提高井冈霉素发酵水平的方法

摘要

一种提高井冈霉素发酵水平的方法，通过在吸水链霉菌井冈变种5008中双缺失转录负调控基因SHJG7318和SHJG4003，实现井冈霉素产量和产率的提高。本发明所得到工程菌株井冈霉素的发酵产量提高50％以上，抗生素合成速率加快，生产率由2.1克／升／天提高到4.1克／升／天，提高幅度近一倍。

权利要求

1.一种提高井冈霉素发酵水平的方法，其特征在于：通过在吸水链霉菌井冈亚种5008染色体上引入基因突变，导致转录负调控基因SHJG7318和SHJG4003的双失活，使井冈霉素在发酵中的产量得以提高；具体步骤如下：第一步：设计并构建用于SHJG7318进行失活的同源重组质粒载体I和用于SHJG4003失活的同源重组质粒载体II；

第二步：将第一步构建得到的质粒载体I结合转移导入受体菌吸水链霉菌5008井冈亚种中进行同源重组；

第三步：通过对突变株的筛选和验证硫链丝菌素抗性验证，并通过PCR产物片段大小的差异筛选得到SHJG7318突变株；

第四步：将第一步构建得到的质粒载体II结合转移导入第三步构建得到的SHJG7318突变株中进行同源重组；

第五步：通过对突变株的筛选和验证硫链丝菌素抗性验证，并通过PCR产物片段大小的差异筛选得到SHJG7318和SHJG4003的双缺失突变株；

上述SHJG7318基因的序列如SEQ ID NO.1所示；SHJG4003基因的序列如SEQ ID NO.2所示；

所述质粒载体I的构建方法是：在质粒pJTU1278的EcoRI/SacI位点插入来自SHJG7318左臂1.57kb PCR片段和SHJG7318右臂1.47kb PCR片段；所述质粒载体II的构建方法是：在pJTU1278的KpnI/SacI位点插入来自SHJG4003左臂1.48kbPCR片段和SHJG4003右臂1.49kb PCR片段。

2.权利要求1所述提高井冈霉素发酵水平的方法，其特征在于：所述发酵是指，将链霉菌孢子或者菌丝体在种子培养基中于37摄氏度，220转/分钟的转速下培养15～20小时后转接发酵培养基发酵120小时。

3.如权利要求2所述的提高井冈霉素发酵水平的方法，其特征在于：所述种子培养基含有以下重量百分含量的成份：玉米粉3％、豆粕粉2.2％、酵母提取物1％、氯化钠0.2％、磷酸二氢钾0.08％；所述发酵培养基含有以下重量百分含量的成份：玉米粉10％、豆粕粉

2.5％、酵母提取物0.5％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.15％。

4.如权利要求2所述的提高井冈霉素发酵水平的方法，其特征在于：种子培养物按

10％的接种量转接于发酵培养基。

说明书

提高井冈霉素发酵水平的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程，尤其涉及一种提高井冈霉素发酵水平的方法。

背景技术

[0002] 放线菌是一类高GC含量的革兰氏阳性菌，目前已知抗生素中有60％以上是由放线菌合成。链霉菌是一类高等放线菌，具有强大的抗生素合成能力和复杂的形态分化，故一直受到人们的关注。自上世纪六十年代，有关以A因子为代表的γ-丁内酯类自诱导信号分子在链霉菌次级代谢与分化中的作用及其机制，已有大量报道。但是，在不同链霉菌中其调控作用和方式也不尽相同，尚存在不少需要深入研究的科学问题。深入研究γ-丁内酯调控系统对链霉菌工业菌株的次级代谢的调控作用及其机制，将为如何利用代谢调控和代谢工程来提高抗生素的工业发酵水平提供重要的理论指导。

