循环利用裂殖壶菌发酵清液生产DHA油脂的方法

摘要

循环利用裂殖壶菌发酵清液生产DHA油脂的方法，利用发酵后固液分离去除菌体的发酵清液配制培养基，发酵生产DHA油脂。本发明发酵清液的循环利用，降低了裂殖壶菌发酵生产废水的排放量，节省了大量废水处理所需的费用，且通过自然沉降获得的部分发酵清液，无需灭菌，可直接投入下一批次发酵使用，降低了能耗，本发明是一种绿色的清洁生产工艺。试验证明，发酵清液的多次循环使用对DHA油脂发酵水平没有影响，具有工业推广应用价值。

权利要求

1.循环利用裂殖壶菌发酵清液的方法，其特征在于，将裂殖壶菌发酵液菌体分离后的发酵清液用于配制所述裂殖弧菌的下一批发酵培养基，菌体分离通过以下步骤实现：A、将发酵罐中的裂殖壶菌发酵液自然沉降1-3小时，让菌体沉降，借助发酵罐内大于缓冲罐的压力，通过取样管及无菌管道将发酵罐上部20-50％的发酵液压出后，导入无菌的缓冲罐备用；

B、对所述发酵罐中部的发酵清液20-30％，通过取样管将其导入膜分离装置，分别收集菌体和发酵清液，将所得的无菌发酵清液导入无菌缓冲罐备用；

C、对所述发酵罐下部的沉降菌体20-60％，进行离心分离，分别收集菌体和发酵清液，将所得发酵清液灭菌后导入无菌缓冲罐备用或导入常规缓冲罐备用。

2.根据权利要求1所述循环利用裂殖壶菌发酵清液的方法，其特征在于，所述步骤A、步骤B、步骤C得到的发酵清液单独使用或结合使用。

3.根据权利要求1所述循环利用裂殖壶菌发酵清液的方法，其特征在于，方式B中所述膜分离装置中膜为陶瓷膜，膜的过滤孔径在0.01-10pm，分离压力为0.1-0.6MPa。

4.根据权利要求1所述循环利用裂殖壶菌发酵清液的方法，其特征在于，采用所述发酵清液配制的每升发酵培养基含：发酵清液0.1-1L，葡萄糖50.0-100.0g，酵母浸粉5.0-15.0g，MgSO40.05-1.0g，KH2PO41.0-3.0g，NaNO33.0-5.0g，海水晶0-10.0g，余量为清水。

5.一种裂殖壶菌发酵生产DHA油脂的方法，包括发酵培养步骤、菌体分离步骤和油脂提取步骤，其特征在于，在所述发酵培养步骤中使用的裂殖弧菌的发酵培养基，使用如权利要求1-4中任一项所述的方法获得的发酵清液来配制。

说明书

循环利用裂殖壶菌发酵清液生产DHA油脂的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物发酵领域，更具体地说，涉及一种循环利用裂殖壶菌发酵清液的方法。

背景技术

[0002] 裂殖壶菌(Schizochytrium limacimum)是一种优良的生产多不饱和脂肪酸油脂的资源。目前，利用裂殖壶菌大规模发酵生产多不饱和脂肪酸油脂得到很多科研院所和单位的关注，并对其生产过程进行了深入的研究。

[0003] 张学成等在公开号CN101824442A中提供了一种裂殖壶菌的发酵生产工艺，可以解决现有技术存在的产量较低、生产成本较高的问题。采用以下技术方案：以豆粕作为主要氮源发酵生产，通过豆粕水解―压滤―发酵培养基的配制―发酵罐体系的设置―裂殖壶菌的收集和干燥制得裂殖壶菌干粉。本发明以豆粕作为主要氮源的裂殖壶菌发酵生产新工艺，不仅降低了发酵生产的成本，而且提高了裂殖壶菌的生长速率，促进裂殖壶菌细胞的脂肪酸积累。将豆粕作为裂殖壶菌发酵生产的培养基组成对降低其生产成本是非常好的尝试。

