基于氮杂化介孔碳的生物传感器、制备方法及其应用

摘要

本发明涉及一种基于氮杂化介孔碳的生物传感器、制备方法及其应用，包括工作电极，所述工作电极包括玻碳电极，所述玻碳电极的检测端表面依次连接有L?半胱氨酸、氮杂化介孔碳、金纳米粒子膜和巯基修饰的捕获探针，所述金纳米粒子膜上还连接有巯基乙醇；本发明还提供一种基于氮杂化介孔碳的生物传感器的应用，步骤是将含有目标链的待测液和含有信号探针的液体滴加在工作电极表面，滴加含有纳米金团簇标记辣根过氧化物酶?链酶亲和素的缓冲液，在接有三电极系统的电解池中，以对苯二酚和过氧化氢为底物，测量，本发明灵敏度高，响应快速，检测精度高，抗干扰性较强，应用操作简便，高效，检测成本低。

权利要求

1.一种基于氮杂化介孔碳的生物传感器在测量锰过氧化物酶特定编码基因片段浓度的应用，其特征是，所述基于氮杂化介孔碳的生物传感器包括工作电极，所述工作电极包括玻碳电极，所述玻碳电极的检测端表面依次连接有L-半胱氨酸、氮杂化介孔碳、金纳米粒子膜和巯基修饰的捕获探针，所述金纳米粒子膜上还连接有封闭金纳米粒子膜剩余结合位点的巯基乙醇；所述巯基修饰的捕获探针为：5'-HS-(CH2)6-T1-3'，T1的碱基序列为5'-CTGATGGTGTCGTGTTTCT-3'；

所述应用方法为：将含有目标链的待测液和含有信号探针的液体滴加在所述基于氮杂化介孔碳的生物传感器的工作电极表面，反应完成后，滴加含有纳米金团簇标记辣根过氧化物酶-链酶亲和素的缓冲液，最后在接有三电极系统的电解池中，以对苯二酚和过氧化氢为底物，进行测量，根据线性回归方程得到待测液中目标链的浓度，所述线性回归方程为：；

-1

其中，Y为电流平均值；X为目标链浓度的自然对数，单位是mol∙L ；目标链浓度的线性范围为1×10−19～1×10−10 M，测量下限为2×10−20 M；

所述信号探针为：5'-T2-biotin-3'，T2的碱基序列为5'-GATGCCGTTGTTGGCGGAGAA-3'；

所述待测液中目标链的碱基序列为：5'-TTCTCCGCCAACAACGGCATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGAAACACGACACCATCAG-3'；

所述纳米金团簇标记辣根过氧化物酶-链酶亲和素的制备方法为，将氯金酸溶液和辣根过氧化物酶-链酶亲和素溶液混合，搅拌条件下滴加抗坏血酸溶液，溶液变浑浊后加入强碱溶液，搅拌，静置，透析，得到纳米金团簇标记辣根过氧化物酶-链酶亲和素，所述氯金酸、辣根过氧化物酶-链酶亲和素、抗坏血酸的质量配比为50～100:4～9:1～1.5。

2.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述氮杂化介孔碳的制备方法为，将介孔硅材料、四氯化碳、乙二胺混合，介孔硅材料、四氯化碳、乙二胺的重量比为0.5～1.5:3:1.35，在

90～100℃下加热搅拌，冷凝回流，干燥，置于氮气，或者氮气与氢气的混合气体中，加热至

600～900℃，反应完毕后，加入氢氟酸，过滤，洗涤，干燥，得氮杂化介孔碳。

3.如权利要求2所述的应用，其特征是，所述介孔硅材料为介孔硅模板SBA-15，所述介孔硅模板SBA-15的制备方法为，将嵌段共聚物P123置于盐酸中溶解，然后逐滴加入正硅酸乙酯，嵌段共聚物P123与正硅酸乙酯的质量比为8:17～23，温度控制在30～35℃，搅拌，得混合物，然后将所述混合物在140～150℃加热，反应完全后，抽滤，洗涤至中性，风干，再在

530～550℃焙烧，得到介孔硅模板SBA-15。

4.根据权利要求有1所述的应用，其特征是，所述工作电极的制备方法为，在玻碳电极上通过电化学法沉积L-半胱氨酸，然后加入氮杂化介孔碳悬浮液，最后电化学法沉积金纳米粒子，得到修饰电极；将巯基修饰的捕获探针加入到所述修饰电极上，然后加入巯基乙醇，清洗，得到所述工作电极。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是，所述氮杂化介孔碳悬浮液的分散剂为N,N-二甲基甲酰胺或超纯水。