[0003] 井冈霉素，又称有效霉素，是一种由吸水链霉菌井冈亚种5008(简称5008)产生的C7N氨基环醇类抗生素。由于井冈霉素能抑制真菌生长，可高效防治水稻纹枯病，故被广泛用于我国和亚洲其他水稻产区。此外，井冈霉素及有效氧胺等其他井冈霉素生物合成的中间产物都可用于生产治疗II型糖尿病的药物。鉴于井冈霉素的重要性，本申请人在2005年鉴定完成了井冈霉素生物合成基因簇，2012年完成了5008的全基因组测序。通过对基因组进行分析，在其染色体上找到了多套包括A因子受体蛋白在内的相关的A因子调控网络相关的同源基因，这暗示5008中可能存在类A因子级联系统；并且类A因子级联系统可能参与了井冈霉素生物合成的调控。

[0004] 通过文献调研，我们发现提高valABC等井冈霉素合成基因簇中结构基因的转录水平是井冈霉素高产的必要条件，并且AdpA同源蛋白AdpA-H作为全局调控蛋白能正调控valABC基因的转录。adpA基因的转录一般受A因子受体蛋白的负调控，为此通过解除转录负调控蛋白的抑制作用，增强adpA-H的表达水平，进而提高基因簇转录水平，可能是值得尝试的一种提高井冈霉素发酵水平的策略。目前已知所有的A因子受体蛋白都是TetR转录调控家族的成员，而TetR在细菌中可以通过抑制转录进而调控次级代谢。前期的研究表明通过基因工程的方法对这些TetR基因进行改造可以提高抗生素合成的水平。在链霉菌的类A因子调控系统中，通过失活受体蛋白如BarA、FarA和TylP，的确可上调抗生素合成基因簇的转录水平，进而有效的提高抗生素的产量。然而对于5008中这种多套A因子受体蛋白同源基因的调控系统而言，是否可以通过多基因的缺失来增加井冈霉素合成基因簇的转录水平，最终进一步的提高抗生素的发酵水平并不清楚。为此，本发明尝试通过多基因缺失找到提高井冈霉素高产的方法，以助于降低井冈霉素工业化生产的成本。

发明内容

[0005] 本发明的目的，在于提供一种提高井冈霉素发酵水平的方法，通过解除转录负调控基因的抑制作用，提高井冈霉素合成基因簇的转录水平来实现井冈霉素的高产。

[0006] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

[0007] 一种提高井冈霉素发酵水平的方法，是通过在吸水链霉菌井冈亚种5008染色体上引入基因突变，导致转录负调控基因SHJG7318和SHJG4003的双失活，使井冈霉素在发酵中的产量得以提高；具体步骤如下：

[0008] 第一步：设计并构建用于SHJG7318进行失活的同源重组质粒载体I和用于SHJG4003失活的同源重组质粒载体II；

[0009] 第二步：将第一步构建得到的质粒载体I结合转移导入受体菌吸水链霉菌5008井冈亚种中进行同源重组；

[0010] 第三步：通过对突变株的筛选和验证硫链丝菌素抗性验证，并通过PCR产物片段大小的差异筛选得到SHJG7318突变株；

[0011] 第四步：将第一步构建得到的质粒载体II结合转移导入第三步构建得到的SHJG7318突变株中进行同源重组；

[0012] 第五步：通过对突变株的筛选和验证硫链丝菌素抗性验证，并通过PCR产物片段大小的差异筛选得到SHJG7318和SHJG4003的双缺失突变株。

[0013] 所述质粒载体I的构建方法是：在质粒pJTU1278的EcoRI／SacI位点插入来自SHJG7318左臂1.57kb PCR片段和SHJG7318右臂1.47kb PCR片段；所述质粒载体II的构建方法是：在pJTU1278的KpnI／SacI位点插入来自SHJG4003左臂1.48kb PCR片段和SHJG4003右臂1.49kb PCR片段。

[0014] 所述发酵是指，将链霉菌孢子或者菌丝体在种子培养基中于37摄氏度，220转／分钟的转速下培养15～20小时后转接发酵培养基发酵120小时。

[0015] 所述种子培养基含有以下重量百分含量的成份：玉米粉3％、豆粕粉2.2％、酵母提取物1％、氯化钠0.2％、磷酸二氢钾0.08％；所述发酵培养基含有以下重量百分含量的成份：：玉米粉10％、豆粕粉2.5％、酵母提取物0.5％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.15％。

