一种食用油中甘油三酯的单柱二维液相色谱-质谱分析方法及其应用

摘要

本发明涉及一种食用油中甘油三酯的单柱二维液相色谱-质谱分析方法。一种食用油中甘油三酯的单柱二维液相色谱-质谱分析方法，其特征在于：它包括如下步骤：1）食用油中甘油三酯的定性方法:（1）在线单柱二维液相色谱-质谱分离；（2）离线单柱二维液相色谱-质谱分离；2）食用油中甘油三酯的定量方法；3）单柱二维液相色谱-质谱分析方法在食用油保真中的应用:（1）采用步骤1）和2）的方法，相同条件下，大量测试同一品种不同品牌的食用油以及掺杂样品，得到甘油三酯的液相色谱-质谱数据；（2）结合主成分分析鉴别区分食用油的种类或鉴别掺杂食用油。该方法操作简单，能够实现甘油三酯的高效、高通量的检测。

权利要求

1.一种食用油中甘油三酯的单柱二维液相色谱-质谱分析方法，其特征在于：使用的色谱柱为4.6mm×250mm的安捷伦Zorbax Eclipse Plus phenyl-hexyl；它包括如下步骤：

1)食用油中甘油三酯的定性方法

(1)在线单柱二维液相色谱-质谱分离：

a、食用油用异丙醇溶解，配成1mg/mL的溶液备用，进样前用相应的流动相稀释成

0.01mg/mL，进样体积为10μL；结果发现，流动相为甲醇时，不同双键数甘油三酯得到很好地分离，流动相为乙腈时，不同ECN的甘油三酯得到很好地分离，因此，在甲醇流动相条件下，色谱柱的固定相与甘油三酯之间主要表现为双键与双键之间的络合作用，可以实现不同双键数甘油三酯的分离；在乙腈流动相条件下，固定相与甘油三酯之间主要表现为疏水相互作用，可以实现不同当量碳数甘油三酯的分离；

b、根据步骤a优化条件建立在线单柱二维分离的方法，采用梯度洗脱，流动相为A：乙腈，B：含0.4％(v/v)氨水的甲醇；梯度洗脱:0-7.5min、50％A(v/v)，

50 ％ B(v/v)；7.5-8.0min,50-28 ％ A，50-72 ％ B(v/v)；8.0-12.9min,28 ％ A(v/v)；

12.9-13.0min,28-50％A(v/v)；13.0-26.0min,50％A(v/v)；流速0.8mL/min；在该条件下同时实现12种ECN相同和不同的甘油三酯标准品的分离；

(2)离线单柱二维液相色谱-质谱分离：

a、食用油用异丙醇溶解，配成1mg/mL的溶液备用，进样前用相应的流动相稀释成

0.01mg/mL，进样体积为10μL；结果发现，流动相为甲醇时，不同双键数甘油三酯得到很好地分离，流动相为乙腈时，不同ECN的甘油三酯得到很好地分离，因此，在甲醇流动相条件下，固定相与甘油三酯之间主要表现为双键与双键之间的络合作用，可以实现不同双键数甘油三酯的分离；在乙腈流动相条件下，固定相与甘油三酯之间主要表现为疏水相互作用，可以实现不同当量碳数甘油三酯的分离；

b、优化条件建立离线单柱二维分离的方法，分为两步，第一步先在流动相乙腈条件下分离,采用等度洗脱，一维流动相为：乙腈100％v，根据保留时间将峰分为不同的组，将各个组的峰分别收集，氮气吹干后用甲醇重新定容；第二步：在含0.2％(v/v)氨水的甲醇：异丙醇＝93:7(v/v)下进行第二次分离，流速1mL/min，该条件下可以实现甘油三酯标准品先按ECN分离，相同ECN的标准品再按双键数进行分离；

2)食用油中甘油三酯的定量方法：

(1)将饱和单脂肪酸甘油三酯和不饱和单脂肪酸甘油三酯标准品分别用异丙醇配成

1mg/mL的贮存溶液，然后用相同的溶剂将饱和单脂肪酸甘油三酯稀释到10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL，5000ng/mL，不饱和单脂肪酸甘油三酯稀释到10ng/mL，

100ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL，5000ng/mL，10000ng/mL,在第二维流动相条件下，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线；

所述在第二维流动相条件下为，含0.2％(v/v)氨水的甲醇：异丙醇＝93:7(v/v)；

(2)以甘油三酯OOO为基准，将其响应因子设为1，其它单脂肪酸甘油三酯的RF利用其标准曲线的斜率比aooo/aTAG计算得到；

(3)混合脂肪酸甘油三酯的RF采用算数平均法计算得到，RFPPO＝(2*RFPPP+RFOOO)/3；其中，RFPPO表示甘油三酯PPO的响应因子，RFPPP表示甘油三酯PPP的响应因子，RFOOO表示甘油三酯OOO的响应因子；

(4)对已定性的食用油中甘油三酯，采用多反应监测-增强产物离子扫描，选定甘油三酯的特征离子对，算出其峰面积，利用RF对峰面积进行校正后，得到甘油三酯的含量；

(5)对定量模型进行验证，包括混合脂肪酸甘油三脂RF的实测值和计算值的比较验证计算模型的准确性，及HPLC-MS测得的甘油三酯的定量结果折算成脂肪酸后的结果和GC-FID测得的脂肪酸的结果的比较，验证甘油三酯定量的准确性。

2.一种如权利要求1所述的食用油中甘油三酯的单柱二维液相色谱－质谱分析方法的应用，其特征在于它包括如下步骤:(1)采用单柱二维液相色谱-质谱分析方法中步骤1)和2)的方法，相同条件下，大量测试同一品种不同品牌的食用油以及掺杂样品，得到甘油三酯的液相色谱-质谱数据；

(2)结合主成分分析(principal component analysis，PCA)鉴别区分食用油的种类或鉴别掺杂食用油；

其中：

a)所得的数据为食用油中TAG的谱图和谱峰数据及食用油特征TAG的PCA图；

b)所述的食用油包括大豆油、花生油、猪油、玉米油或芝麻油；

c)所得到的结果用于食用油种类的区分和掺杂食用油的鉴定。

说明书

一种食用油中甘油三酯的单柱二维液相色谱-质谱分析方

法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种食用油中甘油三酯的单柱二维液相色谱-质谱分析方法及其在油脂鉴定和掺杂检测中（在油脂保真中）及其应用。

背景技术

[0002] 随着人们对食用油安全和营养的问题越来越重视，吃好油、吃健康油，已成为我国消费者关注自身健康、保证正常营养摄取的新需求。但是不法商贩以假乱真、以次充好的现象仍有发生。而有效监控食用油的质量，是保障食用油安全的重要环节和手段。

[0003] 甘油三酯（triacylglycerols,TAGs）是由一个甘油分子与三个脂肪酸分子缩合而成的，占食用油成分的95%以上，对食用油的物化及营养学性质有着重要影响，因此食用油中的甘油三酯可作为绝佳的指纹图谱来控制油脂的质量、真实性和营养价值。由于甘油骨架上可以分布的脂肪酸总类很多，导致甘油三酯种类十分庞大。且一般天然油脂中的甘油三酯不仅在物理化学性质上非常接近，且还存在有大量异构体。使得甘油三酯的分析相当困难，而良好的色谱分离方法是实现甘油三酯分析的前提。

[0004] 高效液相色谱法（HPLC）在甘油酯分析中应用广泛。非水反相液相色谱和正相银离子液相色谱是分离油脂中甘油三酯的两种主要方法。两种方法互补，将非水反相液相色谱和正相银离子色谱两种不同保留机理的分离模式联用，构建二维液相分离系统很好的结合了两者的优势，近年来已在油脂分析中展现了极大的应用潜力。离线模式的优点是其操作简单，而且每一维的分离条件可独立优化，但缺点是两维之间需要更换色谱柱，且由于第一维和第二维中所采用的流动相不互溶，更换色谱柱后，需要用异丙醇反复冲洗管道，然后再用正相或反向流动相平衡色谱柱，造成操作繁琐、浪费溶剂和污染环境的问题；而在线模式虽具有自动化程度高、重现性较好等优点，但其装置较为复杂，另外由于两维的溶剂并不互溶，也存在溶剂不兼容的问题。