6.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述含有纳米金团簇标记辣根过氧化物酶-链酶亲和素的缓冲液为磷酸盐缓冲溶液，pH为6.5～7.5。

说明书

基于氮杂化介孔碳的生物传感器、制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物传感器，具体是涉及到一种基于氮杂化介孔碳的生物传感器、制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 在陆地生态系统中，木质素是一种广泛存在于植物体中的无定形、分子结构中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物，在农业和城市生活垃圾中非常常见，并且在木本植物中的含量占25%，是世界上仅次于纤维素的第二位最丰富的有机物。木质素的自然降解速度非常缓慢，通常采用堆积或焚烧的方法处理，不仅会产生诸如COx、甲烷等大量有害气体，同时造成资源浪费，因而生物降解木质素对于环境资源更有益处。白腐真菌对木质素具有生物降解能力。白腐真菌可以分泌出一些诸如漆酶、锰过氧化物酶、LiP等氧化胞外酶降解木质素，其中尤以锰过氧化物酶（MnP）的作用最为关键。因此，检测MnP的特征编码基因，可以有效地了解真菌生物降解木质素过程中分泌的MnP的动态变化，从而可以更加准确有效地控制整个生物降解过程。

[0003] 采用生物传感技术检测基因片段是基因分析检测的一个趋势，其中电化学传感器受到广泛的关注，因为其具备响应快速，高灵敏，高选择性和可操作性强等优点。对于DNA传感器，常见的工作电极是金电极或者基于纳米金的筛网印刷电极，因为修饰有巯基的基因探针通过巯基与金的交联，很容易装配在电极表面，进行相关检测。不过，金电极价格昂贵，而筛网印刷电极是一次性电极，对于大量检测而言，其总花费也很可观。

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高灵敏、快速响应、高检测精度及较强抗干扰性的基于氮杂化介孔碳的生物传感器，本发明还提供一种简单的基于氮杂化介孔碳的生物传感器的制备方法，本发明还提供一种基于氮杂化介孔碳的生物传感器在锰过氧化物酶特定编码基因片段浓度测量方面的应用，所述应用操作简便，高效，测量成本低。

[0005] 本发明提出的技术方案为，

[0006] 一种基于氮杂化介孔碳的生物传感器，包括工作电极，所述工作电极包括玻碳电极，所述玻碳电极的检测端表面依次连接有L-半胱氨酸、氮杂化介孔碳、金纳米粒子膜和巯基修饰的捕获探针，所述金纳米粒子膜上还连接有封闭金纳米粒子膜剩余结合位点的巯基乙醇。

[0007] 本发明的基于氮杂化介孔碳的生物传感器优选为三电极电化学传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，所述参比电极优选为饱和甘汞电极，所述对电极优选为铂电极。

[0008] 本发明的所述玻碳电极的检测端表面沉积有L-半胱氨酸，L-半胱氨酸连接有氮杂化介孔碳，氮杂化介孔碳外侧连接有金纳米粒子膜，所述金纳米粒子膜连接有巯基修饰的捕获探针，所述金纳米粒子膜上还连接有封闭金纳米粒子膜剩余结合位点的巯基乙醇，使金纳米粒子不与信号探针或者锰过氧化物酶特定编码基因片段等结合。

[0009] 所述巯基修饰的捕获探针为：5'-HS-(CH2)6-T1-3'，T1的碱基序列（即SEQ ID NO.1）为5'-CTGATGGTGTCGTGTTTCT-3'。

[0010] 所述氮杂化介孔碳的制备方法为，将介孔硅材料、四氯化碳、乙二胺混合，介孔硅材料优选为介孔硅模板SBA-15，介孔硅材料、四氯化碳、乙二胺的重量比优选为0.5～1.5:3:1.35，在90～100℃下加热搅拌，时间优选为6～10h，冷凝回流，时间优选为6～8h，优选于
40～60℃条件下干燥，置于氮气，或者氮气与氢气的混合气体中，加热至600～900℃处理，优选处理时间为5～7h，优选的加热方式是控制升温速率为3～5℃/min。处理完毕后，加入氢氟酸，所述氢氟酸的质量分数优选为5～7%，过滤，洗涤，干燥，干燥温度优选为40～60℃，得氮杂化介孔碳。