[0016] 种子培养物按10％的接种量转接于发酵培养基。

[0017] 上述SHJG7318基因的序列如SEQ ID NO.1所示；SHJG4003基因的序列如SEQ IDNO.2所示。

[0018] 本发明通过在染色体上置换的方法，使得A因子受体蛋白家族转录调控基因SHJG7318和SHJG4003双缺失。本发明所得到的工程菌株其井冈霉素的产量都大幅提高。

[0019] 本发明具有以下效果：本发明可以解除调控蛋白对井冈霉素合成基因簇转录的抑制，使井冈霉素的合成基因转录水平提高，最终井冈霉素测发酵产量提高了50％以上，产率由2.1克／升／天提高到4.1克／升／天，通过本发明可显著提高井冈霉素的发酵效率，同时使发酵成本大幅降低。

[0020] 本发明所涉及的菌株吸水链霉菌5008已经SCI数据库文献《Bai L，Li L，Xu H，Minagawa K，Yu Y，ZhangY，Zhou X，Floss HG，Mahmud T，Deng Z：Functional analysis of the validamycin biosynthetic gene cluster and engineered production of validoxylamine A.Chemistry and Biology2006，13(4)：387-397.》中公开[0021] 本发明所涉及的质粒pJTU1278已经在SCI数据库文献《He Y，Wang Z，Bai L，Liang J，Zhou X，Deng Z：Two pHZ1358derivative vectors for efficient gene knockout in Streptomyces.Journal of Microbiology and Biotechnology2010，20(4)：678-682.》中公开。

附图说明

[0022] 图1为野生型菌株5008基因失活衍生得到双缺失菌株的示意图；

[0023] 其中的质粒pLQ204将野生型菌株5008中的SHJG7318基因失活，得到单基因突变株ΔSHJG7318；质粒pLQ207将突变株ΔSHJG7318中的SHJG4003基因失活，得到基因双缺失菌株ΔSHJG7318／4003；

[0024] 图2为双缺失菌株全局调控基因adpA-H的转录变化示意图；

[0025] 图3为双缺失菌株井冈霉素合成基因valABC的转录变化示意图；

[0026] 图4为基因缺失突变株与野生型菌株5008的井冈霉素发酵产量示意图。

具体实施方式

[0027] 以下实施例将结合附图对本发明进一步作说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，并给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件和实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。

[0028] 实施例1

[0029] 步骤一：质粒pLQ204和pLQ207的构建

[0030] 以吸水链霉菌5008的基因组DNA为模板，分别使用两组引物7318upF／7318upR、7318dnF／7318dnR通过PCR扩增得到SHJG7318左侧1.29kb的同源臂及右侧1.34kb的同源臂，通过基因测序确认同源臂的正确性；在质粒pJTU1278的EcoRI／SacI位点插入来自SHJG7318左臂1.29kb PCR片段(EcoRI／HindIII)和SHJG7318右臂1.34kb PCR片段(HindIII／SacI)；通过上述方法得到用于SHJG7318基因缺失的质粒pLQ204。在37摄氏度水浴条件下，采用SacI，HindIII和EcoRI三种限制性内切酶进行酶切处理可以观察到
1.34kb和1.27kb的两条目标条带，表明质粒构建正确。

[0031] 以吸水链霉菌5008的基因组DNA为模板，分别使用两组引物arp3_up_F／arp3_up_R、arp3_dw_F／arp3_dw_R通过PCR扩增得到SHJG4003左侧1.48kb的同源臂及右侧1.49kb的同源臂，通过基因测序确认同源臂的正确性；其构建方法是在pJTU1278的KpnI／SacI位点插入来自SHJG4003左臂1.48kb PCR片段(KpnI／HindIII)和SHJG4003右臂I.49kb PCR片段(HindIII／SacI)；通过上述方法得到用于SHJG7318基因缺失的质粒pLQ207。在37摄氏度水浴条件下，采用SacI和KpnI两种限制性内切酶进行酶切处理可以观察到目标条带，表明质粒构建正确。