[0004] 杨勇、郗大兴在公开号CN101892160A中提供了一种海洋真菌裂殖壶菌LX0809，其具有高产二十二碳六烯酸(DHA)的能力。本发明所述的裂殖壶菌LX0809分离自辽宁省盘锦市大洼县赵圈河乡红海滩里采集的腐土，已于2009年12月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3535，所述裂殖壶菌LX0809通过补料发酵，发酵液的细胞干重可达到72.5g/L，DHA的产量达到15.3g/L。LX0809菌体细胞及其提取物既可用作食用油、乳制品和谷物制品等的食品添加剂，也可作为水产和畜牧养殖等的饲料添加剂。菌体细胞中的饱和甘油三酯，经催化转酯化反应可制得生物柴油。对于裂殖壶菌菌体分离、发酵生产、产品应用都进行了细致的研究，对于指导裂殖壶菌的工业应用给出了建设性的意见。

[0005] 但是上述研究中裂殖壶菌发酵产生的发酵清液占发酵用水总量的70.0-80.0%，发酵废水排放量大，处理费用高，且裂殖壶菌培养基过程中，添加一定量的海水晶，使得发酵废水中含有一定的盐度，发酵废水处理工艺较复杂，费用较高。

发明内容

[0006] 为了解决上述问题，降低裂殖壶菌发酵生产废水的排放量，且减少配置发酵培养基的用水量，节省大量水资源及废水处理设备投资和处理费用，本发明提供了一种循环利用裂殖壶菌发酵清液的方法，通过自然沉降获得的部分发酵清液，无需灭菌即可直接投入下一批次发酵所需的无菌培养基，降低了能耗，是一种绿色的清洁生产工艺，具有重要的工业应用价值。

[0007] A、发酵培养步骤

[0008] A1、配制种子培养基：葡萄糖50.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，MgSO42.0g/L，KH2PO42.0g/L；初始pH值为6.0，121℃灭菌30min，冷却备用；

[0009] A2、配制发酵培养基：葡萄糖100.0g/L，酵母浸粉15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO35.0g/L，海水晶10.0g/L；初始pH值为6.0，121℃灭菌30min，冷却备用；

[0010] A3、摇瓶种子培养：向摇瓶种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量为4%（V/V），在摇床转速180rpm、培养温度25.0℃的条件下进行摇瓶培养；

[0011] A4、种子扩大培养：将（1）中摇瓶培养48小时的种子液接入5-50L种子培养罐中，接种量为4%（V/V），在转速180rpm，通气比1.2vvm，培养温度25.0℃的条件下进行种子扩大培养；

[0012] A5、发酵罐放大培养：将（2）中种子扩大培养罐培养48小时的种子液接入100-1000L发酵生产罐中进行培养；接种量为4%（V/V）；通气比0.5-1.5vvm，通过控制搅拌转速调节溶氧水平，其中，发酵1-3天控制溶氧值15-25%，发酵4-7天控制溶氧值5-20%，从发酵第3天开始流加500.0g/L的葡萄糖溶液，控制发酵罐中葡萄糖浓度维持在20.0g/L，发酵7-8天后，停止发酵；

[0013] B、菌体分离步骤

[0014] B1、将发酵罐中的发酵液自然沉降1-3小时，让绝大部分的菌体沉降，此时，发酵清液和沉降菌体之间有明显的界限，借助发酵罐内大于缓冲罐的压力，通过取样管及无菌管道将发酵罐上部20-50%的发酵清液压出后，导入无菌的缓冲罐备用；

[0015] B2、对上述发酵罐中部的含少量菌体的发酵清液20-30%，通过取样管将其导入膜分离装置，分别收集菌体和发酵清液，将所得的无菌发酵清液导入无菌缓冲罐备用；

[0016] B3、对上述发酵罐下部的含水量较高的沉降菌体20-60%以相对离心力6000g离心10min分别收集菌体和发酵清液，将所得发酵清液灭菌后导入无菌缓冲罐备用或导入常规缓冲罐备用；

[0017] C、油脂提取步骤

[0018] 菌体油脂的提取：将上述中取样收集的湿菌体在50-80℃下进行干燥，经粉碎机粉碎后，采用正己烷萃取，回收正己烷，得富含DHA的油脂；

[0019] D、发酵清液的循环使用

[0020] 下一批发酵培养基组成和配比如下：每升培养基含发酵清液0.1-1L，葡萄糖50.0-100.0g，酵母浸粉5.0-15.0g，MgSO40.05-1.0g，KH2PO41.0-3.0g，NaNO33.0-5.0g，海水晶0-
10.0g，余量为清水；