[0011] 介孔硅模板SBA-15可以通过如下制备方法得到，将嵌段共聚物P123置于盐酸中溶解，然后逐滴加入正硅酸乙酯，嵌段共聚物P123与正硅酸乙酯的质量比为8∶17～23，温度控制在30～35℃，搅拌，得混合物，然后将所述混合物在140～150℃加热，反应完全后，一般为23～25h，抽滤，洗涤至中性，风干，再在530～550℃焙烧，得到介孔硅模板SBA-15。

[0012] 本发明还提供一种基于氮杂化介孔碳的生物传感器的制备方法，所述工作电极的制备方法为，在玻碳电极上通过电化学法沉积L-半胱氨酸，然后加入氮杂化介孔碳悬浮液，最后电化学法沉积金纳米粒子，得到修饰电极；将巯基修饰的捕获探针加入到所述修饰电极上，然后加入巯基乙醇，清洗，得到所述工作电极。

[0013] 所述氮杂化介孔碳悬浮液的分散剂为N,N-二甲基甲酰胺或超纯水。

[0014] 本发明还提供一种所述基于氮杂化介孔碳的生物传感器测量锰过氧化物酶特定编码基因片段浓度的应用，其步骤是，将含有目标链的待测液和含有信号探针的液体滴加在所述基于氮杂化介孔碳的生物传感器的工作电极表面，反应完成后，滴加含有纳米金团簇标记辣根过氧化物酶-链酶亲和素（GNCs-HRP-SA）的缓冲液，最后在接有三电极系统的电解池中，以对苯二酚和过氧化氢为底物，进行测量，根据线性回归方程得到待测液中目标链的浓度，所述线性回归方程为：

[0015] Y=(7.527±0.1787)X+(-66.5603±2.641)

[0016] 其中，Y为电流平均值；X为目标链浓度的自然对数，单位是mol·L-1；目标链浓度的线性范围为1×10-19～1×10-10M，测量下限为2×10-20M。

[0017] 所述信号探针为：5'-T2-biotin-3'，T2的碱基序列（即SEQ ID NO.2）为5'-GATGCCGTTGTTGGCGGAGAA-3。

[0018] 所述待测液中目标链的碱基序列（即SEQ ID NO.3），即锰过氧化物酶特定编码基因片段为：

[0019] 5'-TTCTCCGCCAACAACGGCATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGAAACACGACACCATCAG-3'。

[0020] 所述纳米金团簇标记辣根过氧化物酶-链酶亲和素（GNCs-HRP-SA）的制备方法为，将氯金酸溶液和辣根过氧化物酶-链酶亲和素溶液混合，搅拌条件下滴加抗坏血酸溶液，溶液变浑浊后加入强碱溶液，所述强碱溶液优选为氢氧化钠溶液，搅拌，静置，透析，得到GNCs-HRP-SA。所述氯金酸、辣根过氧化物酶-链酶亲和素、抗坏血酸的质量配比优选为50～100:4～9:1～1.5，最优选为50:4.2:1.05。

[0021] 所述含有纳米金团簇标记辣根过氧化物酶-链酶亲和素的缓冲液为磷酸盐缓冲溶液，pH优选为6.5～7.5，最优选为7.38。

[0022] 近年，随着新型纳米材料与电化学传感技术迅猛结合，在传感器构建策略中，结合新型材料学相关特点，使用一些纳米材料和生物分子材料形成复合膜结构修饰在玻碳电极表面。纳米材料，例如金纳米粒子等因为具有高电子传导性，能提供大比表面积，保持生物活性等优点，被认为是优秀的生物分子载体和信号传递媒介，可以改善电化学传感器的灵敏度。

[0023] 与现有技术相比，本发明的优点在于：氮杂化介孔碳对生物分子有很好的亲和能力，生物相容性，并且在氮杂化介孔碳中存在π-π*电子转换，从而提高电子的传到能力。L-半胱氨酸无毒、生物适应性强、具有成膜能力。

[0024] 纳米金团簇标记辣根过氧化物酶-链酶亲和素作为信号放大物质，因为纳米金团簇核本身有催化和传导电子的能力，在其周围包裹的辣根过氧化物-链酶亲和素同样具有催化作用，因此，纳米金团簇标记辣根过氧化物酶-链酶亲和素具有双重信号扩大作用，进而提高传感器的灵敏度。