[0005] 质谱（MS）用于甘油三酯复杂化合物的定量分析时，理论上通过MS定量任一化合物必须准确的比较它本身的峰强度和稳定同位素内标化合物的峰强度或者用标准品做标准曲线来实现定量分析，然而食用油中甘油三酯的成分非常复杂，利用数十个甚至数百个同位素内标化合物来分析甘油三酯混合物是行不通的，而又由于商品化的TAG标准品价格昂贵且种类非常有限，因此利用植物油中所有甘油三酯的标准曲线来实现定量分析也是不可能的。甘油三酯的双键数目和酰基链长等会影响甘油三酯在MS中的灵敏度，因此，在定量时只考虑色谱峰面积而忽略质谱响应差异则可能导致定量分析时出现较大的误差。因此探寻一种仅利用食用油中有限的甘油三酯标准品（主要是单脂肪酸类型的甘油三酯）即可完成对食用油中甘油三酯的定量分析的方法显得尤为重要。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种食用油中甘油三酯的单柱二维液相色谱-质谱分析方法及其应用，该方法操作简单，能够实现甘油三酯的高效、高通量的检测。

[0007] 为实现上述目的，本发明的技术方案是，一种食用油中甘油三酯的单柱二维液相色谱-质谱分析方法，其特征在于：它包括如下步骤：

[0008] 1）食用油中甘油三酯的定性方法

[0009] （1）在线单柱二维液相色谱-质谱分离（考察色谱柱在不同流动相条件下对甘油三酯标准品的保留机理）：

[0010] a、食用油用异丙醇溶解，配成1mg/mL的溶液备用，进样前用相应的流动相稀释成0.01mg/mL，进样体积为10μL；结果发现，流动相为甲醇时，不同双键数甘油三酯（PPO,OOP,SOL）得到很好地分离，流动相为乙腈时，不同ECN（当量碳数）的甘油三酯（LLL,LLP,POL,SOL,OOS,OOA）得到很好地分离，因此，在甲醇流动相条件下，色谱柱的固定相(phenyl-hexyl)与甘油三酯之间主要表现为双键与双键之间的络合作用，可以实现不同双键数甘油三酯的分离；在乙腈流动相条件下，固定相与甘油三酯之间主要表现为疏水相互作用，可以实现不同当量碳数（equivalent carbon number，ECN）甘油三酯的分离；

[0011] b、根据步骤a优化条件建立在线单柱二维分离的方法，采用梯度洗脱，流动相为A：乙腈，B：甲醇（内含0.4%氨水，v/v）；梯度洗脱:0-7.5min、50%A（v/v），50%B（v/v）；7.5-8.0min,50-28%A，50-72%B（v/v）；8.0-12.9min,28%A（v/v）；12.9-13.0min,28-50%A（v/v）；13.0-26.0min,50%A（v/v）；流速0.8mL/min；在该条件下同时实现12种ECN（当量碳数）相同和不同的甘油三酯标准品的分离；

[0012] （2）离线单柱二维液相色谱-质谱分离（考察色谱柱在不同流动相条件下对甘油三酯标准品的保留机理，优化色谱流动相）：

[0013] a、食用油用异丙醇溶解，配成1mg/mL的溶液备用，进样前用相应的流动相稀释成0.01mg/mL，进样体积为10μL；结果发现，流动相为甲醇时，不同双键数甘油三酯（PPO,OOP,SOL）得到很好地分离，流动相为乙腈时，不同ECN（当量碳数）的甘油三酯（LLL,LLP,POL,SOL,OOS,OOA）得到很好地分离，因此，在甲醇流动相条件下，固定相与甘油三酯之间主要表现为双键与双键之间的络合作用，可以实现不同双键数甘油三酯的分离；在乙腈流动相条件下，固定相与甘油三酯之间主要表现为疏水相互作用，可以实现不同当量碳数（equivalent carbon number，ECN）甘油三酯的分离；