[0021] 裂殖壶菌是一种海洋真菌，较适合生长在盐度高的环境，直接循环利用自身发酵产生的清液对其生产和DHA的合成不会产生影响。

[0022] 本发明优点为：克服了裂殖壶菌发酵过程中产生的生产废水处理难度高、处理费用昂贵等问题，实现了裂殖壶菌发酵清液的循环利用，降低了裂殖壶菌发酵生产废水的排放量；减少了配置发酵培养基的用水量，节省了大量水资源；节约了大量废水处理设备投资和处理费用；通过自然沉降和膜分离获得的部分发酵上清液，无需灭菌，可直接投入下一批次发酵所需的无菌培养基，降低了能耗。本发明是一种绿色的清洁生产工艺。

[0023] 以上提供的裂殖壶菌发酵清液循环利用的方法，通过满足裂殖壶菌发酵过程控制条件，可实现更大规模的发酵生产。

具体实施方式

[0024] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0025] 实施例1

[0026] A、发酵培养步骤

[0027] A1、配制种子培养基：葡萄糖50.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，MgSO42.0g/L，KH2PO42.0g/L；初始pH值为6.0，121℃灭菌30min，冷却备用

[0028] A2、配制发酵培养基：葡萄糖100.0g/L，酵母浸粉15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO35.0g/L，海水晶10.0g/L；初始pH值为6.0，121℃灭菌30min，冷却备用；

[0029] A3、摇瓶种子培养：取-20℃冰箱冻存的裂殖壶菌菌种甘油管8mL，接种至含有200mL上述种子培养基的500mL三角瓶中，在25℃的摇床中以180rpm转速培养48小时；

[0030] A4、种子扩大培养：取120mL摇瓶种子培养液接入装有3L种子培养基的5L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速180rpm，通气比1.2vvm的条件下，培养48小时；

[0031] A5、发酵罐放大培养：将2.4L二级种子液接入含60L如上所述发酵培养基的100L发酵罐中，在25℃培养条件下，通气比1.5vvm，通过调节转速控制溶解氧浓度维持在20%，发酵第3天开始补加500.0g/L的葡萄糖溶液，使得发酵罐内葡萄糖浓度维持在20.0g/L之间，并通过调节转速控制溶氧值维持在15%左右，至发酵第6天停止流加，第8天结束发酵；

[0032] B、菌体分离步骤

[0033] B1、将发酵生产罐中的发酵液自然沉降1小时，让绝大部分的菌体沉降，借助发酵罐内大于缓冲罐的压力，通过取样管及无菌管道将发酵罐上部20%左右的发酵清液压出后，导入无菌的缓冲罐；

[0034] B2、对上述发酵罐中部的含少量菌体的发酵清液20%，通过取样管将其导入膜分离装置，膜的过滤孔径在0.01-10μm，分离压力为0.1MPa，分别收集菌体和发酵清液，将所得的无菌发酵清液导入无菌缓冲罐备用；

[0035] B3、对上述发酵罐下部的含水量较高的沉降菌体60%，通过6000g离心10min，分别收集菌体和发酵清液，将所得发酵清液导入常规缓冲罐备用；

[0036] C、油脂提取步骤

[0037] 菌体油脂的提取：将上述取样收集的湿菌体在50℃下进行干燥，此时菌体干重达49.8g/L，经粉碎机粉碎后，采用正己烷萃取，回收正己烷，得富含DHA的油脂，DHA产量
8.23g/L；

[0038] D、下一批发酵培养基的配制：

[0039] D1、葡萄糖4.5kg，酵母浸粉600.0g，MgSO430.0g，KH2PO4120.0g，NaNO3250.0g，海水晶300.0g，溶于清水30L，121℃，灭菌30min，冷却，补加B1中发酵清液（一次的发酵清液体积不够，需合并两次发酵步骤所得）至100L发酵罐所需的发酵体积60L，调节初始pH值为6.0，发酵操作步骤同上。此时菌体干重达48.5g/L，DHA产量8.04g/L；

[0040] D2、葡萄糖3.0kg，酵母浸粉300.0g，MgSO43.0g，KH2PO460.0g，NaNO3180.0g，海水晶300.0g，溶于清水30L，121℃，灭菌30min，冷却，补加B2中发酵清液（一次的发酵清液体积不够，需合并两次发酵步骤所得）至100L

