗一步发酵生产方法原理示意图。

[0037] 图2.基因敲除原理步骤示意图及waal基因敲除琼脂糖凝胶电泳检测。

[0038] 图3.p-rfb表达载体图谱。

[0039] 图4.p-pglB-malEM表达载体图谱。

[0040] 图5.SDS-PAGE分析MBP糖基化。MBP为malEM基因表达的蛋白，MBP-PS为糖基化的MBP。

[0041] 图6.Western blot分析MBP糖基化。泳道1为MBP，泳道2为MBP-PS。

[0042] 图7.MALDI-TOF分析MBP糖基化。

[0043] 图8.小鼠血清抗O157的IgG抗体ELISA检测。

[0044] 图9.小鼠血清细胞因子IL-2、IL-4的ELISA检测。

具体实施方式

[0045] 一般性说明：如下实施例所涉及的酶均购自Thermo公司，质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒购自天根公司，操作完全按照相应说明书进行。质粒构建中基因测序由华大基因公司完成。质粒pYES1L来源于invitrogen公司；质粒pBAD24和出发菌大肠杆菌W3110来源于ATCC(美国典型菌种保藏中心)；DH5α感受态细胞购自全式金生物技术有限公司。4-6周龄Balb/C雌性小鼠，购于山东大学新药评定中心。细胞因子测定ELISA试剂盒购自深圳达可为有限公司。实施例中的其他实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。

[0046] 所述LB培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L。

[0047] 所述SOC培养基为：蛋白胨2g/L，酵母粉0.5g/L，NaCl0.0585g/L，KCl0.0186g/L，MgCl20.203g/L，MgSO40.246g/L，葡萄糖20mmol/L。

[0048] 所述改良TB培养基为：蛋白胨10-20g/L，酵母粉5-30g/L，甘油1-10ml/L，NaCl5-10g/L。

[0049] 实施例1、大肠杆菌W3110waal基因的敲除

[0050] (1)同源片段的克隆

[0051] 利用Red重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的waal基因序列设计引物：

[0052] pKD-waal F：

[0053] 5’-TTGGAAAAGTTATCATCATTATAAAGGTAAAACATGCTAACATCCTTTAAACTTCATTCATTGAAACCTTACACTCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

[0054] pKD-waal R：

[0055] 5’-GAGTTTTAACTCACTTCTTAAACTTGTTTATTCTTAATTAATTGTATTGTTACGATTATTAATGACGAGTAAGAGGACATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’

[0056] 以pKD4通过PCR（聚合酶链式反应）体外扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片段。PCR反应体系如下：（引物浓度为20μmol/L）

[0057]

[0058] 模板DNA1μl，加水补至50μl。

[0059] PCR反应条件：97℃预变性10min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。通过DpnI内切酶消化后，回收纯化浓缩同源重组片段。

[0060] (2)电转化感受态细胞的制备

[0061] (I)挑取带有pSIM19质粒的大肠杆菌W3110，转入LB培养基中，同时加入100mg/L氨苄青霉素，30℃，200r/min，培养OD600至0.4；

[0062] (II)42℃水浴15min，200r/min；

[0063] (III)冰浴15min，离心菌体，然后利用10%的甘油洗涤3次；

[0064] (IV)加入10%的甘油，浓缩至50倍，分装感受态。

[0065] (3)电转化，筛选重组子

[0066] (I)吸取8μg/ml的同源重组片段，加入100μl的感受态细胞中，混匀后转移至预冷的2mm电转杯中，轻甩至杯底部。调节电穿孔仪，2.5Kv，电击；

[0067] (II)加入900μl的SOC培养基，混匀后转移至无菌EP管中，37℃，120r/min，培养1h；

[0068] (III)涂布卡那霉素抗性平板，调取重组子利用

[0069] waal test F:GGTATGTAGGGCTCCAAGAG

[0070] waal test R:AATTTGGTCCCCGAATCATC

[0071] 进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实waal基因已被卡那霉素抗性基因替换。

