一种虾夷扇贝生长性状相关的SNP位点及其检测和应用转让专利
申请号 : CN201410035028.9
文献号 : CN103740729B
文献日 : 2015-07-08
发明人 : 包振民 , 胡晓丽 , 封利颖 , 于茜 , 李雪 , 张玲玲 , 王师 , 邹佳君
申请人 : 中国海洋大学
摘要 :
本发明提供一种与虾夷扇贝生长性状相关的SNP位点，所述的位点为核苷酸序列为SEQ ID NO:2的IGFBP基因的1054位，其碱基为A或G；本发明还提供用于检测上述SNP位点的探针及分型引物。本发明通过对虾夷扇贝中IGFBP基因的转录序列进行测序和Clustal比对，筛查到3个SNP位点。运用高分辨率熔解曲线技术在虾夷扇贝群体中检测位点多态性，并分析位点基因型频率与扇贝生产性状间的相关性。位点C.1054A>G与虾夷扇贝壳高、壳长、体重、软体重和闭壳肌重等重要生长性状显著相关，AG型个体的上述生长性状均显著低于AA和GG型个体（P
权利要求 :
1.一种用于检测与虾夷扇贝生长性状相关的SNP位点的探针及分型引物，其特征在于，所述的探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，引物的序列分别为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；
其中所述的SNP位点为核苷酸序列为SEQ ID NO:2的IGFBP基因的1054位，其碱基为A或G。
说明书 :
一种虾夷扇贝生长性状相关的SNP位点及其检测和应用
技术领域：
[0001] 本发明属于分子育种遗传标记筛选技术领域，具体涉及一种虾夷扇贝生长性状相关的SNP位点及其检测和应用。
背景技术
[0002] 胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor,IGFs）系统具有调控细胞生长、分化及凋亡的重要作用，对生物体多种组织的生长至关重要。该系统主要包括2个IGF配体(IGF-I和IGF-II)，两个IGF受体(IGF-IR和IGF-IIR)，以及至少6个IGF结合蛋白(IGFBP)。血清中，IGF与IGFBP的结合力等于甚至高于其与IGF受体的结合力，因此，IGFBP是IGF活性的主要调控者。IGFBP携带IGF因子到达细胞表面，通过蛋白水解等作用释放IGF因子与受体结合，将信号传递到核内，影响细胞的生长和分化。除了调节IGF的生物活性，IGFBP还可通过不依赖于IGF的方式调控细胞生长。
[0003] 目前，对IGF系统的研究主要集中在脊椎动物，在双壳类动物中也有零星报道，并且发现IGF系统具有调节双壳类的生长的功能。虾夷扇贝是我国重要海产经济贝类，培育生长性状优良的高产品种是提高其经济效益的重要途径之一，获得与扇贝生长性状相关的基因及基因位点可辅助高产扇贝的选育。目前，在扇贝中与生长相关的基因及基因位点的报道较少，且未见IGF系统基因的相关研究。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种虾夷扇贝生长性状相关的SNP位点及其检测和应用，即通过克隆虾夷扇贝IGFBP基因，并筛查出基因中与壳高、壳长、体重、软体重和闭壳肌重等重要生长性状相关的SNP位点，为高产虾夷扇贝的选育提供SNP标记。
[0005] 本发明首先提供一种虾夷扇贝IGFBP基因，该基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；
[0006] 所述的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
[0007] 本发明另一个方面提供一种与虾夷扇贝生长性状相关的SNP位点，所述的位点为核苷酸序列为SEQ ID NO:2的IGFBP基因的1054位，其碱基为A或G；
[0008] 本发明还提供用于检测上述SNP位点的探针及分型引物：
[0009] 探针IGFB5Ppb1（SEQ ID NO:3）
[0010] 5′-ATTCACTAGAAGACGGTATAGTAGAGCTTGGA-3′；
[0011] 分型引物为IGFBP5sf1（SEQ ID NO:4）
[0012] 5′-TTGACCTGGACCAGTTCATTCCTC-3′；
[0013] IGFBP5sr1（SEQ ID NO:5）
[0014] 5′-TAACACGAAGCAAGCTCTACTATAC-3′。