[0014] b、优化条件建立离线单柱二维分离的方法，分为两步，第一步先在流动相乙腈条件下分离（采用等度洗脱，一维流动相为：乙腈100%v），根据保留时间将峰分为不同的组，将各个组的峰分别收集，氮气吹干后用甲醇重新定容；第二步：在流动相甲醇（内含0.2%氨水，v/v）：异丙醇=93:7(v/v)下进行第二次分离，流速1mL/min，该条件下可以实现甘油三酯标准品先按ECN分离（第一维），相同ECN的标准品再按双键数进行分离（第二维）；

[0015] 2）食用油中甘油三酯的定量方法（为校准曲线结合响应因子）：

[0016] （1）将饱和单脂肪酸甘油三酯（LaLaLa,MMM,PPP,MaMaMa,SSS）和不饱和单脂肪酸甘油三酯标准品(PoPoPo,MoMoMo,OOO,LLL,LnLnLn,GGG,ErErEr)分别用异丙醇配成1mg/mL的贮存溶液，然后用相同的溶剂将饱和单脂肪酸甘油三酯（甘油三酯，即TAGs）稀释到10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL，5000ng/mL，不饱和单脂肪酸甘油三酯稀释 到10ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL，5000ng/mL，10000ng/mL,在第二维流动相条件下【甲醇（内含0.2%氨水，v/v）：异丙醇=93:7(v/v)】，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线；

[0017] （2）以甘油三酯OOO为基准，将其响应因子（response factor，RF）设为1，其它单脂肪酸甘油三酯的RF利用其标准曲线的斜率比aooo/aTAG计算的到；

[0018] （3）混合脂肪酸甘油三酯的RF采用算数平均法计算得到，如RFPPO=(2*RFPPP+RFOOO)/3；其中，RFPPO表示甘油三酯PPO的响应因子，RFPPP表示甘油三酯PPP的响应因子，RFOOO表示甘油三酯OOO的响应因子；

[0019] （4）对已定性的食用油中甘油三酯，采用多反应监测-增强产物离子扫描（Multiple Reaction Monitor-Enhanced Product Ion，MRM-EPI），选定甘油三酯的特征离子对，算出其峰面积，利用RF对峰面积进行校正后，得到甘油三酯的含量（得到甘油三酯的相对百分含量和绝对百分含量）；

[0020] （5）对定量模型进行验证，包括混合脂肪酸甘油三脂RF的实测值和计算值的比较验证计算模型的准确性，及HPLC-MS测得的甘油三酯的定量结果折算成脂肪酸后的结果和GC-FID测得的脂肪酸的结果的比较，验证甘油三酯定量的准确性。

[0021] 上述一种食用油中甘油三酯的单柱二维液相色谱-质谱分析方法的应用（在食用油保真和掺杂中的应用），其特征在于它包括如下步骤:

[0022] （1）采用单柱二维液相色谱-质谱分析方法中步骤1）和2）的方法，相同条件下，大量测试同一品种不同品牌的食用油以及掺杂样品，得到甘油三酯的液相色谱-质谱数据（对食用油样本进行液相色谱-质谱数据采集，全二维液相色谱-质谱分析得到食用油中甘油三酯的定性定量数据）；

[0023] （2）结合主成分分析（principal component analysis，PCA）鉴别区分食用油的种类或鉴别掺杂食用油；

[0024] 其中：

[0025] a）所得的数据为食用油中TAG的谱图和谱峰数据及食用油特征TAG的PCA图；

[0026] b）所述的正品食用油包括大豆油、花生油、猪油、玉米油或芝麻油；

[0027] c）所得到的结果用于食用油种类的区分和掺杂食用油的鉴定。

[0028] 对食用油样本进行液相色谱-质谱数据采集，全二维液相色谱-质谱分析得到食用油中甘油三酯的定性数据。其中，全二维液相色谱分析条件为美国Agilent公司Agilent1200液相色谱仪，配有美国Applied Biosystems公司4000Q-Trap质谱检测器。质谱APCI（atmospheric pressure chemical ionization）模式：正离子；温度（Temperature,TEM)：450℃；扫描模式：EMS-EPI,MRM-EPI；扫描速度：1000u/s；离子源气体1（Ion Source Gas1,GS1）：344.75kPa；去簇电压（declustering potential,DP）：90V；碰撞能量(collision energy,CE)：35V和55V；碰撞电压摆幅(Collision Energy Spread,CES)：5V；碰撞室输出电压(Collision Cell Exit Protential，CXP)：17V；质量范围：450-1100m/z。食用油样品用正己烷稀释到5mg/mL，使用前用初始流动相稀释到需要浓度。

