一种重组杆状病毒载体及病毒样颗粒及制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种重组杆状病毒载体及病毒样颗粒及制备方法和用途，旨在提供一种单一启动子下多个基因的串联表达和准确切割表达，并成功包装出的病毒样颗粒；该载体操作简单、表达量高、切割效率高，所得的病毒样颗粒免疫原性好、不带有外源序列；其技术要点：将小核糖核酸病毒科3C/3CD基因和P1/P1op基因表达在单一启动子下，所述的3C/3CD基因和P1/P1op之间通过2A序列连接，构建3C/3CD-2A-P1/P1op表达框架，再将3C/3CD基因置于杆状病毒载体质粒的启动子下，获得重组穿梭载体，转染至宿主细胞，获得重组杆状病毒，感染宿主细胞，获得病毒样颗粒。

权利要求

1.一种重组杆状病毒载体，其特征在于，将3C/3CD基因和P1/P1op基因表达在单一启动子下，所述的3C/3CD基因和P1/P1op之间通过2A序列连接，构建3C/3CD-2A-P1/P1op表达框架，所述的2A序列包含D-x-E-x-N-P-G-P氨基酸序列，所述的3C基因、3CD基因、P1基因分别为小核糖核酸病毒科的3C基因，3CD基因，P1基因，所述的P1op基因为小核糖核酸病毒科的P1基因的优化基因；所述的P1op基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组杆状病毒载体，其特征在于，所述的3C/3CD基因和P1/P1op基因表达在杆状病毒载体的Ppolh启动子下。

3.根据权利要求1所述的重组杆状病毒载体，其特征在于，所述的3C/3CD基因和P1/P1op基因表达在杆状病毒载体的P10启动子下。

4.根据权利要求3所述的重组杆状病毒载体，其特征在于，所述的3C基因和P1op基因表达在杆状病毒载体质粒的P10启动子下。

5.一种病毒样颗粒，其特征在于，将权利要求1所述的3C/3CD-2A-P1/P1op基因置于杆状病毒载体质粒的Ppolh启动子或P10启动子下，获得重组穿梭载体，转染至宿主细胞，获得重组杆状病毒载体，转染至宿主细胞，获得重组杆状病毒，感染宿主细胞，获得病毒样颗粒。

6.根据权利要求5所述的病毒样颗粒，其特征在于，所述的宿主细胞为昆虫细胞Sf9细胞株。

7.制备权利要求5所述的病毒样颗粒的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：

1)引物设计

对pFast-dual质粒的Ppolh启动子和P10启动子分析，设计3C/3CD-2A和2A-P1/P1op基因引物；

2)穿梭载体构建

以pFast-dual为载体，先采用PCR扩增3C/3CD-2A和2A-P1/P1op基因；再采用PCR扩增融合得到3C/3CD-2A-P1/P1op片段，回收片段，采用限制性内切酶对片段和pFastBac-dual载体进行酶切后，利用回收片段进行T4连接酶连接，并转化DH10a感受态，得到阳性菌落后，提取质粒得到重组的各个穿梭载体；

3)重组杆状病毒载体构建

将上述构建好的穿梭载体转化大肠杆菌DH10bac，选白色阳性菌落，进行PCR鉴定，得到阳性克隆，经过扩大培养阳性克隆后，提取重组杆粒；

4)重组杆状病毒的包装

将包含构建病毒样颗粒所需的蛋白编码基因的重组杆粒转染昆虫细胞Sf9后，得到包含构建病毒样颗粒所需的蛋白编码基因重组杆状病毒；

5)重组病毒样颗粒表达

培养上述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，在昆虫细胞中表达构建病毒样颗粒所需的蛋白编码基因，得到构建病毒样颗粒所需的蛋白，所述的构建病毒样颗粒所需蛋白进行自行组装，得到病毒样颗粒，形成的病毒样颗粒分泌到细胞培养上清中；

6)重组病毒样纯化

步骤5)中的上清经过初步离心去除大的细胞碎片后，采用切向流浓缩包进行浓缩后，经过分子筛和离子交换两步得到纯化的VLP免疫样品。

说明书

一种重组杆状病毒载体及病毒样颗粒及制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明公开了重组杆状病毒载体体，还公开了包括该病毒重组载体的病毒样颗粒及病毒样颗粒及制备方法和用途，具体地说，是一种高效表达小核糖核酸病毒科病毒的病毒重组载体和病毒样颗粒。

背景技术

[0002] 小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）家族包含了17个属，大部分具有较强的致病性。其中肠病毒属(Enterovirus)，代表种：小儿麻痹症病毒(poliovirus脊髓灰质炎病毒)，手足口病毒71型（Enterovirus71，EV71）；鼻病毒属(Rhinovirus)，代表种：人类鼻病毒A(Human rhinovirus A)；肝病毒属(Hepatovirus)，代表种：肝炎A型病毒(Hepatitis A virus,HAV)；副肠内细胞病变人类孤儿病毒属(Parechovirus副肠孤病毒属)，代表种：人类副肠内细胞病变人类孤儿病毒(Human parechovirus人副肠孤病毒)，能够造成严重的人类疾病。另外心病毒属(Cardiovirus)，代表种：脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus)；鹅口疮病毒属(Aphthovirus)，代表种：口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)等能够引起猪牛等脊柱动物疾病。该科病毒对人类健康和生命财产造成极大的伤害，因此急需有效地防治手段。目前大部分病毒还没有疫苗和特效的治疗药物，或者疫苗需要提高其安全性和有效性。