[0032] 步骤二：将用于和染色体发生重组的质粒pLQ204导入野生型菌株5008，并筛选得到SHJG7318基因缺失突变株。

[0033] 图1A示意了SHJG7318缺失的过程。具体操作如下：将已构建完成用于基因缺失的质粒pLQ204转化进入宿主ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取ET12567于含有Amp，Kan和Chi三种抗生素的LB中于37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按10％的比例转接一次并培养2.5小时，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。于此同时制备野生型菌株5008的新鲜孢子约109个，用TES溶液漂洗2～3次之后再用
2mLTES溶液悬浮孢子，于50℃热激10min后再冷却至室温，等体积加入2×孢子预萌发培养液后于37℃培养3小时。将预萌发的孢子液与之前制备的宿主菌ET12567混合(孢子和宿主菌的比例约为10∶1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30℃培养箱正置培养16小时后取出平板，分别取Thio和萘啶酮酸两种抗生素的储存液40μL和12μL加入1.5mL无菌水中混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30℃培养箱中培养。一般3～5天后可见平板上有单菌落结合子长出，采用7318YZF／7318YZR为引物，通过菌丝体PCR和抗性验证的方法验证结合子正确后划线接种至SFM平板，30℃培养至产孢，收集孢子后按稀释107～108后接种至SFM平板培养2～3天可得到单菌。继续采用7318YZF／
7318YZR为引物，通过菌丝体PCR的方法对单菌落筛选得到SHJG7318基因缺失突变株。

[0034] 上述步骤二中所用到的引物序列如表1所示：

[0035] 表1

[0036]

[0037] SHJG7318左右同源臂制备PCR反应体系和条件：DNA模板30ng，引物30pmol，50％DMSO3μL，25mM Mg2+2μL，缓冲液3μL，KOD聚合酶1个单位，加纯水补齐至30μL；PCR条件：95摄氏度5分钟；95摄氏度30秒；60摄氏度30秒；68摄氏度1分30秒；循环30次；68摄氏度10分钟。

[0038] SHJG7318结合转移子和突变株筛选时的PCR体系和条件：DNA模板10～100ng，引物30pmol，50％DMSO3μL，缓冲液3μL，Taq聚合酶0.5个单位，加纯水补齐至30μL，；PCR条件：95摄氏度5分钟；95摄氏度30秒；60摄氏度30秒；72摄氏度1分钟；循环30次；72摄氏度10分钟。

[0039] 步骤三：将用于和染色体发生重组的质粒pLQ207导入SHJG7318基因缺失突变株中，并筛选得到SHJG7318／SHJG4003基因双缺失突变株

[0040] 图1B示意了在SHJG7318缺失突变株中进一步缺失SHJG4003的过程。具体操作如下：将已构建完成用于基因缺失的质粒pLQ207转化进入宿主ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取ET12567于含有Amp，Kan和Chl三种抗生素的LB中于37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按10％的比例转接一次并培养2.5小时，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。于此同时制备SHJG7318基因缺失去突变株的新鲜孢子约109个，用TES溶液漂洗2～3次之后再用2mLTES溶液悬浮孢子，于50℃热激10min后再冷却至室温，等体积加入2×孢子预萌发培养液后于37℃培养3小时。将预萌发的孢子液与之前制备的宿主菌ET12567混合(孢子和宿主菌的比例约为10∶1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30℃培养箱正置培养16小时后取出平板，分别取Thio和萘啶酮酸两种抗生素的储存液40μL和12μL加入1.5mL无菌水中混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30℃培养箱中培养。一般3～5天后可见平板上有单菌落结合子长出，采用arpA3YZ_F／arpA3_YZ_R为引物，通过菌丝体PCR和抗性验证的方法验证结合子正确后划线接种至SFM平板，30℃培养至产孢，收集孢子后按稀释107～108后接种至SFM平板培养2～3天可得到单菌。继续采用arpA3_YZ_F／arpA3_YZ_R为引物，通过菌丝体PCR的方法对单菌落筛选得到SHJG7318／SHJG4003基因双缺失突变株。

[0041] 上述步骤三中所用到的引物序列如表2所示：

[0042] 表2

[0043]

[0044]