[0072] (IV)FLP位点特异性重组

[0073] 将pCP20转入卡那霉素抗性克隆，30℃培养8h，后提高至42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环沾取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和卡那霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的已将卡那霉素抗性基因消除。利用检测引物waal test F和waal test R进行进一步鉴定。

[0074] (V)获得敲除waal基因而构建的大肠杆菌工程菌，其基因型为W3110Δwaal，命名为大肠杆菌CLM24。结果见图2。

[0075] 实施例2、rfb基因簇（GI:3435170）表达载体的构建

[0076] 根据NCBI公布的大肠杆菌O157:H7基因组序列设计引物：

[0077] O157-1-F:

[0078] 5’-GTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACGCATAAATTTTAATGCTTATCAAAACTATTAGC-3’[0079] O157-1-R:

[0080] 5’-CATGGATGTCCGTATAAATGGACACACATAATAGCTTTAGTTTTATTAGTGA-3’[0081] O157-2-F:

[0082] 5’-TCACTAATAAAACTAAAGCTATTATGTGTGTCCATTTATACGGACATCCATG-3’[0083] O157-2-R:

[0084] 5’-TATGCGCGACAATTATAATGCACATCGTC-3’

[0085] O157-3-F:

[0086] 5’-TGACGATGTGCATTATAATTGTCGCGCATATTTTAACAATAAAACAAATGATGC-3’[0087] O157-3-R:

[0088] 5’-GAATTTCTTCTCTCATCCGCCAAAACAGAAGCTTTGTTTACTCCTGTCAGGGGTTACC-3’[0089] 以O157:H7基因组为模板，分别以O157-1-F和O157-1-R、O157-2-F和O157-2-R、O157-3-F和O157-3-R为引物，分三段PCR克隆出rfb基因簇。PCR反应体系如下：（引物浓度为20μmol/L）

[0090]

[0091]

[0092] 模板DNA1μl，加水补至50μl。

[0093] PCR反应条件：97℃预变性10min，94℃变性30s，60℃（O157-1）或54℃（O157-2）或60℃（O157-3）退火30s，72℃延伸5min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

[0094] 将克隆的三个PCR片段加入到连接体系。如下：

[0095]

[0096] 30℃水浴连接30min后，加入35.5μl DMSO混匀，然后42℃热击20min。1,800r/min离心5min，用1mL0.9%NaCl重悬沉淀，取100μl涂布CSM-Trp平板。30℃培养3天后挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证rfb基因簇的正确。从而获得过重组质粒p-rfb。

[0097] 实施例3、重组质粒p-pglB-malEM的构建

[0098] (1)pglB基因（PglB NCBI-GeneID:905417）表达载体的构建

[0099] 根据NCBI公布的空肠弯曲杆菌NCTC11168基因组序列设计引物：

[0100] pglB-F:

[0101] 5’-CACGCCATGGTCTTGAAAAAAGAGTATTTAAAAAACCC-3’

[0102] pglB-R:

[0103] 5’-ATTCCCGGGTCAATGATGATGATGATGATGAATTTTAAGTTTAAAAACTTTAG-3’[0104] 以NCTC11168基因组为模板，PCR克隆pglB基因。PCR反应体系如下：（引物浓度为20μmol/L）

[0105]

[0106] 模板DNA1μl，加水补至50μl。

[0107] PCR反应条件：97℃预变性10min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

[0108] 将克隆的pglB片段分别利用核酸内切酶NcoI和SmaI消化处理，同时将质粒载体pBAD24也分别利用核酸内切酶NcoI和SmaI消化处理。将消化处理的pglB片段和pBAD24质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。

[0109] 连接体系为10μl：

[0110] pglB片段：6μl；

[0111] pBAD24载体：2μl；

[0112] 10×Buffer：1μl；

[0113] T4连接酶：1μl。

[0114] 16℃连接12h后，将10μl的连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化过程为：将10μl的连接液加入100μl的DH5α感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入900μl的LB培养基，37℃，100r/min，孵化1h，涂布氨苄青霉素抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证pglB基因的正确。从而获得过重组质粒p-pglB。

[0115] (2)malEM（来源NEB公司的质粒pMAL-p5X）和pglB基因表达载体的构建[0116] 根据NCBI公布的质粒pMAL-p5x序列设计引物：