[0003] 其中手足口病（hand foot and mouth disease,HFMD）是一种由多种肠道病毒引起，导致婴幼儿出现手、足、口部疱疹、皮疹的传染性疾病。人肠道病毒71型（EV71）是引起HFMD的主要病原体之一，但EV71除与其他肠道病毒同样引起HFMD外，还可引起脑干脑炎、无菌性脑膜炎、神经源性心衰和肺水肿等多种重症神经系统疾病。重症患者病程进展迅速、病情重、死亡率高且易遗留神经系统后遗症。自2008年以来，EV71引起的相关疾病在我国呈现持续流行态势，由于缺乏有效的防控手段和治疗药物，重症病例易发生愈后后遗症甚至死亡，成为严重危害我国婴幼儿身体健康的重要公共卫生问题。

[0004] 该病毒基因组非常相似，为单股正链RNA，长约7.2～8.4kb，两端为保守的非编码区，在肠道病毒中同源性非常高，中间为连续开放读码框架。此外，5’端共价结合约23氨基酸的蛋白质Vpg（genome-linked protein），3’端带有约50个核苷酸的poly A尾。读码框架区分为3个区域：P1、P2和P3。P2和P3区域编码7个非结构蛋白。其中2A和3C/3CD为蛋白酶，负责其他蛋白的剪切功能；其他蛋白包括依赖RNA的RNA聚合酶3D，具有NTP酶活性和复合体定位细胞膜的2C，两种蛋白酶（2B、3AB），以及RNA5‘端共价多肽3B（VPg）等。P1区编码4个病毒结构蛋白VP1～VP4。VP1、VP2和VP3均暴露在病毒衣壳的表面，中和抗原和型特异性抗原位点主要集中在VP1蛋白，同时也是分型的主要依据；VP4位于衣壳内部，与病毒基因组脱壳有关。VP1、VP2和VP3蛋白形成的五聚体的顶端在病毒表面形成的峡谷样结构是受体分子结合的位点。

[0005] 该类病毒粒子的装配分为4个步骤：（1）以肠道病毒为例，当外壳蛋白P1形成后，通过个3C/3CD蛋白进一步切割成三个紧密聚合的蛋白质（VP0、VP3、VP1）组成未成熟的原聚体（5S）。初期由于P1和蛋白酶浓度较低，该裂解速度较慢。（2）随着蛋白酶浓度增加，未成熟的原聚体浓度增加，从而形成五聚体（14S）；（3）然后12个五聚体形成空壳的（80S）病毒样颗粒（virus like particle，VLP）；（4）接着正股VPg-RNA进入病毒样颗粒形成病毒前体（150S），进而引发VP0裂解形成VP4和VP2，形成具有感染性的成熟病毒粒子。80S的病毒样颗粒不包含病毒的基因组，只是一个五聚体的仓库，不具有自主复制的能力和传染性。同时具有大部分的病毒颗粒的结构特征，因此是目前发展该类病毒疫苗的首选目标。

[0006] 由于形成该类病毒VLP需要多个蛋白参与，需要构建多顺反子载体才能满足该目的。目前构建多顺反子载体的策略主要包括：

[0007] （1）多个载体共同转染细胞，是目的蛋白共表达。但该方法需要同时转染多个载体到一个细胞中，其转染效率低，载体之间互相干扰，蛋白表达不平衡。

[0008] （2）构建多启动子(multiple promotors)表达载体。通过把多个基因分别连接不同类型的启动子下，通过各个启动子进行控制表达。但是由于不同的启动子的启动效率的差异，也会造成蛋白表达不均衡，蛋白相互作用距离较远。同时各个启动子元件较大，如果使用多个启动子就会加重载体的负担，影响转染和表达效率。

[0009] （3）利用IRES系统构建多顺反子表达载体。利用内核糖体进入位点（IRES）连接多个目的基因，构建融合蛋白表达载体，实现在一个载体上多个基因共表达。其原理是在翻译蛋白的过程中不依赖RNA帽子结构，能够独立的募集核糖体，进而翻译下游基因，各个蛋白独立表达。该系统存在以下缺陷：（1）IRES自身结构较大（约为0.5kb），其应用常受到载体容量的限制，同时会增加载体的负担，导致转染效率降低。（2）IRES介导的上下游基因表达不平衡，通常下游基因的表达量仅是上游的20%到50%。所以在构建多顺反子载体系统中，IRES并不是理想的连接元件。

[0010] （4）利用剪切多肽连接目的基因。常用的连接肽有2A序列、LP4序列、IRES序列、NIa蛋白酶及其识别序列及可以被宿主细胞蛋白酶识别的连接序列及等。

[0011] 在不同种类的病毒中，具有D-x-E-x-N-P-G-P氨基酸序列统称为2A样序列。例如：小核糖核酸病毒样的2A序列、昆虫病毒的2A样序列；C型轮状病毒的2A样序列。口蹄疫病毒(food and mouth virus disease,FMDV)2A是自剪切多肽的典型。与其他自剪切肽相比FMDV2A具有结构短，大小为18-22个氨基酸（QLLNFDLLKLAGDVESNPGP），剪切效率高，上下游基因表达平衡性好，使其成为构建多顺反子载体的理想工具之一。

[0012] 在真核生物体内翻译的过程中，折叠后的2A对核糖体肽基造成空间位阻，使Pro-tRNA氨基亲核进攻无法完成，从而无法形成2A-tRNA酯键，因此在第19个氨基酸和第20个氨基酸之间会发生剪切作用，释放出融合了2A多肽尾巴的上游蛋白，形成与2A的融合蛋白，同时核糖体能继续翻译下游蛋白，形成N端带有一个脯氨酸的完整下游蛋白。整个过程不需要任何蛋白酶参与，上下游基因表达平衡，剪切效率高。