[0015] 通过对虾夷扇贝中IGFBP基因的转录序列进行测序和Clustal比对，筛查到3个SNP位点。运用高分辨率熔解曲线(High resolution melting,HRM)技术在虾夷扇贝群体中检测位点多态性，并分析位点基因型频率与扇贝生产性状间的相关性。位点C.1054A>G与虾夷扇贝壳高、壳长、体重、软体重和闭壳肌重等重要生长性状显著相关，AG型个体的上述生长性状均显著低于AA和GG型个体（P<0.05），且GG型的性状值最高。因此，在生产中可优先选择在该位点基因型为GG型的个体，作为高产扇贝选育的亲本或者进行规模养殖，避免选择该位点为AG型个体作为亲本或者进行规模养殖，也应避免选择该位点分别为AA型和GG型的亲本进行杂交。
附图说明
[0016] 图1：虾夷扇贝IGFBP基因全长cDNA序列及其编码的氨基酸序列图；
[0017] 其中下划线的碱基位置为SNP位点。具体实施方式：
[0018] 本发明在虾夷扇贝转录组文库中筛选获得IGFBP基因的cDNA序列片段，利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得该基因的cDNA全长序列。该基因cDNA全长1468bp，其中ORF长度为375bp，编码125个氨基酸，预测蛋白分子量1.42KD，等电点为8.51；5’UTR长度为206bp，3’UTR长度为887bp。蛋白序列中包含12个与脊椎动物同源蛋白高度保守的半胱氨酸（图1）。
[0019] 通过对虾夷扇贝中IGFBP基因的转录序列进行测序和Clustal比对，筛查到3个SNP位点。运用高分辨率熔解曲线(High resolution melting,HRM)技术在虾夷扇贝群体中检测位点多态性，并分析位点基因型频率与扇贝生产性状间的相关性。位点C.1054A>G与虾夷扇贝壳高、壳长、体重、软体重和闭壳肌重等重要生长性状显著相关，该位点可用于虾夷扇贝的分子标记辅助育种。
[0020] 下面通过实施例对本发明做进一步说明。
[0021] 实施例1
[0022] 本发明中的虾夷扇贝IGFBP基因cDNA序列克隆包括下列步骤：
[0023] a)虾夷扇贝闭壳肌总RNA的提取；
[0024] b)cDNA第一链的合成；
[0025] c)目的基因全长cDNA序列的获得；
[0026] d)目的基因的生物信息学分析。
[0027] 具体操作如下：
[0028] a)虾夷扇贝总RNA的提取。按照Trizol方法从虾夷扇贝闭壳肌中提取总RNA。
[0029] b)cDNA第一链的合成。以2μg总RNA为模板，分别加入1μl20μM Oligo d(T)18，RNase&DNase-free H2O补足至13μl，混匀离心。70℃保温10min，立即置于冰上，以打开RNA二级结构。依次加入：5μl5×M-MLV Buffer，5μl dNTP(2.5mM)，1μl RNasin(40U/μl)，1μl M-MLV(200U/μl)；混匀离心后，42℃，90min。94℃，5min，以灭活反转录酶。分装后-20℃保存。
[0030] c)目的基因全长cDNA序列的获得。筛查虾夷扇贝转录组文库，获得一条注释信息为IGFBP的cDNA片段，长度为1277bp。利用Clontech公司SMART RACE cDNA Amplification Kit构建5’RACE和3’RACE文库。用PrimerPremier5.0分别设计目的基因RACE引物，3’RACE引物：5’-CAGTGTTCCTCACCAATTACATATTTCCCAT-3’和5’RACE引物：5’-CGTGTGTCAAACAGGCTAACGAAGTCAT-3’。分别利用3’RACE引物和5’RACE引物与接头引物NUP（5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'）进行3’末端和5’末端的扩增。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒（上海生工）进行PCR产物纯化，再与pMD18-T载体（大连宝生物工程有限公司）连接，参照《分子克隆第三版》（黄培堂译，科学出版社，2002年）的方法转化大肠杆菌DH5α。菌落PCR检测后，对5’RACE和3’RACE，各挑取3个阳性克隆进行测序，将5’RACE和3’RACE测序获得的序列两端拼接后得到cDNA全长序列，见SEQ ID NO.2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