[0041] 发酵罐所需的发酵体积60L，调节初始pH值为6.0，发酵操作步骤同上。此时菌体干重达42.3g/L，DHA产量7.15g/L；

[0042] D3、葡萄糖6.0kg，酵母浸粉900.0g，MgSO460.0g，KH2PO4180.0g，NaNO3300.0g，海水晶300.0g，溶于清水30L，补加B3中未灭菌发酵清液（一次的发酵清液体积不够，需合并两次发酵步骤所得）至100L发酵罐所需的发酵体积60L，121℃，灭菌30min，冷却，调节初始pH值为6.0，发酵操作步骤同上。此时菌体干重达58.6g/L，DHA产量8.46g/L；

[0043] 实施例2

[0044] 发酵培养步骤同实施例1

[0045] B、菌体分离步骤

[0046] B1、将发酵生产罐中的发酵液自然沉降3小时，让绝大部分的菌体沉降，借助发酵罐内大于缓冲罐的压力，通过取样管及无菌管道将发酵罐上部50%左右的发酵清液压出后，导入无菌的缓冲罐；

[0047] B2、对上述发酵罐中部的含少量菌体的发酵清液30%，通过取样管将其导入膜分离装置，膜的过滤孔径在0.01-10μm，分离压力为0.6MPa，分别收集菌体和发酵清液，将所得的无菌发酵清液导入无菌缓冲罐备用；

[0048] B3、对上述发酵罐下部的含水量较高的沉降菌体20%，通过6000g离心10min，分别收集菌体和发酵清液，将所得发酵清液导入常规缓冲罐备用；

[0049] C、油脂提取步骤

[0050] 菌体油脂的提取：将上述取样收集的湿菌体在80℃下进行干燥，此时菌体干重达49.8g/L，经粉碎机粉碎后，采用正己烷萃取，回收正己烷，得富含DHA油脂，DHA产量8.12g/L；

[0051] D、下一批发酵培养基的配制：

[0052] D1、清水54L，葡萄糖4.5kg，酵母浸粉600.0g，MgSO430.0g，KH2PO4120.0g，NaNO3250.0g，海水晶600.0g，121℃，灭菌30min，冷却，补加B1中发酵清液至100L发酵罐所需的发酵体积60L，调节初始pH值为6.0，发酵操作步骤同上。此时菌体干重达50.9g/L，DHA产量8.15g/L；

[0053] D2、清水54L，葡萄糖3.0kg，酵母浸粉300.0g，MgSO43.0g，KH2PO460.0g，NaNO3180.0g，海水晶600.0g，121℃，灭菌30min，冷却，补加B2中发酵清液至100L发酵罐所需的发酵体积60L，调节初始pH值为6.0，发酵操作步骤同上。此时菌体干重达44.8g/L，DHA产量7.32g/L；

[0054] D3、清水54L，葡萄糖6.0kg，酵母浸粉900.0g，MgSO460.0g，KH2PO4180.0g，NaNO3300.0g，海水晶600.0g，121℃，灭菌30min，冷却，补加B3中发酵清液至100L发酵罐所需的发酵体积60L，调节初始pH值为6.0，发酵操作步骤同上。此时菌体干重达56.3g/L，DHA产量8.47g/L；

[0055] 实施例3

[0056] 发酵培养步骤同实施例1

[0057] B、菌体分离步骤

[0058] B1、将发酵生产罐中的发酵液自然沉降2小时，让绝大部分的菌体沉降，借助发酵罐内大于缓冲罐的压力，通过取样管及无菌管道将发酵罐上部35%左右的发酵清液压出后，导入无菌的缓冲罐；

[0059] B2、对上述发酵罐中部的含少量菌体的发酵清液25%，通过取样管将其导入膜分离装置，膜的过滤孔径在0.01-10μm，分离压力为0.4MPa，分别收集菌体和发酵清液，将所得的无菌发酵清液导入无菌缓冲罐备用；

[0060] B3、对上述发酵罐下部的含水量较高的沉降菌体40%，通过6000g离心10min，分别收集菌体和发酵清液，将所得发酵清液灭菌后导入无菌缓冲罐备用或导入常规缓冲罐备用；