[0117] malEM-F:

[0118] 5’-TCCCCCGGGGGAAGGAGG CATAGATTATGAAAATAAAAACAGGTGC-3’

[0119] malEM-R:

[0120] 5’-GCGTCGACGTCTCAATGATGATGATGATGATGGGTCGCGTTCTGATCTCCTCCAGTGGCGTTCTGATCGCCGCCGGTCGCGTTCTGATCGCCGCCGGTCGCGTTCTGATCTTCCAGCTGCGCGTCTTTCAGGGC-3’[0121] 其中：上述malEM-R中含有表达糖基化序列的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体是：

[0122] 5’-CTGGAAGATCAGAACGCGACCGGCGGCGATCAGAACGCGACCGGCGGCGATCAGAACGCCACTGGAGGAGATCAGAACGCGACC-3’

[0123] 以质粒pMAL-p5x为模板，PCR克隆malEM基因。PCR反应体系如下：（引物浓度为20μmol/L）

[0124]

[0125] 模板DNA1μl，加水补至50μl。

[0126] PCR反应条件：97℃预变性10min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

[0127] 将克隆的pglB片段分别利用核酸内切酶SmaI和SalI消化处理，同时将质粒载体p-pglB也分别利用核酸内切酶SmaI和SalI消化处理。将消化处理的pglB片段和p-pglB质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。

[0128] 连接体系为10μl：

[0129] pglB片段：6μl；

[0130] pBAD24载体：2μl；

[0131] 10×Buffer：1μl；

[0132] T4连接酶：1μl。

[0133] 16℃连接12h后，将10μl的连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化过程为：将10μl的连接液加入100μl的DH5α感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入900μl的LB培养基，37℃，100r/min，孵化1h，涂布氨苄青霉素抗性平M
板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证malE基因的正确。从而获M
得过重组质粒p-pglB-malE。

[0134] 实施例4、重组大肠杆菌菌株的构建和发酵及N-糖蛋白的纯化

[0135] (1)重组大肠杆菌菌株的构建

[0136] 参照实施例1（2）方法制备CLM24电转感受态细胞。吸取10μl的重组质粒p-rfb，加入100μl的感受态细胞中，混匀后转移至预冷的2mm电转杯中，轻甩至杯底部。调节电穿孔仪，2.5Kv，电击；随后在电转杯中加入900μl的SOC培养基，混匀，转移至无菌EP管中，37℃，120r/min，培养1h；涂布卡那霉素抗性平板，37℃培养24h后调取重组子验证。从而获得重组菌CLM24/p-rfb。

[0137] 取50ul制备的重组菌CLM24/p-rfb化学（CaCl2）感受态细胞中加入5ul质粒Mp-pglB-malE，混匀冰浴20～30分钟后，42℃水浴锅热激90秒后冰浴3～5分钟；然后加入900ul LB培养基，37℃，120r/min恢复培养45min～1h；4,000r/min离心2min，倒出部分上清，将剩下的菌体涂布氨苄青霉素抗性平板，37℃培养24h后调取重组子验证。从而获M
得重组菌CLM24/p-rfb+p-pglB-malE。

[0138] (2)重组大肠杆菌的发酵

[0139] 挑取所构建的重组菌株CBEB（CLM24/p-rfb+p-pglB-malEM）单菌落至装有5mL的改良TB培养基的25mL的三角瓶中，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，壮观霉素终浓度为50μg/mL，37℃，200r/min，培养12h。

[0140] 将过夜培养的菌液按照1％(v/v)的接种量接入装有50mL改良TB培养基的100mL的三角瓶中，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，壮观霉素终浓度为50μg/mL，37℃，
200-225r/min。

[0141] 待菌液OD600=0.6时，按照1％(v/v)的接种量接入装有1L改良TB培养基的3L的三角瓶中，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，壮观霉素终浓度为50μg/mL，37℃，200-225r/min。