[0013] 目前研究已经有多种方法表达该类病毒VLP蛋白，用于疫苗研究。其中分别利用不同载体表达VP1、VP0和VP3的方法，转染后不能很好的得到病毒样颗粒。利用杆状病毒系统和酵母系统的不同启动子分别表达3CD和P1，能够得到EV71、FMDV等病毒的病毒样颗粒，但是需要两个启动子进行控制表达，效率较差。经过改造后，3CD放在CMV启动子下游，P1放在杆状病毒启动子下游，能够进一步提高病毒样颗粒的产量。但该方法同样需要双启动子。有文献报道利用FMDV病毒本身的P1-2A的连接序列后面融合其3C蛋白后，发现能够大量表达FMDV病毒的病毒样颗粒。但是该表达方式使得切割后的VP1带有20个氨基酸的2A序列，这样就影响了其结构和免疫原性。同时其多出的序列对于人类疫苗来说，在质量标准上、安全性具有隐患。原来的报道用于表达EV71、Polio病毒的VLP，都需要3CD复合蛋白。

发明内容

[0014] 为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种实现单一启动子下多个基因的串联表达并准确切割，包装出的病毒样颗粒，本发明还提供该病毒样颗粒的制备方法，该方法具有操作简单、表达量高、切割效率高、免疫原性好、不带有外源序列的优点。

[0015] 为此，本发明首先公开了一种表达病毒的重组载体，将3C/3CD基因和P1/P1op基因表达在单一启动子下，所述的3C/3CD基因和P1/P1op之间通过2A序列连接，构建3C/3CD-2A-P1/P1op表达框架，所述的3C基因，3CD基因、P1基因分别为小核糖核酸病毒科的3C基因，3CD基因，P1基因，所述的P1op基因为小核糖核酸病毒科的P1的优化基因。

[0016] 上述的表达病毒的重组载体，所述的3C/3CD基因和P1/P1op基因表达在杆状病毒载体质粒的单一启动子下。

[0017] 上述的表达病毒的重组载体，所述的3C/3CD基因和P1/P1op基因表达在杆状病毒载体的Ppolh启动子下。

[0018] 上述的表达病毒的重组载体，所述的3C/3CD基因和P1/P1op基因表达在杆状病毒载体的P10启动子下。

[0019] 进一步的，上述的表达病毒的重组载体，其特征在于，所述的3C基因和P1op基因表达在杆状病毒载体质粒的P10启动子下。

[0020] 本发明还公开了包含该重组载体的病毒样颗粒，将3C/3CD-2A-P1/P1op表达框架的3C/3CD基因置于杆状病毒载体质粒的Ppolh启动子或P10启动子下，转化为DH10a感受态，提取阳性质粒得到各个重组穿梭载体，再将各个穿梭载体转化大肠杆菌DH10bac，筛选阳性重组杆状病毒载体，转染至宿主细胞，自主包装成病毒样颗粒。

[0021] 进一步的，上述的病毒样颗粒，所述的宿主细胞为昆虫细胞Sf9细胞株。

[0022] 为制备该病毒样颗粒，本发明还公开了该病毒样颗粒的制备方法，该方法依次包括下述步骤：

[0023] 1）引物设计

[0024] 对pFast-dual质粒的Ppolh启动子和P10启动子分析，设计3C/3CD-2A和2A-P1基因引物；

[0025] 2）穿梭载体构建

[0026] 以pFast-dual为载体，先采用PCR扩增3C/3CD-2A和2A-P1基因；再采用PCR扩增融合得到3C/3CD-2A-P1片段，回收片段，采用限制性内切酶对片段和pFastBac-dual载体进行酶切后，利用回收片段进行T4连接酶连接，并进行转化DH10a感受态，得到阳性菌落后，提取质粒得到重组的各个穿梭载体；

[0027] 3）重组杆状病毒载体构建

[0028] 将上述构建好的穿梭载体转化大肠杆菌DH10bac，选白色阳性菌落，进行PCR鉴定，得到阳性克隆，经过扩大培养阳性克隆后，提取重组杆粒；

[0029] 4）重组杆状病毒的包装

[0030] 将包含构建病毒样颗粒所需的蛋白编码基因的重组杆粒转染昆虫细胞Sf9后，得到包含构建病毒样颗粒所需的蛋白编码基因重组杆状病毒；

[0031] 5）重组病毒样颗粒表达

[0032] 培养权利上述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，在昆虫细胞中表达构建病毒样颗粒所需的蛋白编码基因，得到构建病毒样颗粒所需的蛋白，所述的构建病毒样颗粒所需蛋白进行自行组装，得到病毒样颗粒，形成的病毒样颗粒分泌到细胞培养上清中；

[0033] 6）重组病毒样纯化

[0034] 将步骤5）中的上清经过初步离心去除大的细胞碎片后，采用切向流浓缩包进行浓缩后，经过分子筛和离子交换两步得到纯化的VLP免疫样品。

[0035] 本发明的最后一个技术方案是将病毒样颗粒作为人或者动物抗小核糖核酸病毒科病毒疫苗的用途。

[0036] 与现有技术相比本发明具有如下优点：

[0037] 1、本发明提供的技术方案采用单独的EV71的3C基因能够切割EV71和Polio病毒的P1序列。

[0038] 2、本发明利用FMDV病毒2A序列连接EV71的3C蛋白和EV71病毒的P1构建的3C-2A-P1融合表达载体，利用单一的启动子，通过重组杆状病毒系统，验证了其能够表达EV71的VLP，同时P1序列能够实现完全的切割，不再带有FMDV病毒2A序列，避免了多余的序列；实现了单一启动子下多个基因的串联表达和准确切割的表达，并成功包装出病毒样颗粒。