[0029] 解决甘油三酯常规二维液相色谱（疏水反相液相色谱柱和银离子液相色谱柱）离线分离时需更换色谱柱，且需要用异丙醇反复冲洗管道，然后再用正相或反向流动相平衡色谱柱，造成操作繁琐、浪费溶剂和污染环境的问题；而在线联用又增加设备的复杂性以及存在溶剂不兼容的问题，采用同时具有疏水相互作用和π-π络合作用的苯基己基色谱柱发展了食用油中甘油三酯的单柱二维液相色谱分析新方法。针对食用油中甘油三酯定量困难的问题，提出了一种利用单脂肪酸类型甘油三酯（R1R1R1）计算响应因子从而对混合甘油三酯峰面积进行校正，实现食用油中TAG准确定量的方法。并利用所建立的方法对正品及掺杂食用油进行了区分，用于食用油的保真研究。

[0030] 本发明的有益效果是：采用同时具有疏水相互作用和π-π络合作用的苯基己基色谱柱实现了甘油三酯的快速分离，并结合质谱检测采用校准曲线结合响应因子的定量方法对食用油中的甘油三酯进行定量分析。对不同种类食用油的甘油三酯成分进行主成分分析，区分不同种类的食用油以及掺杂样本。本发明的方法操作简单，能够实现甘油三酯的高效、高通量的检测，解决常规甘油三酯的二维液相色谱分离中需要更换色谱柱以及流动相不兼容的问题。实现了对食用油中甘油三酯的准确定量分析，用于掺杂或掺伪食用油的鉴定。对监控食用油的品质，保证食用油的安全具有重要意义。

附图说明

[0031] 图1是分离油脂样品中ECN相同的3种甘油三酯标准品（PPO,OOP,SOL）的液相色谱图。

[0032] 图2是分离油脂样品中ECN不同的6种甘油三酯标准品（LLL，LLP，POL，SOL，OOS，OOA）的液相色谱图。

[0033] 图3是同时分离油脂样品中ECN值不同的甘油三酯和ECN值相同而双键数不同的12种甘油三酯标准品（γ-LnLnLn，LLL，LLP，PPL，POL，PPO，OOP，SOL，OOS，SPO，SSO，OOA）的液相色谱图。

[0034] 图4是大豆油(a)、花生油(b)、猪油(c)样品的色谱三维分离图。

[0035] 图5是RF随甘油三酯上脂肪酸的碳数和双键数的变化。

[0036] 图6是不同的大豆油、花生油、玉米油、芝麻油的主成分分析图。

[0037] 图7是大豆油中分别掺杂5%，10%，15%(v)的猪油时的主成分分析图。

[0038] 图8是花生油中分别掺杂5%，10%，15%(v)的大豆油时的主成分分析图。

[0039] 附图4中a：大豆油中甘油三酯（triacylglycerols,TAGs）二维液相色谱分离三维色谱图。其中，y轴为第一维分离结果，甘油三酯按当量碳数（equivalent carbon number，ECN）由小到大依次洗脱，相同ECN的TAG共洗脱；x轴为第二维分离结果，甘油三酯按双键数由小到大依次洗脱，相同双键数的TAG共洗脱。

[0040] 脂肪酸缩写说明：TAGs的缩写是由三个分别对应甘油骨架上的脂肪酸的缩写字母组成的。本发明中用到的缩写如下——P：C16:0，棕榈酸；Ln：C18:3，亚麻酸；L：C18:2，亚油酸；O：C18:1，油酸；S：C18:0，硬脂酸；A：C20:0；花生酸。

具体实施方式

[0041] 本发明的食用油中甘油三酯的二维液相色谱分析方法，包含在线和离线单柱二维液相色谱-质谱分离两种方法。使用的色谱柱均为安捷伦Zorbax Eclipse Plus phenyl-hexyl(4.6mm×250mm i.d.)色谱柱，