[0025] 本发明充分考虑了氮杂化介孔碳、纳米金、L-半胱氨酸、纳米金团簇标记辣根过氧化物酶-链酶亲和素各自的性质，并利用它们形成的复合膜，构建高灵敏、快速响应、高检测精度及较强抗干扰性的基于氮杂化介孔碳的生物传感器，所述基于氮杂化介孔碳的生物传感器用于检测MnP基因片段，操作简便，高效，检测成本低，为微生物降解木质素的监测和控制过程提供一种有效的分子生物学工具。

附图说明

[0026] 图1为本发明的氮杂化介孔碳的扫描电镜图。

[0027] 图2为本发明的氮杂化介孔碳的透射电镜图。

[0028] 图3为本发明的工作电极的装配与DNA的杂交反应流程图。

[0029] 图4为辣根过氧化物酶催化反应原理图。

[0030] 图5为用差分脉冲伏安法检测不同浓度的Mnp特定编码基因片段得到的电流变化曲线图。

[0031] 图6为Mnp特定编码基因片段含量与电流变化的线性回归图。

具体实施方式

[0032] 实施例1

[0033] 基于氮杂化介孔碳的生物传感器的制备

[0034] 本发明的基于氮杂化介孔碳的生物传感器，为三电极电化学传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂电极，所述工作电极包括玻碳电极，所述玻碳电极的检测端表面依次连接有L-半胱氨酸、氮杂化介孔碳、金纳米粒子膜和巯基修饰的捕获探针，所述金纳米粒子膜上还连接有封闭金纳米粒子膜剩余结合位点的巯基乙醇。

[0035] 所述工作电极的制备方法是，

[0036] 一、玻碳电极的表面处理：将玻碳电极表面抛光，然后用水冲洗玻碳电极表面，再依次用硝酸、丙酮、水进行超声清洗，最后再用缓冲液冲洗，自然晾干。

[0037] 二、L-半胱氨酸膜的制备：用电化学的方法，加入L-半胱氨酸溶液，在玻碳电极表面沉积L-半胱氨酸膜，L-半胱氨酸溶液的浓度为1.0×10-3mol/L，得到L-半胱氨酸修饰电极。

[0038] 三、修饰电极的制备：将准备好的氮杂化介孔碳悬浮液（以N,N-二甲基甲酰胺作为分散剂）滴加到L-半胱氨酸修饰电极的检测端表面上，自然干，然后用电化学的方法沉积金纳米粒子，得到修饰电极，自然晾干。

[0039] 四、将巯基修饰的捕获探针加入到所述修饰电极上，然后加入巯基乙醇，清洗，得到所述工作电极，所述巯基修饰的捕获探针为：5'-HS-(CH2)6-T1-3'，T1的碱基序列（即SEQ ID NO.1）为5'-CTGATGGTGTCGTGTTTCT-3'。

[0040] 工作电极的装配流程如图3部分所示，可以形象的看到各个组成元素的装配关系。

[0041] 氮杂化介孔碳悬浮液中氮杂化介孔碳是采用以下制备方法得到：

[0042] （1）合成介孔硅模板SBA-15：将嵌段共聚物P123置于盐酸中溶解，然后逐滴加入正硅酸乙酯，嵌段共聚物P123与正硅酸乙酯的质量比为8∶17，搅拌后水浴加热，温度控制在35℃，然后将所得混合物转移至反应釜中，在140℃加热25h，抽滤，洗涤至中性，风干，再放入电阻炉中在550℃空气中焙烧5h，得到介孔硅模板SBA-15。

[0043] （2）合成氮杂化介孔碳：将所得介孔硅模板SBA-15、四氯化碳、乙二胺按照质量比为0.5∶3∶1.35加入烧瓶中，然后在90～100℃下水浴加热搅拌6h，冷凝回流6h，将所得产物于60℃下进行干燥，再置于氮气中于600℃下热处理7h，控制升温速率为5℃/min；用质量分数为7%的氢氟酸脱除介孔硅模板SBA-15，过滤，洗涤，40℃下干燥，得到氮杂化介孔碳。

[0044] 本发明的氮杂化介孔碳的扫描电镜图和透射电镜图分别如图1、图2所示，从图中，我们可以看出，氮杂化介孔碳为条形状（SEM），且介孔有序（TEM）。

[0045] 实施例2

[0046] 基于氮杂化介孔碳的生物传感器的制备

[0047] 本发明的基于氮杂化介孔碳的生物传感器，为三电极电化学传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂电极，所述工作电极包括玻碳电极，所述玻碳电极的检测端表面依次连接有L-半胱氨酸、氮杂化介孔碳、金纳米粒子膜和巯基修饰的捕获探针，所述金纳米粒子膜上还连接有封闭金纳米粒子膜的剩余结合位点的巯基乙醇。