[0039] 由于小核糖核酸病毒科病毒的结构蛋白具有同样的组装方式，因此该表达方式能够用于小核糖核酸病毒科病毒的病毒样颗粒的表达和组装，并用做疫苗开发使用。

[0040] 3、本发明制备病毒样颗粒能够诱导高水平的抗体免疫反应和保护效果，同时具有操作简单、表达量高、切割效率高、免疫原性好、不带有外源序列等优点，因此本发明在疫苗开发领域具有广阔的应用前景。

附图说明

[0041] 图1EV71VLP的3C/3CD-2A-P1/P1op表达构建示意图；

[0042] 图2重组杆状病毒质粒PCR鉴定图；

[0043] 图3第一代重组杆状病毒PCR鉴定图；

[0044] 图4重组EV71VLP表达载体表达分析：

[0045] 图4A重组杆状病毒表达VP1蛋白Western Blot分析图，图4B Bac-3C-2A-P1重组病毒空斑进行细胞免疫分析图；

[0046] 图5不同表达方式的重组杆状病毒表达EV71VLP量时序分析图；

[0047] 图6串联表达Bac-P10-3C-2A-P1重组病毒表达VLP分析图：

[0048] 图6A蔗糖纯化样品凝胶电泳图，图6B蔗糖纯化样品WB分析图，图6C蔗糖纯化病毒样颗粒的负染电镜图；

[0049] 图7不同重组病毒表达的EV71病毒样颗粒能够诱导EV71特异性IgG抗体和分析图；

[0050] 图8不同重组病毒表达的EV71病毒样颗粒能够诱导EV71中和抗体分析图；

[0051] 图9EV71中和抗体夹心ELISA检测Bac-P10C-2A-P1op表达的VLP；

[0052] 图10不同重组病毒表达EV71VLP免疫保护研究。

具体实施方式

[0053] 下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。

[0054] 本发明提供的技术方案所使用的材料：

[0055] 材料

[0056] 1主要材料

[0057] 病毒：EV71-B6（疫苗株），EV71-C2（攻击株）；

[0058] 细胞：昆虫细胞Sf9。

[0059] 1.2主要试剂

[0060] 病毒RNA抽提试剂盒（上海生工）；cDNA反转录试剂盒（Fermentas，Thermo）；

[0061] PremerStar DNA聚合酶（大连宝生物）；

[0062] Bac重组杆状质粒提取试剂盒（Omiga生物）；

[0063] EV71抗原ELISA检查试剂盒（北京京天成）；

[0064] 各种DNA消化酶，XhoI、KpnI、XbaI、SpeI，T4连接酶购自Fermentas；

[0065] 卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal、IPTG（北京鼎国）；

[0066] LB培养基（Sigma）；

[0067] Grace's培养基、FBS（Gibco)；

[0068] Cellfectinll脂质体（Sigma）；

[0069] EV71单克隆抗体5C3（本公司制备）；

[0070] HRP羊抗鼠二抗（Invitrogen）。

[0071] 实施例1

[0072] 本发明公开的一种表达病毒的重组载体，将小核糖核酸病毒科的2A序列一端连接小核糖核酸病毒科的3CD基因，另一端连接至小核糖核酸病毒科的P1基因，再将3CD基因置于pFastBac Dual质粒的Ppolh启动子下，获得重组载体Bac-Ph-3CD-2A-P1。

[0073] 实施例2

[0074] 本发明公开的另一种表达病毒的重组载体，将小核糖核酸病毒科的2A序列一端连接小核糖核酸病毒科的3C基因，另一端连接至小核糖核酸病毒科的P1基因，再将小核糖核酸病毒科的3C基因置于pFastBac Dual质粒的Ppolh启动子下，获得重组载体Bac-Ph-3C-2A-P1。

[0075] 实施例3

[0076] 本发明公开的另一种表达病毒的重组载体，将小核糖核酸病毒科的2A序列一端连接小核糖核酸病毒科的3C基因，另一端连接至小核糖核酸病毒科的P1基因，再将小核糖核酸病毒科的3C基因置于pFastBac Dual质粒的P10启动子下，获得重组载体Bac-P10-3C-2A-P1。

[0077] 实施例4

[0078] 本发明公开的另一种表达病毒的重组载体，将小核糖核酸病毒科的2A序列一端连接小核糖核酸病毒科的3C基因，另一端连接至小核糖核酸病毒科的P1基因的优化基因P1op基因，再将小核糖核酸病毒科的3C基因置于pFastBac Dual质粒的P10启动子下，获得重组载体Bac-P10-3C-2A-P1op。