[0045] SHJG4003左右同源臂制备PCR反应体系和条件同步骤二中SHJG7318左右同源臂制备PCR反应体系和条件。

[0046] SHJG7318／SHJG4003结合转移子和双缺失突变株筛选时的PCR体系同步骤二中SHJG7318结合转移子和突变株筛选时的PCR体系和条件。

[0047] 步骤四，双缺失菌株的发酵培养

[0048] 种子培养基含有：玉米粉3％、豆粕粉2.2％、酵母提取物1％、氯化钠0.2％、磷酸二氢钾0.08％；发酵培养基含有：玉米粉10％、豆粕粉2.5％、酵母提取物0.5％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.15％。

[0049] 步骤五，双缺失菌株valABC的mRNA转录水平的测定

[0050] 用于RNA提取的样品一般都保存在Redzoll溶液中。RNA提取过程要求低温，离心过程除特殊说明，均在4℃12000转／min的条件下进行。取已经破碎处理的样品500μL加入100μL氯仿涡旋振荡混匀，离心15min后吸取上清液，加入100μL无水乙醇并混匀后将样品吸入离心柱(赛百盛)中，静置2min，离心1min，弃液体，用漂洗液(Washing buffer，赛百盛)漂洗两次，弃液体，将离心柱置于收集管中继续离心2min。换用新的收集管，往离心柱中加入60μL DEPC处理过的水，离心2min，将RNA样品从离心柱上洗脱下来。用Nanodrop2000型核酸蛋白分析仪测定RNA的浓度和OD260／280，提取后的RNA样品-80℃保存。RNA样品的消化反应体系可参照表2.2配制，反应体系置于37℃孵育4小时后每个反应体系加入5μL50mM EDTA后65℃加热10min即可终止消化，消化好的RNA样品-80℃保存。RNA经过逆转录后就得到cDNA，可用于后续的基因转录分析。

[0051] 取cDNA样品用DEPC处理水稀释至合适的浓度，配制qRT-PCR体系(2×SYBR Green缓冲液10μL，引物20pmol，cDNA5μL，加DEPC水至体积20μL)，离心去掉溶液中的气泡之后使用ABI公司7500型快速RT-PCR仪测定样品Ct值。采用hrdB作为看家基因测定adpA-H和valABC的转录水平。收集的数据使用2-ΔΔCT法进行处理。一般对照组样品的基因转录水平设参比为1，实验组样品基因转录与之比较即得到实验组基因转录改变的倍数。

[0052] 上述测定基因转录水平时使用的引物如表3所示：

[0053] 表3

[0054]

[0055] 图2为基因缺失菌株与野生型菌株5008的adpA-H的转录分析结果。结果表明SHSG7318基因缺失后，全局调控基因adpA-H的转录水平仅在发酵24小时有50％以上的提高；双缺失SHJG7318／SHJG4003之后，adpA-H的转录水平在发酵12至48小时均处于较高的转录水平。

[0056] 图3为基因缺失菌株与野生型菌株5008的valABC的转录分析结果。结果表明SHJG7318基因缺失后，valABC的转录水平有2倍左右的提高；双缺失SHJG7318／SHJG4003之后，valABC的转录水平有进一步的提高，在发酵前期转录水平提高的幅度接近5倍。

[0057] 步骤六，利用HPLC检测井冈霉素的发酵产量

[0058] 使用Agilent公司的Agilent1200系列HPLC进行色谱分析，采用DAD二极管阵列检测器测定210nm下的色谱吸收峰。色谱柱的参数为：Agilent ZORBAX SB-Aq，3.5μm，2.1×150mm；流动性流速为0.1mL／min：流动相：98％(v／v)的5μM的磷酸盐缓冲液和
2％(v／v)的HPLC级甲醇。柱温：室温。

[0059] 图4为基因缺失菌株与野生型菌株5008的井冈霉素发酵水平检测。结果表明SHJG7318基因缺失之后井冈霉素的发酵水平有显著的提高，进一步双缺失SHJG7318／SHJG4003之后，井冈霉素的发酵产量提高幅度超过50％，产率由2.1克／升／天提高到4.1克／升／天，提高的幅度接近200％。

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