[0048] 所述工作电极的制备方法同实施例1，区别在于：第二步中，L-半胱氨酸溶液的浓度为1.0×10-2mol/L；第三步中，氮杂化介孔碳悬浮液以超纯水作为分散剂。

[0049] 氮杂化介孔碳是采用包括以下步骤的制备方法制得：

[0050] （1）合成介孔硅模板SBA-15：将嵌段共聚物P123置于盐酸中溶解，然后逐滴加入正硅酸乙酯，嵌段共聚物P123与正硅酸乙酯的质量比为8∶23，搅拌后水浴加热，温度控制在30℃，然后将所得混合物转移至反应釜中，在150℃水热23h，抽滤，洗涤至中性，风干，再放入电阻炉中在530℃空气中焙烧4h，得到介孔硅模板SBA-15；

[0051] （2）合成氮杂化介孔碳：将所得介孔硅模板SBA-15、四氯化碳、乙二胺按照1.5∶3∶1.35的质量比加入烧瓶中，然后在90℃～100℃下水浴加热搅拌10h，冷凝回流8h，将所得产物于40℃下进行干燥，再置于氮气和氢气中于600℃下热处理5h，控制升温速率为3℃/min；
用质量分数为5%的氢氟酸脱除硅模板，过滤，洗涤，60℃下干燥，得到氮杂化介孔碳。

[0052] 实施例3

[0053] 所述基于氮杂化介孔碳的生物传感器对锰过氧化物酶特定编码基因片段进行测量的方法，首先将含有信号探针和不同浓度的目标链的样品滴在基于氮杂化介孔碳的生物传感器的工作电极表面进行碱基互补配对，37℃下反应不少于60分钟；接着将含有纳米金团簇标记辣根过氧化物酶-链酶亲和素的磷酸盐缓冲溶液（pH为7.38）滴在基于氮杂化介孔碳的生物传感器的工作电极表面，37℃下反应不少于30分钟；最后以对苯二酚和过氧化氢为底物，在接有三电极系统的电解池中进行测量。利用测量到的电流变化值和线性回归方程计算锰过氧化物酶特定编码基因片段的含量；所述线性回归方程为：

[0054] Y=(7.527±0.1787)X+(-66.5603±2.641)

[0055] 其中，Y为电流平均值；X为目标链浓度的自然对数，单位是mol·L-1；目标链，即锰-19 -10过氧化物酶特定编码基因片段，目标链浓度的线性范围为1×10 ～1×10 M，测量下限为
2×10-20M。

[0056] 所述信号探针为：5'-T2-biotin-3'，T2的碱基序列（即SEQ ID NO.2）为5'-GATGCCGTTGTTGGCGGAGAA-3。

[0057] 所述待测液中目标链（T3）的碱基序列，即SEQ ID NO.3为：

[0058] 5'-TTCTCCGCCAACAACGGCATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGAAACACGACACCATCAG-3'。

[0059] 所述纳米金团簇标记辣根过氧化物酶-链酶亲和素采用以下步骤的制备方法得到：

[0060] （1）0.5mL的氯金酸(100mg/mL)和1mL辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素(4.2mg/mL)在室温下边搅拌边混合，然后在搅拌的同时逐步滴加250μL抗坏血酸(4.2mg/mL)，搅拌45min之后溶液变浑浊。

[0061] （2）将0.1mL氢氧化钠(1M)滴加到步骤（1）得到的溶液中，然后在室温下搅拌3小时，为了使辣根过氧化物酶-链酶亲和素将纳米金簇包裹，溶液在室温下静置2小时。

[0062] （3）将步骤（2）得到的溶液在4℃下用250mL的超纯水透析4小时，然后用磷酸盐缓冲溶液(pH值为6.98)透析2小时，得到纳米金团簇标记辣根过氧化物酶-链酶亲和素。

[0063] 本发明的捕获探针、目标探针和信号探针的DNA杂交反应流程图如图3所示，从图中可以看出DNA杂交反应流程关系。

[0064] 辣根过氧化物酶催化反应原理如图4所示，辣根过氧化物酶（HRP）在对苯二酚和过氧化氢存在的条件下，形成中间产物HRP(I)和HRP(II)，还有对苯二醌（Q），然后对苯二醌在电极表面被还原成对苯二酚，产生还原电流。