[0079] 基因P1op的优化方法为：

[0080] 参照昆虫细胞密码子表，利用序列优化软件对P1序列进行昆虫细胞密码子偏爱性优化。优化后结果如下：

[0081] GGC TCC CAG GTC TCC ACA CAA CGT TCC GGT TCC CAC GAG AAC TCC AAC TCCGCT ACA GAG GGT TCC ACA ATT AAC TAC ACA ACC ATC AAC TAC TAC AAG GAT TCCTAT GCC GCC ACC GCT GGT AAG CAG TCC CTG AAG CAA GAT CCT GAC AAG TTCGCT AAT CCC GTC AAG GAT ATC TTC ACC GAG ATG GCT GCT CCT CTG AAG TCC CCTTCC GCC GAG GCT TGC GGT TAT TCC GAT CGC GTG GCT CAA CTG ACT ATC GGT AACTCC ACT ATC ACT ACC CAG GAG GCT GCT AAC ATT ATT GTC GGT TAC GGA GAG TGGCCT TCC TAC TGC TCC GAC TCC GAT GCC ACA GCC GTG GAT AAG CCA ACC CGC CCTGAC GTG TCC GTG AAC CGC TTT TAC ACT CTG GAC ACC AAG CTG TGG GAG AAGTCC TCC AAG GGT TGG TAC TGG AAA TTC CCC GAT GTC CTG ACC GAG ACC GGCGTC TTT GGT CAG AAC GCT CAG TTT CAT TAC CTG TAC CGC TCC GGT TTC TGC ATCCAC GTG CAG TGC AAT GCT TCC AAA TTC CAT CAG GGA GCT CTG CTG GTG GCTGTC CTG CCT GAG TAT GTC ATT GGA ACC GTC GCT GGA GGC ACC GGC ACT GAAGAC ACC CAC CCT CCT TAC ATG CAG ACC CAA CCT GGA GCC GAT GGT TTT GAGCTG CAA CAC CCT TAC GTG CTG GAT GCT GGT ATC CCT ATC TCC CAA CTG ACA GTGTGC CCA CAC CAG TGG ATC AAT CTG CGT ACC AAC AAC TGC GCT ACA ATT ATC GTCCCT TAC ATC AAC GCT CTG CCT TTT GAT TCC GCT CTG AAC CAC TGC AAC TTC GGTCTG CTG GTG GTC CCA ATT TCC CCT CTG GAC TAC GAT CAG GGT GCT ACC CCC GTGATT CCA ATC ACC ATC ACC CTG GCT CCT ATG TGC TCC GAG TTC GCT GGA CTG CGTCAG GCT GTC ACC CAG GGT TTC CCT ACC GAG CTG AAG CCC GGT ACA AAC CAATTC CTG ACC ACC GAC GAT GGC GTC TCC GCC CCT ATT CTG CCC AAC TTC CAC CCAACC CCC TGC ATC CAC ATC CCA GGT GAG GTG CGC AAC CTG CTG GAG CTG TGCCAG GTC GAG ACC ATC CTG GAA GTC AAC AAC GTG CCT ACC AAC GCT ACC TCCCTG ATG GAA CGC CTG CGC TTC CCT GTG TCC GCT CAA GCC GGT AAG GGT GAACTG TGC GCT GTG TTC CGC GCT GAT CCC GGA CGC GAC GGC CCT TGG CAA TCCACA CTG CTG GGC CAG CTG TGT GGT TAC TAC ACC CAA TGG TCC GGT TCC CTGGAG GTG ACT TTC ATG TTC ACC GGC TCC TTT ATG GCT ACT GGT AAG ATG CTG ATCGCT TAC ACC CCC CCT GGC GGA CCC CTG CCA AAA GAC CGC GCC ACC GCC ATGCTG GGA ACC CAC GTG ATC TGG GAC TTC GGC CTG CAA TCC TCC GTG ACT CTGGTG ATC CCT TGG ATC TCC AAC ACA CAC TAC CGC GCT CAT GCT CGT GAC GGT GTCTTC GAT TAT TAC ACC ACT GGC CTG GTC TCC ATT TGG TAT CAG ACT AAC TAC GTCGTG CCA ATC GGT GCT CCT AAC ACC GCT TAT ATC ATC GCT CTG GCT GCT GCT CAGAAG AAC TTC ACC ATG AAA CTG TGT AAG GAC GCC TCC GAC ATC CTG CAA ACAGGT ACA ATT CAG GGC GAC CGT GTC GCT GAT GTG ATC GAG TCC TCC ATC GGC GATTCC GTC TCC CGT GCC CTG ACA CAT GCC CTG CCC GCT CCA ACT GGT CAG AAT ACTCAG GTG TCC TCC CAC CGT CTG GAC ACC GGA AAG GTG CCT GCT CTG CAA GCTGCC GAG ATT GGT GCT TCC TCC AAT GCT TCC GAT GAG TCC ATG ATT GAG ACC CGCTGC GTG CTG AAT AGC CAC TCC ACC GCT GAG ACC ACC CTG GAC TCC TTC TTC TCCCGC GCT GGA CTG GTC GGT GAA ATC GAC CTG CCT CTG GAG GGC ACC ACC AATCCT AAC GGC TAC GCC AAC TGG GAT ATC GAC ATC ACA GGA TAC GCT CAG ATG CGCCGC AAG GTG GAG CTG TTC ACC TAC ATG CGC TTC GAC GCT GAA TTT ACC TTT GTGGCT TGC ACC CCT ACA GGT GAG GTC GTG CCC CAG CTG CTG CAG TAC ATG TTCGTC CCT CCT GGT GCT CCT AAG CCT GAT TCC CGT GAA TCC CTG GCT TGG CAG ACCGCT ACC AAC CCC TCC GTG TTC GTG AAG CTG TCC GAC CCT CCC GCT CAG GTGTCC GTG CCA TTC ATG TCC CCT GCT TCC GTC TAC CAG TGG TTC TAC GAC GGT TACCCT ACC TTC GGT GAG CAC AAA CAG GAG AAG GAC CTG GAG TAC GGT GCT TGCCCT AAC AAC ATG ATG GGA ACT TTC TCC GTG CGT ACC GTG GGC ACC TCC AAG TCCAAG TAC CCC CTG GTG GTG CGT ATC TAT ATG CGT ATG AAG CAC GTC CGC GCC TGGATC CCT CGC CCA ATG CGT AAC CAG AAC TAC CTG TTC AAG GCC AAC CCA AACTAC GCT GGT AAC TCC ATT AAG CCT ACC GGA GCT TCC CGT ACC GCT ATC ATC ACCCTG[0082] 实施例5

[0083] 本发明提供的一种病毒样颗粒，将小核糖核酸病毒科的2A序列一端连接小核糖核酸病毒科的3CD基因，另一端连接至小核糖核酸病毒科的P1基因，再将3C基因置于pFastBac Dual质粒的Ppolh启动子下，获得重组穿梭载体Bac-Ph-3CD-2A-P1；再转化为DH10a感受态，提取阳性质粒得到各个重组穿梭载体，再将各个穿梭载体转化大肠杆菌DH10bac，筛选阳性重组杆状病毒载体，转染至昆虫细胞Sf9细胞株，自主包装成病毒样颗粒。