[0031] 3’和5’末端扩增，利用50μL反应体系：
[0032]
[0033] 扩增所用PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30sec，72℃3min，5个循环；94℃变性30sec，70℃退火30sec，72℃延伸3min，5个循环；94℃变性30sec，65℃退火30sec，72℃延伸3min，28个循环；72℃延伸10min。
[0034] 基因的生物信息学分析。利用GenBank蛋白数据库对获得的IGFBP基因cDNA序列进行BlastX同源性分析（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/），利用GeneRunner程序搜索其开放阅读框(open reading frame,ORF)、推测编码的氨基酸序列，并获得氨基酸序列的分子量、等电点等信息。利用GenBank蛋白数据库对预测的氨基酸序列进行BlastP分析，进行同源性比对和相似性搜索。
[0035] 实施例2：虾夷扇贝IGFBP基因中与生长性状相关SNP位点的筛查分析及其辅助高产栉孔扇贝选育的方法
[0036] 虾夷扇贝IGFBP基因中生长性状相关SNP位点C.1054A>G与生长性状的相关性分析，及其在高产栉孔扇贝选育中应用的方法，包括下列步骤：
[0037] a)虾夷扇贝基因组DNA提取；
[0038] b)虾夷扇贝IGFBP基因SNP位点筛查；
[0039] c)位点C.1054A>G分型用引物和探针设计;
[0040] d)SNP C.1054A>G分型；
[0041] e)C.1054A>G基因型与生长性状的相关性分析；
[0042] f)SNP C.1054A>G辅助高产栉孔扇贝选育的方法。
[0043] 具体操作如下：
[0044] a)虾夷扇贝DNA的提取。取闭壳肌约0.1g，加入500μl STE裂解缓冲液，剪碎，依次加入50μl10%SDS、5μl蛋白酶K(20mg/ml)，56℃裂解约3h，至裂解液澄清。加入同体积饱和酚(250μl)，氯仿/异戊醇(24:1)(250μl)，轻轻晃动20min，12000rpm离心10min。取上清，重复上述步骤，直至水相与有机相之间无蛋白质层。取上清，加入同体积氯仿/异戊醇，轻晃20min，12000rpm离心10min。取上清，加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)和2倍体积冷无水乙醇，摇匀后-20℃静置20min，12500rpm离心20min。将核酸沉淀于管底。弃上清，70%乙醇洗涤沉淀。收集沉淀，空气中干燥至乙醇全部挥发。加入20μl TE(含RNase A)溶解DNA，37℃静置约30min后，4℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品，紫外分光光度计检测浓度及纯度。
[0045] b)在虾夷扇贝自然群体中挑选5只最大和5只最小的个体，以基因组DNA为模板，对外显子区进行重测序，三个外显子扩增引物序列分别为
[0046] IGFBP5f1：5’-CCTCCTCAATAACATGCCTAGCC-3’;
[0047] IGFBP5r1:5’-TCTAATTACAGTGTCCAGGCCTTAAA-3’;
[0048] IGFBP5f2:5’-TCCAGTGAGGCAAGTACAACGC-3’;
[0049] IGFBP5r2:5’-CGGAAATGCTCACGAGGTCAT-3’;
[0050] IGFBP5f3:5’-TCTCCATTGCGGTAATATTCCTTATT-3’;
[0051] IGFBP5r3:5’-CCAGTGCCAATACATTTTGCG-3’。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒（上海生工）进行PCR产物纯化，纯化后产物直接送交上海生工公司进行PCR产物测序。运用ClustalX软件进行序列比对，获得候选SNP位点。
[0052] c)位点C.1054A>G分型用引物和探针的设计。根据SNP位点C.1054A>G附近的基因序列，设计HRM分型用引物和探针。标准如下：1）探针长度为19-35bp；只包含1个候选SNP位点，位点居于探针中间，不含缺失位点；退火温度为58℃-60℃；不含简单重复序列及回文序列。2）引物长度19-26bp；引物序列中不包含候选SNP位点及缺失位点；扩增产物长度70-130bp；GC含量30%-70%。探针序列为