[0042] 一种食用油中甘油三酯的单柱二维液相色谱-质谱分析方法，它包括如下步骤：

[0043] 1）食用油中甘油三酯的定性方法

[0044] （1）在线单柱二维液相色谱-质谱分离（考察色谱柱在不同流动相条件下对甘油三酯标准品的保留机理）：

[0045] a、食用油用异丙醇溶解，配成1mg/mL的溶液备用，进样前用相应的流动相稀释成0.01mg/mL，进样体积为10μL；结果发现，流动相为甲醇时，不同双键数甘油三酯（PPO,OOP,SOL）得到很好地分离，流动相为乙腈时，不同ECN（当量碳数）的甘油三酯（LLL,LLP,POL,SOL,OOS,OOA）得到很好地分离，因此，在甲醇流动相条件下，色谱柱的固定相(phenyl-hexyl)与甘油三酯之间主要表现为双键与双键之间的络合作用，可以实现不同双键数甘油三酯的分离；在乙腈流动相条件下，固定相与甘油三酯之间主要表现为疏水相互作用，可以实现不同当量碳数（equivalent carbon number，ECN）甘油三酯的分离；

[0046] b、根据步骤a优化条件建立在线单柱二维分离的方法，采用梯度洗脱，流动相为A：乙腈，B：甲醇（内含0.4%氨水，v/v）；梯度洗脱:0-7.5min、50%A（v/v），50%B（v/v）；7.5-8.0min,50-28%A，50-72%B（v/v）；8.0-12.9min,28%A（v/v）；12.9-13.0min,28-50%A（v/v）；13.0-26.0min,50%A（v/v）；流速0.8mL/min；在该条件下同时实现12种ECN（当量碳数）相同和不同的甘油三酯标准品的分离；

[0047] （2）离线单柱二维液相色谱-质谱分离（考察色谱柱在不同流动相条件下对甘油三酯标准品的保留机理，优化色谱流动相）：

[0048] a、食用油用异丙醇溶解，配成1mg/mL的溶液备用，进样前用相应的流动相稀释成0.01mg/mL，进样体积为10μL；结果发现，流动相为甲醇时，不同双键数甘油三酯（PPO,OOP,SOL）得到很好地分离，流动相为乙腈时，不同ECN（当量碳数）的甘油三酯（LLL,LLP,POL,SOL,OOS,OOA）得到很好地分离，因此，在甲醇流动相条件下，固定相与甘油三酯之间主要表现为双键与双键之间的络合作用，可以实现不同双键数甘油三酯的分离；在乙腈流动相条件下，固定相与甘油三酯之间主要表现为疏水相互作用，可以实现不同当量碳数（equivalent carbon number，ECN）甘油三酯的分离；

[0049] b、优化条件建立离线单柱二维分离的方法，分为两步，第一步先在流动相乙腈条件下分离（采用等度洗脱，一维流动相为：乙腈100%v），根据保留时间将峰分为不同的组，将各个组的峰分别收集，氮气吹干后用甲醇重新定容；第二步：在流动相甲醇（内含0.2%氨水，v/v）：异丙醇=93:7(v/v)下进行第二次分离，流速1mL/min，该条件下可以实现甘油三酯标准品先按ECN分离（第一维），相同ECN的标准品再按双键数进行分离（第二维）；

[0050] 2）食用油中甘油三酯的定量方法（为校准曲线结合响应因子）：

[0051] （1）将饱和单脂肪酸甘油三酯（LaLaLa,MMM,PPP,MaMaMa,SSS）和不饱和单脂肪酸甘油 三酯标准品(PoPoPo,MoMoMo,OOO,LLL,LnLnLn,GGG,ErErEr)分别用异丙醇配成1mg/mL的贮存溶液，然后用相同的溶剂将饱和单脂肪酸甘油三酯（甘油三酯，即TAGs）稀释到10，50，100，500，1000，5000ng/mL，不饱和单脂肪酸甘油三酯稀释到10，100，500，1000，
5000，10000ng/mL,在第二维流动相条件下【甲醇（内含0.2%氨水，v/v）：异丙醇=93:7(v/v))】，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线；

[0052] （2）以甘油三酯OOO为基准，将其响应因子（response factor，RF）设为1，其它单脂肪酸甘油三酯的RF利用其标准曲线的斜率比aooo/aTAG计算的到；