[0084] 实施例6

[0085] 本发明提供的另一种病毒样颗粒，将小核糖核酸病毒科的病毒样2A序列一端连接小核糖核酸病毒科的3C基因，另一端连接至小核糖核酸病毒科的P1基因，再将3C基因置于pFastBacDual质粒的Ppolh启动子下，获得重组穿梭载体Bac-Ph-3C-2A-P1，再转化为DH10a感受态，提取阳性质粒得到各个重组穿梭载体，再将各个穿梭载体转化大肠杆菌DH10bac，筛选阳性重组杆状病毒载体，转染至昆虫细胞Sf9细胞株，自主包装成病毒样颗粒。

[0086] 实施例7

[0087] 本发明提供的另一种病毒样颗粒，将小核糖核酸病毒科的病毒样2A序列一端连接小核糖核酸病毒科的3C基因，另一端连接至小核糖核酸病毒科的P1基因，再将3C基因置于pFastBacDual质粒的P10启动子下，获得重组穿梭载体Bac-P10-3C-2A-P1，再转化为DH10a感受态，提取阳性质粒得到各个重组穿梭载体，再将各个穿梭载体转化大肠杆菌DH10bac，筛选阳性重组杆状病毒载体，转染至昆虫细胞Sf9细胞株，自主包装成病毒样颗粒。

[0088] 实施例8

[0089] 本发明提供的另一种病毒样颗粒，将小核糖核酸病毒科的病毒样2A序列一端连接小核糖核酸病毒科的3C基因，另一端连接至小核糖核酸病毒科的P1op基因，再将整个基因置于pFastBac Dual质粒的P10启动子下，获得重组穿梭载体Bac-P10-3C-2A-P1op，再转化为DH10a感受态，提取阳性质粒得到各个重组穿梭载体，再将各个穿梭载体转化大肠杆菌DH10bac，筛选阳性重组杆状病毒载体，转染至昆虫细胞Sf9细胞株，自主包装成病毒样颗粒。

[0090] 实施例5至实施例8所提供的病毒样颗粒的制备方法，依次包括下述步骤：

[0091] 1、穿梭载体构建

[0092] 1.1引物设计合成

[0093] 以pFast-dual为载体，对其Ppolh和P10启动子分析，根据EV71的B6株P1和3C序列，利用Primer Premier5.0设计引物，引物均由上海捷瑞生物有限公司合成。

[0094]

[0095]

[0096] 1.2、穿梭载体构建

[0097] 以pFast-dual为载体，设计不同的构建方法，构建下表穿梭质粒。

[0098] 1.2.1EV71-B6病毒疫苗株RNA提取步骤：

[0099] 本实验利用上海生工病毒RNA提取试剂盒抽提EV71-B6病毒疫苗株（本公司筛选得到的高免疫原性病毒株）RNA。

[0100] 1.2.2利用Fermentas cDNA反转录试剂盒将EV71-B6RNA反转录为cDNA。

[0101] 1.2.3PCR分别扩增3C/3CD-2A和2A-P1片段

[0102] 利用EV71-B6cDNA序列进行扩增3C/3CD-2A、2A-P1片段

[0103]

[0104] 引物配对方式

[0105]

[0106]

[0107] 反应条件：1）95℃保持5min；2）94℃保持40s，3）55℃保持40s，4）65℃保持3min，步骤2）至4）过程30次；最后在68℃保持10min，回收目的片段，测序。

[0108] 1.2.4PCR融合3C/3CD-2A和2A-P1序列

[0109] 以3C/3CD-2A-1扩增3C/3CD-2A-2直接进行融合PCR。

[0110]

[0111] 引物配对方式

[0112]

[0113] 反应步骤：1）加入两个片段和引物，反应条件：95℃保持5min；94℃保持40s，55℃保持40s，55℃保持3min，步骤2）至4）过程13次，（只加3C-2A-R2（0.1μl））；最后在68℃保持10min。2）只取3μl第一步产物作为模板，按照扩增体系加入其它反应物质，进行第二次扩增。

[0114] 1.2.5不同穿梭载体名称和构建

[0115] 采用下表中的引物分别扩增各个片段，利用对应的限制性内切酶对片段和pFastBac-dual载体进行酶切，回收片段，用T4连接酶连接，并转化DH10a感受态，得到各个重组穿梭载体，参阅图1。

[0116] 不同穿梭载体名称和构建方法表

[0117]

[0118] 2、重组杆状病毒杆粒获得

[0119] 将构建好的上述穿梭载体转化大肠杆菌DH10bac，涂布于含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素、100μg/ml X-gal、40μg/ml IPTG的LB平板，37℃培养48h，蓝白斑筛选白色阳性菌落，挑取白色菌落接种入含有上述抗生素的LB液体培养基中，培养过夜，抽提质粒。

[0120] 利用Bac M13引物(F:GTTTTCCCAGTCACGAC,R:CAGGAAACAGCTAT GAC)和载体构建特异引物对提取的质粒进行PCR鉴定得到阳性克隆。参阅图2，结果表明，所有的重组质粒都可以扩增出相应的目的片段，说明重组质粒构建成功。

[0121] 3、重组杆状病毒的获得

[0122] 3.1重组杆状病毒的包装

[0123] 将1μg Bac重组杆状质粒、6μl Cellfectinll脂质体和100μl未添加FBS和抗5
生素的Gace’sunsupplemented培养基混匀，室温放置45min，转染密度为9*10且活力大于
95%的6孔板Sf9细胞，补加900μl Gace’s unsupplemented培养基，28℃培养5小时，移去脂质体-Bac混合液，换为2ml的5%FBS Grace’s培养基继续培养，每天观察细胞病变情况，4-7天待细胞有明显病变后，收获上清液，即为第一代杆状病毒。