[0053] IGFB5Ppb1：5’-ATTCACTAGAAGACGGTATAGTAGAGCTTGGA-3’；
[0054] 分型引物为IGFBP5sf1：5’-TTGACCTGGACCAGTTCATTCCTC-3’；
[0055] IGFBP5sr1：5’-TAACACGAAGCAAGCTCTACTATAC-3’。
[0056] d)SNP位点C.1054A>G分型。以虾夷扇贝自然群体（120只）的基因组DNA为模板，利用引物IGFBP5sf1和IGFBP5sr1进行PCR扩增，反应体系如下：10×Buffer1μl，2.5mM dNTP0.8μl，2.5mM MgCl2，0.6μl，IGFBP5sf1(10μM)0.1μl，IGFBP5sr1(10μM)0.5μl，Taq酶(5U/μl)0.1μl，模板0.5μl，LC Green饱和荧光染料0.7μl，加H2O补足至10μl。扩增反应在Biometra T-Gradient PCR系统上完成，反应条件如下：94℃4min；94℃40s，
65℃40s，60次循环；72℃5min。向每份PCR产物中加入3μL对应探针IGFBP5pb1(10μM)，
95℃变性10min。取10μl变性产物转入96孔BLK/WHT板中(Bio-Rad)，加入15μl矿物油，2000rpm离心1min。Light-Scanner中进行分型检测，以0.1℃/s的速率从40℃升温至
95℃，持续采集荧光信号。用LightScanner Call IT v2.0软件分析溶解曲线。记录个体的基因型：熔解曲线单峰温度高者为与探针序列相同纯合型，熔解曲线双峰者为杂合型，熔解曲线单峰温度低者为突变纯合型。通过与测序结果的比较，上述的检测方法能够准确的进行SNP位点C.1054A的分型。
65℃40s，60次循环；72℃5min。向每份PCR产物中加入3μL对应探针IGFBP5pb1(10μM)，
95℃变性10min。取10μl变性产物转入96孔BLK/WHT板中(Bio-Rad)，加入15μl矿物油，2000rpm离心1min。Light-Scanner中进行分型检测，以0.1℃/s的速率从40℃升温至
95℃，持续采集荧光信号。用LightScanner Call IT v2.0软件分析溶解曲线。记录个体的基因型：熔解曲线单峰温度高者为与探针序列相同纯合型，熔解曲线双峰者为杂合型，熔解曲线单峰温度低者为突变纯合型。通过与测序结果的比较，上述的检测方法能够准确的进行SNP位点C.1054A的分型。
[0057] e)C.1054A>G基因型与生长性状的相关性分析。用游标卡尺测量两个自然群体共120只虾夷扇贝个体的壳长和壳高，用电子天平测量每个个体的体重、软体重和闭壳肌重。
利用One-way ANOVA和post-hoc检验，分析位点C.1054A>G不同基因虾夷扇贝壳长、壳高、体重、软体重和闭壳肌重均值的差异，检验SNP C.1054A>G与虾夷扇贝各生长性状的相关性，最终确定位点C.1054A>G为AG型的虾夷扇贝，其壳长、壳高、体重、软体重和闭壳肌重等重要生长性状均显著低于AA型和GG型个体，GG型个体的性状值最高。
利用One-way ANOVA和post-hoc检验，分析位点C.1054A>G不同基因虾夷扇贝壳长、壳高、体重、软体重和闭壳肌重均值的差异，检验SNP C.1054A>G与虾夷扇贝各生长性状的相关性，最终确定位点C.1054A>G为AG型的虾夷扇贝，其壳长、壳高、体重、软体重和闭壳肌重等重要生长性状均显著低于AA型和GG型个体，GG型个体的性状值最高。
[0058] 表1：C.1054A>G位点不同基因型虾夷扇贝的生长性状
[0059]
[0060] 表中壳长、壳高、体重、软体重和闭壳肌重用其平均值±标准差表示，每列中右上角小写字母不同的数值间具有显著差异（P<0.05）。
[0061] f）SNP C.1054A>G辅助高产栉孔扇贝选育的方法。
[0062] 在高产虾夷扇贝的选择育种过程中，对虾夷扇贝育种候选群体进行位点C.1054A>G分型，结合其它与生长性状相关位点的分型信息，优先选择位点C.1054A>G均为GG型的个体，作为高产扇贝选育的亲本或者进行规模养殖，避免选择该位点为AG型个体作为亲本或者进行规模养殖，也应避免利用该位点分别为AA型和GG型的个体进行杂交。结果表明，，通过本发明的SNP的引物和探针筛选的亲本，其繁育的后代生长速率显著高于未筛选的对照组。