[0142] 待菌液OD600=0.6时，加入终浓度为0.2％(v/v)的L-阿拉伯糖，28℃，200-225r/min。

[0143] 待6h后，补加一次终浓度为0.2％(v/v)的L-阿拉伯糖，28℃，200-225r/min，继续培养14h。

[0144] (3)N-糖蛋白的纯化

[0145] 1L发酵液经10,000r/min离心10min，收集菌体并用30mL的周质空间蛋白提取液（20mM Tris-HCl，20%(wt/vol)蔗糖，1mM EDTA，1mg/ml溶菌酶，pH7.5）4℃处理菌体1h。12,000r/min离心30min，然后收集上清并加入到已用结合缓冲液（10mM咪唑，0.5MNaCl，
20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液，pH7.4）预平衡过的5mL的亲和镍柱中。经过10个柱体积的结合缓冲液洗涤，用洗脱缓冲液(250mM咪唑，0.5M NaCl，20mMNa2HPO4/NaH2PO4缓冲液，pH7.4)洗脱，收集含N-糖蛋白的洗脱液。

[0146] 将含有目的蛋白的洗脱液装入截留分子量为10kDa超滤管，4℃5,000g离心30min，弃去下管液体，向套管内加满脱盐缓冲液，4℃5,000g离心30min。重复3次，至目的蛋白浓缩至2mL，并将咪唑充分除去。浓缩后的蛋白冻存于-70℃冰箱中。

[0147] 实施例5、N-糖蛋白的鉴定

[0148] 纯化的N-糖蛋白取样进行SDS-PAGE分析。MBP分子量在46KDa左右，与理论分子量相符。N-糖基化的MBP形成梯状条带，主条带分子量分布于50KDa与55KDa之间。由于SDS-PAGE灵敏度有限，有些糖蛋白的条带未显出。结果见图5。

[0149] 利用Western Blot鉴定N-糖蛋白，分别采用anti-His、anti-MBP、anti-O157抗体作为一抗，选用合适的羊抗鼠或羊抗兔作为二抗，进行检测分析。N-糖基化的MBP由于添加了链长不等的O-抗原而显示出分子量比非糖基化的MBP大的梯状条带，证明MBP发生糖基化。结果见图6。

[0150] 利用MALDI-TOF对N-糖基化的MBP及MBP进行分子量的鉴定。MBP分子量为45823Da，MBP主分子量分布于48790Da附近。结果见图7。

[0151] 实施例6、N-糖蛋白免疫效果

[0152] (1)免疫小鼠

[0153] 取6周龄Balb/C雌鼠，分为三组，分别为背部皮下多点注射N-糖基化MBP（每只30μg，150μl，n=8），MBP（每只30μg，150μl，n=8）和PBS（每只150μl，n=5），隔两周免疫一次，共免疫三次。首次免疫使用完全弗氏佐剂，第二、三次免疫使用不完全弗氏佐剂。
免疫前及每次免疫后一周，从小鼠腿部隐静脉取血200ml，室温静置1h后，4,000r/min离心
20min，取出血清，分装保存于-20℃。

[0154] (2)血清抗体滴度检测

[0155] 大肠杆菌O157:H7脂多糖包被96孔板，ELISA检测小鼠血清中大肠杆菌O157:H7脂多糖抗滴度，结果见图8。

[0156] (3)血清细胞因子检测

[0157] 通过细胞因子ELISA试剂盒（深圳达科为）测定免疫后小鼠血清中的IL-2和IL-4水平。IL-2水平：MP组＞M组＞PBS组；IL-4水平：MP组＜M组＜PBS组。，表明MBP-PS可活化Th1细胞，抑制Th2细胞活性。结果见图9。

[0158] 根据以上N-糖蛋白免疫效果测定可得出结论，本发明的重组大肠杆菌生产的N-糖蛋白疫苗具有明显抗大肠杆菌O157:H7的作用。此小鼠模型完全模拟人体内的环境，因此理论上用于人类肿瘤治疗也会有较好的效果。预示本发明的疫苗可用于人类预防大肠杆菌O157:H7的免疫治疗。

[0159] 本发明为抗细菌感染的免疫治疗提供了新的选择，具有良好的应用前景。