[0124] 提取第一代杆状病毒DNA，利用相应的引物对提取的杆状病毒DNA进行扩增，参阅图3，所有的第一代杆状病毒DNA都可以扩增出相应的目的片段，说明鉴杆状病毒包装成功。

[0125] 3.2重组杆状病毒传代和和扩增

[0126] 第一代杆状病毒滴度不高，用其再次感染昆虫细胞扩增病毒。

[0127] 4、重组杆状病毒表达分析

[0128] 4.1重组杆状病毒表达研究

[0129] 为了验证4个重组杆状病毒VP1的表达情况，用同样0.5MOI的这4个病毒感染6孔板中Sf9细胞后，3天后细胞出现病变，7天后细胞全部裂解，收集杆状病毒上清，取细胞样品进行SDS-PAGE电泳和Western Blot分析，以5C3为一抗，HRP标记羊抗鼠为二抗，利用化学发光法显色。结果表明利用EV71VP1单克隆抗体进行Western Blot检测时，如图4中4A，发现都能检测到单独的VP1蛋白。本实验通过EV71VP1单克隆抗体对在Ppolh启动子下的Bac-Ph3C-2A-P1重组病毒空斑进行细胞免疫分析，如图4中4B，发现VP1单抗能够识别病毒形成的空斑图。

[0130] 4.2、重组杆状病毒时序表达分析

[0131] 为了比较重组病毒的表达量，以0.1moi感染25cmp Sf9悬浮细胞，从48小时开始收样，每隔24小时收集0.5ml上清，离心，保留上清，一共收集7天。然后利用本实验室的两个VP1的单克隆抗体建立的EV71抗原ELISA检测试剂盒对各个样品进行抗原定量，分析重组杆状病毒不同时间表达抗原能力。

[0132] 参阅图5，结果表明各个重组病毒都随着时间的增加，其上清中的抗原含量就越高；在Ppolh启动子下的Bac-Ph-3C-2A-P1表达量为200-300U/ml，表达量稍高于在同一启动子下的Bac-Ph-3CD-2A-P1（150-200U/ml）；表明单独的3C其能够有效地切割P1，能够直接影响目标蛋白的表达水平。P10启动子下的Bac-P10-3C-2A-P1表达量为500-600U/ml，明显高于Bac-Ph-3C-2A-P1，表明在P10启动子下表达量高于Ppolh启动子。在P10启动子下优化后的表达序列Bac-P10-3C-2A-P1op重组病毒表达量是700-800U/ml，高于未优化的Bac-P10-3C-2A-P1，说明经优化的3C-2A-P1op能明显提高表达量。

[0133] 5、Bac-P10-3C-2A-P1重组病毒表达VLP蔗糖纯化

[0134] 利用Bac-P10-3C-2A-P1重组病毒感染Sf9悬浮细胞（300ml细胞/1L容量瓶），培养6天后收获上清。超高速离心4h，收集浓缩液6ml；浓缩液过50%、30%、15%蔗糖梯度，超高速离心4h；收获不同浓度的蔗糖组份，进行抗原含量测定和Western Blot检测。

[0135] 参阅图6，凝胶电泳结果表明只有在组份6、7、8、9中有大小为38、36和26KDa的条带（图6A），其大小分别同EV71VP0、VP1、VP3蛋白大小吻合，并且该组份的蔗糖浓度为28-39%。同时利用VP1的单克隆抗体进行Western Blot检测同样表明VP1蛋白主要集中在这四个组份（图6B）。同时发现在7号组份中出现大小为28KDa条带，其大小同EV71VP2相似，推测该病毒样颗粒中含有VP0被切开的成熟的病毒样颗粒。

[0136] 6、串联表达Bac-P10-3C-2A-P1重组病毒表达VLP电镜检测

[0137] 收集以上6、7、8、9四个抗原含量高的蔗糖组份进行超高速离心脱糖浓缩，1ml PBS溶解沉淀并过0.22um滤膜，得到纯化的EV71病毒样颗粒，然后进行电镜观察。电镜负染结果表明视野中出现高浓度、结构完整的病毒样颗粒，其直径大小为27-29nm（图6C），同其他报道的EV71病毒样颗粒大小和结构相似。表明该表达方式能够产生结构完整的病毒样颗粒。

[0138] 7、重组病毒VLP大规模表达和纯化

[0139] 7.1病毒的澄清和浓缩

[0140] 将病毒装入250ml的离心杯中，配平。使用JA-14转子（BECKMAN）离心收集上清，上清过0.22um的pellicon膜包浓缩10倍得到浓缩液。

[0141] 7.2病毒的超速离心

[0142] 离心管的底部加入3ml的20%（W/W）蔗糖溶液，上层加入浓缩液。用BECKMAN公司SW32Ti转子超高速离心。用PBS溶解沉淀得到重悬液。

[0143] 7.3BAC-VLP的4FF（分子筛）纯化

[0144] 将层析柱（1.6cm（内径）x60cm（柱长），上海锦华公司，填料：Sepharose-4FF，颗粒大小为45～165um，体积88ml，GE公司）用PBS平衡，之后将重悬液用0.22μm的过滤器过滤，上样，然后用PBS进行洗脱。从第一个大峰结束后开始收集样品，每份4ml，直到第二个大峰结束。

[0145] 7.4BAC-VLP的离子交换层析（DEAE）

[0146] 层析柱（填料：DEAE-SepharoseFF，颗粒为90um，体积20ml，GE公司；1.6cm（内径）x20cm（柱长），上海锦华公司）用PB平衡后，将收集的4FF组分混合均匀，上样，A1泵为PB，B1泵为PBS。用4倍柱体积的A1洗脱；之后用4倍柱体积的90%A1+10%B1的缓冲液洗脱；再用4倍柱体积的80%A1+20%B1的缓冲液洗脱。收集该洗脱条件下的组分即为VLP纯化样品，经过以上步骤，纯化样品中的DNA、杂蛋白去除率可以达到99%以上。