[0061] C、油脂提取步骤

[0062] 将上述取样收集的湿菌体在65℃下进行干燥，此时菌体干重达51.5g/L，经粉碎机粉碎后，采用正己烷萃取，回收正己烷，得富含DHA的油脂，DHA产量8.05g/L；

[0063] D、下一批发酵培养基的配制：

[0064] D1、葡萄糖4.5kg，酵母浸粉600.0g，MgSO430.0g，KH2PO4120.0g，NaNO3250.0g，溶解于20L的B3中未灭菌发酵清液，121℃，灭菌30min，冷却，补加B1发酵清液（一次的发酵清液体积不够，需合并两次发酵步骤所得）至100L发酵罐所需的发酵体积60L，调节初始pH值为6.0，发酵操作步骤同上。此时菌体干重达49.2g/L，DHA产量7.92g/L；

[0065] D2、葡萄糖3.0kg，酵母浸粉300.0g，MgSO43.0g，KH2PO460.0g，NaNO3180.0g，溶解于20L的B3中未灭菌发酵清液，121℃，灭菌30min，冷却，补加B2发酵清液（一次的发酵清液体积不够，需合并两次发酵步骤所得）至100L发酵罐所需的发酵体积60L，调节初始pH值为
6.0，发酵操作步骤同上此时菌体干重达43.1g/L，DHA产量7.34g/L；

[0066] D3、葡萄糖6.0kg，酵母浸粉900.0g，MgSO460.0g，KH2PO4180.0g，NaNO3300.0g，溶解于20L的B3中未灭菌发酵清液，补加B3中未灭菌发酵清液（一次的发酵清液体积不够，需合并两次发酵步骤所得）至100L发酵罐所需的发酵体积60L，121℃，灭菌30min，冷却，调节初始pH值为6.0，发酵操作步骤同上。此时菌体干重达58.4g/L，DHA产量8.62g/L；

[0067] 实施例4

[0068] A、发酵培养步骤同实施例1，

[0069] B、菌体分离步骤同实施例3

[0070] C、油脂提取步骤

[0071] 将上述中取样收集的湿菌体在65℃下进行干燥，此时菌体干重达49.8g/L，经粉碎机粉碎后，采用正己烷萃取，回收正己烷，得富含DHA油脂，DHA产量8.41g/L；

[0072] D、下一批发酵培养基的配制：

[0073] D1、葡萄糖4.5kg，酵母浸粉600.0g，MgSO430.0g，KH2PO4120.0g，NaNO3250.0g，溶解于20L的B3中未灭菌发酵清液，补加B1、B2中未灭菌发酵清液（一次的发酵清液体积不够，需合并两次发酵步骤所得）至100L发酵罐所需的发酵体积60L，调节初始pH值为6.0，121℃，灭菌30min，冷却，发酵操作步骤同上。此时菌体干重达49.7g/L，DHA产量8.03g/L；

[0074] D2、葡萄糖4.5kg，酵母浸粉600.0g，MgSO430.0g，KH2PO4120.0g，NaNO3250.0g，溶解于20L的B3中未灭菌发酵清液，补加B1和已灭菌B3的混合发酵清液（一次的发酵清液体积不够，需合并两次发酵步骤所得）至100L发酵罐所需的发酵体积60L，调节初始pH值为6.0，121℃，灭菌30min，冷却，发酵操作步骤同上。此时菌体干重达51.2g/L，DHA产量8.11g/L；

[0075] D3、葡萄糖4.5kg，酵母浸粉600.0g，MgSO430.0g，KH2PO4120.0g，NaNO3250.0g，溶解于20L的B3中未灭菌发酵清液，补加B2和已灭菌B3的混合发酵清液（一次的发酵清液体积不够，需合并两次发酵步骤所得）至100L发酵罐所需的发酵体积60L，调节初始pH值为6.0，121℃，灭菌30min，冷却，发酵操作步骤同上。此时菌体干重达52.4g/L，DHA产量8.15g/L；

[0076] D4、葡萄糖4.5kg，酵母浸粉600.0g，MgSO430.0g，KH2PO4120.0g，NaNO3250.0g，溶解于20L的B3中未灭菌发酵清液，补加B1、B2和已灭菌B3的混合发酵清液（一次的发酵清液体积不够，需合并两次发酵步骤所得）至100L发酵罐所需的发酵体积60L，调节初始pH值为6.0，121℃，灭菌30min，冷却，发酵操作步骤同上。此时菌体干重达50.6g/L，DHA产量8.13g/L；