[0065] 实施例4

[0066] 所述基于氮杂化介孔碳的生物传感器对锰过氧化物酶特定编码基因片段进行测量的方法，除了纳米金团簇标记辣根过氧化物酶-链酶亲和素的制备方法同实施例3不同外，其他步骤同实施例3相同。

[0067] 所述纳米金团簇标记辣根过氧化物酶-链酶亲和素是采用以下步骤的制备方法制得：

[0068] （1）1mL的氯金酸(100mg/mL)和2mL辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素(4.2mg/mL)在室温下边搅拌边混合，然后在再搅拌的同时逐步滴加300μL抗坏血酸(4.2mg/mL)，搅拌30min之后溶液变浑浊。

[0069] （2）将0.4mL氢氧化钠(1M)滴加到步骤（1）得到的溶液中，然后在室温下搅拌5小时，为了使辣根过氧化物酶-链酶亲和素将纳米金簇包裹，溶液在室温下再静置3小时。

[0070] （3）将步骤（2）得到的溶液在4℃下用250mL的超纯水透析2小时，然后再用磷酸盐缓冲溶液(pH为7.38)透析4个小时。

[0071] 实施例5

[0072] 利用本发明的基于氮杂化介孔碳的生物传感器和测量应用方法对3组含锰过氧化物酶（MnP）特定编码基因片段待测样品进行测定，其测量步骤及测量结果如下：

[0073] 1、基于氮杂化介孔碳的生物传感器的制备

[0074] 同实施例1

[0075] 2、所述基于氮杂化介孔碳的生物传感器对锰过氧化物酶特定编码基因片段的碱基互补配对方法

[0076] 三组含有不同浓度目标链的待测样品分别滴在基于氮杂化介孔碳的生物传感器的工作电极表面杂交反应60分钟后，将含有信号探针的液体滴在基于氮杂化介孔碳的生物传感器的工作电极表面杂交反应60分钟，待反应完成后，将含有GNCs-HRP-SA的磷酸盐缓冲溶液（pH值为7.38）滴在电极表面，37℃下反应45分钟。

[0077] 3、锰过氧化物酶（MnP）特定编码基因片段的标定

[0078] 在pH值为7.38的磷酸盐缓冲溶液中，对Mnp特定编码基因片段的标准曲线进行标定。标定过程是指将基于氮杂化介孔碳的生物传感器的工作电极依次与含有不同浓度Mnp特定编码基因片段的待测样品溶液反应，使其进行碱基互补配对（反应过程和上述步骤2相同）。反应完成后加入一定浓度的对苯二酚和H2O2，根据响应电流变化分别绘出每一组实验样品差分脉冲伏安曲线，如图5所示。并根据所有的差分脉冲伏安曲线（DPV曲线）和不同实验样品的Mnp特定编码基因片段浓度，得到电流变化和Mnp特定编码基因片段浓度的自然对数关系曲线，如图6所示，即线性回归方程，为：

[0079] Y=(7.527±0.1787)X+(-66.5603±2.641)

[0080] 其中，Y为电流平均值；X为目标链浓度的自然对数，单位是mol·L-1；目标链浓度的线性范围为1×10-19～1×10-10M，测量下限为2×10-20M。

[0081] 4、待测样品中Mnp特定编码基因片段的测定

[0082] 三组待测样品依次滴加到基于氮杂化介孔碳的生物传感器的工作电极表面进行碱基互补配对反应，然后在含有1mmol·L-1对苯二酚的磷酸盐缓冲液（pH7.38）中加入0.5mmol·L-1H2O2。以对苯二酚和H2O2为底物，以基于氮杂化介孔碳的生物传感器的工作电极为基底电极，采用差分脉冲伏安法，根据响应电流变化和步骤3中建立的线性回归方程，测定待测样品中Mnp特定编码基因片段含量。所述的电化学法测定是采用上海辰华仪器公司生产的CHI660B电化学系统与50mL电解池中的三电极系统相连接，进行控制与监测。

[0083] 上述3组含Mnp特定编码基因片段的待测样品在用基于氮杂化介孔碳的生物传感器测定后，其测量结果见下表：

[0084]-1 a -1
待测样品mol·L 测定浓度mol·L 回收率%
3×10-11 2.89×10-11 96.33
7×10-16 7.26×10-16 103.71
9×10-18 8.37×10-18 93

[0085] 注：a表示测量的平均浓度。

[0086] 上述测定结果表明，本发明灵敏度高，选择性好，能够高效、低成本在线测量Mnp特定编码基因片段含量，为微生物降解木质素的监测和控制过程提供了技术支持。

[0087] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。