[0147] 8、病毒样颗粒疫苗效力分析

[0148] 8.1疫苗的制备

[0149] 将制备的病毒样颗粒溶于PBS缓冲液中，浓度为2mg/ml，然后加入1/10体积的AL(OH)3佐剂（1000mg/ml）混合，分装成100μl每支得到疫苗。

[0150] 8.2疫苗纯度检测

[0151] 根据《中国药典（第3版）》及《中国生物制品规程》，检测疫苗成品的外观，无菌DNA含量、蛋白含量检测，以及PH值等。

[0152] 本实验共试制了两批疫苗，检测结果如表2。两次结果表明两次结果没有明显差异，说明该疫苗制备方法稳定、可靠。

[0153]项目 第一批 第二批
外观 透明液体 透明液体
蛋白含量 <120μg/剂量 <120μg/剂量
DNA含量 <10μg/剂量 <10μg/剂量
内毒素 <100EU/剂量 <100EU/剂量
抗原含量 1.8-2.1mg/剂量 1.9-2.1mg/剂量
无菌检查 阴性 阴性
PH 6.8-7.3 6.8-7.2
效力 通过 通过

[0154] 8.3VLP小鼠免疫

[0155] 为了验证该表达产生的病毒样颗粒的免疫原性，本实验通过大量表达Bac-Ph-3CD-2A-P1、Bac-P10-3C-2A-P1、Bac-P10-3C-2A-P1和Bac-P10-3C-2A-P1op等重组病毒的病毒样颗粒，并经过以上纯化步骤后，利用以上10μg纯化的VLP对六周龄的BALB/c母鼠分别在0，2，4周进行免疫三次，每次每只免疫10μg。同时设置EV71灭活病毒阳性对照和PBS阴性对照。六周后采血。

[0156] 8.4免疫小鼠血清抗体滴度

[0157] 利用浓度为1U/ml纯化的EV71病毒包被板条，包被过夜，每孔100μl。然后用10%FBS进行封闭后，梯度稀释各个血清样品，加入100μl到包被的EV71病毒板中，37度孵育2小时后，洗涤5次后，加入特异性小鼠IgG检测抗体，37度孵育1小时后，加入反应底物显色10min后，加入终止液，读取OD值。其OD值大于本底值0.2以上的为阳性值。

[0158] 参阅图7，结果表明以上各个重组病毒表达的EV71病毒样颗粒能够诱导216以上的EV71特异性IgG抗体，而PBS对照组没有检测到EV71特异性IgG抗体。不同表达形式的病毒样颗粒诱导的特异性抗体水平相差不大，同EV71灭活病毒的免疫原性比较接近。

[0159] 8.5免疫小鼠血清中和抗体滴度

[0160] 取各组小鼠血清样品，用2%的FBS培养基成倍比稀释。将EV71用2%的FBS培养基稀释到100TCID50/100μl。稀释后的病毒液、样品各取300μl，混合均匀，在37度细胞培养箱放置2小时。吸去Vero细胞培养上清，取100μl混合液加入到6个孔Vero细胞中，放入37度继续培养。逐日观察细胞病变，当无血清病毒感染组出现++++病变时，停止观察，记录各个细胞孔的病变情况，并进行计算获得中和效价。结果各个重组病毒表达的EV71病毒样颗粒能够诱导1：125-512以上的EV71中和效价，略低于EV71灭活病毒1：1024（图8）。

[0161] 8.6VLP结合中和抗体能力研究

[0162] 以往报道肠道病毒形成病毒颗粒的过程中，存在两种状态的病毒颗粒：无核酸的空壳病毒颗粒和有核酸的实心颗粒。前者不能结合VP1蛋白的中和抗体，因此免疫原性较差。

[0163] 为了验证本系统表达的VLP是否具有较高的免疫原性，利用两个VP1蛋白同一位点的特异性的中和抗体对Bac-P103C-2A-P1op表达的VLP进行夹心ELISA检测，以验证其是否能够结合这两个抗体。本试验对100μl两个中和抗体7-4和5A10包被过夜后，加入梯度稀释的纯化后的病毒样颗粒和全病毒对照，37度孵育2h，PBST洗涤5次；然后加入用HRP标记的7-4、5A10和EV71兔多抗，37度孵育2h，PBST洗涤5次；加入反应底物显色10min后，加入终止液，读取OD值。加入EV71兔多抗组再加入HRP标记羊抗兔二抗，37度孵育2h，PBST洗涤5次后；加入反应底物显色10min后，加入终止液，读取OD值。结果表明无论用任何一个中和抗体进行包被，另外一个抗体进行检测都能检测VLP，并呈现浓度相关性（图9）。证明该表达的VLP能够被这两个中和抗体识别，保持了中和位点的构象。

[0164] 8.7小鼠保护性分析

[0165] 为了验证表达的VLP是否具有免疫原性，本实验利用小鼠模型进行免疫保护性研究，用5μg不同表达形式得到的VLP腹腔免疫一次7日龄的新生小鼠，14日用EV71-C2株进行攻毒，每组5只小鼠，同时设置EV71-YP3灭活病毒阳性对照和PBS阴性对照。每日记录小鼠发病情况和死亡情况。结果表明其中串联表达的Bac-P103C-2A-P1op和Bac-P103C-2A-P1两组VLP能够完全保护，Bac-Ph3CD-2A-P1和Bac-Ph3C-2A-P1表达的VLP部分保护。