[0077] 重复本实施例A、B、C、D4步骤，循环结果如表1所示。

[0078] 表1.100L发酵罐发酵清液循环使用

[0079]

[0080] 实施例5

[0081] A、发酵培养步骤

[0082] A1、配制种子培养基：葡萄糖50.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，MgSO42.0g/L，KH2PO42.0g/L；初始pH值为6.0，121℃灭菌30min，冷却备用；

[0083] A2、配制发酵培养基：葡萄糖100.0g/L，酵母浸粉15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO35.0g/L，海水晶10.0g/L；初始pH值为6.0，121℃灭菌30min，冷却备用；

[0084] A3、摇瓶种子培养：取-20℃冰箱冻存的裂殖壶菌菌种甘油管20mL，接种至含有500mL上述种子培养基的1500mL三角瓶中，在25℃的摇床中以180rpm转速培养48小时；

[0085] A4、种子扩大培养：将480mL摇瓶种子培养液接入装有12L种子培养基的20L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速180rpm，通气比1.2vvm的条件下，培养48小时；

[0086] A5、发酵罐放大培养：将12L三级种子液接入含300L如上述发酵培养的500L发酵罐中，维持发酵温度25℃，通气比0.6vvm，通过控制搅拌转速调节溶氧水平，前3天控制溶氧值维持在15%左右，发酵第3天开始补加500.0g/L的葡萄糖溶液，使得发酵罐内葡萄糖浓度维持在20.0g/L，并控制溶氧值维持在10%左右，至发酵第6天停止流加，第8天结束发酵；

[0087] B、菌体分离步骤同实施例3

[0088] C、油脂提取步骤

[0089] 将上述取样收集的湿菌体在50℃下进行干燥，此时菌体干重达49.8g/L，经粉碎机粉碎后，采用正己烷萃取，回收正己烷，得富含DHA油脂，DHA产量7.74g/L；

[0090] D、下一批发酵培养基的配制：

[0091] 葡萄糖22.5kg，酵母浸粉3kg，MgSO4150.0g，KH2PO40.6kg，NaNO31.25kg，溶解于B3中未灭菌发酵清液，补加清水10L，121℃，灭菌30min，冷却，将菌体分离步骤B1、B2发酵清液混合后补加至500L发酵罐中所需的发酵体积300L，调节初始pH值为6.0，发酵操作步骤同上。此时菌体干重达48.6g/L，DHA产量7.85g/L；

[0092] 重复本实施例A、B、C、D步骤，循环结果如表2所示。

[0093] 表2.500L发酵罐发酵清液循环使用

[0094]

[0095] 实施例6

[0096] A、发酵培养步骤

[0097] A1、配制种子培养基：葡萄糖50.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，MgSO42.0g/L，KH2PO42.0g/L；初始pH值为6.0，121℃灭菌30min，冷却备用；

[0098] A2、配制发酵培养基：葡萄糖100.0g/L，酵母浸粉15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO35.0g/L，海水晶10.0g/L；初始pH值为6.0，121℃灭菌30min，冷却备用；

[0099] A3、摇瓶种子培养：取-20℃冰箱冻存的裂殖壶菌菌种甘油管20mL，接种至含有500mL上述种子培养基的1500mL三角瓶中，在25℃的摇床中以180rpm转速培养48小时；

[0100] A4、种子扩大培养：取120mL摇瓶种子培养液接入装有3L种子培养基的5L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速180rpm，通气比1.2vvm的条件下，培养48小时；将3L二级种子液接入含30L如上所述种子培养基的50L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速180rpm，通气量1vvm的条件下，培养48小时；

[0101] A5、发酵罐放大培养：将24L三级种子液接入含600L如上述发酵培养的1000L发酵罐中，维持发酵温度25℃，通气比0.6vvm，通过控制搅拌转速调节溶氧水平，前3天控制溶氧值维持在15%左右，发酵第3天开始补加500.0g/L的葡萄糖溶液，使得发酵罐内葡萄糖浓度维持在20.0g/L，并控制溶氧值维持在10%左右，至发酵第6天停止流加，第8天结束发酵；

[0102] B、菌体分离步骤同实施例3

[0103] C、油脂提取步骤