[0053] （3）混合脂肪酸甘油三酯的RF采用算数平均法计算得到，如RFPPO=(2*RFPPP+RFOOO)/3；其中，RFPPO表示甘油三酯PPO的响应因子，RFPPP表示甘油三酯PPP的响应因子，RFOOO表示甘油三酯OOO的响应因子；

[0054] （4）对已定性的食用油中甘油三酯，采用多反应监测-增强产物离子扫描（Multiple Reaction Monitor-Enhanced Product Ion，MRM-EPI），选定甘油三酯的特征离子对，算出其峰面积，利用RF对峰面积进行校正后，得到甘油三酯的含量（得到甘油三酯的相对百分含量和绝对百分含量）；

[0055] （5）对定量模型进行验证，包括混合脂肪酸甘油三脂RF的实测值和计算值的比较验证计算模型的准确性，及HPLC-MS测得的甘油三酯的定量结果折算成脂肪酸后的结果和GC-FID测得的脂肪酸的结果的比较，验证甘油三酯定量的准确性。

[0056] 上述一种食用油中甘油三酯的单柱二维液相色谱-质谱分析方法的应用（在食用油保真和掺杂中的应用），其特征在于它包括如下步骤:

[0057] （1）采用单柱二维液相色谱-质谱分析方法中步骤1）和2）的方法，相同条件下，大量测试同一品种不同品牌的食用油以及掺杂样品，得到甘油三酯的液相色谱-质谱数据（对食用油样本进行液相色谱-质谱数据采集，全二维液相色谱-质谱分析得到食用油中甘油三酯的定性定量数据）；

[0058] （2）结合主成分分析（principal component analysis，PCA）鉴别区分食用油的种类或鉴别掺杂食用油；

[0059] 其中：

[0060] a）所得的数据为食用油中TAG的谱图和谱峰数据及食用油特征TAG的PCA图；

[0061] b）所述的正品食用油包括大豆油、花生油、猪油、玉米油或芝麻油；

[0062] c）所得到的结果用于食用油种类的区分和掺杂食用油的鉴定。

[0063] 包括以下两种：

[0064] （1）相同条件下，分别选取不同品牌的大豆油、花生油、玉米油、芝麻油，得到甘油三酯的液相色谱-质谱数据，将分析后得到的TAG数据进行主成分分析，区分开不同种类的食用油；

[0065] （2）相同条件下，分别测试6种以上不同品牌大豆油、花生油、猪油样品，3个及分别掺入5%，10%，15%（v）猪油样品的大豆油样品，3个掺入5%，10%，15%（v）大豆油的花生油样品，得到甘油三酯的液相色谱-质谱数据，将分析后得到的TAG数据进行主成分分析， 用于鉴别正品食用油或掺杂食用油。

[0066] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

[0067] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0068] 实施例1：油脂样品中ECN值相同，双键数不同的3种甘油三酯的分离检测[0069] 油脂样品中ECN值相同，双键数不同的3种甘油三酯的分离检测：采用同时具有疏水相互作用和π-π络合作用的安捷伦Zorbax Eclipse Plus
phenyl-hexyl(4.6mm×250mm i.d.)为分离柱，流动相是100%甲醇，流速1mL/min，进样量
10μL，紫外检测波长是205nm,柱温35℃进行液相色谱分离。图1是分离油脂样品中ECN值相同，双键数不同的3种甘油三酯（PPO，OOP，SOL）的液相色谱图,所用样品浓度均为1mg/ml。

[0070] 实施例2：油脂样品中ECN值不同的6种甘油三酯的分离检测

[0071] 油脂样品中ECN值不同的6种甘油三酯的分离检测：用同时具有疏水相互作用和π-π络合作用的安捷伦Zorbax Eclipse Plus phenyl-hexyl(4.6mm×250mm i.d.)为分离柱，流动相是100%乙腈，流速1mL/min，进样量10μL，紫外检测波长是205nm,柱温35℃，进行液相色谱分离。图2是分离油脂样品中ECN值不同的6种甘油三酯（LLL，LLP，POL，SOL，OOS，OOA）的液相色谱图，所用样品浓度均为1mg/ml。

[0072] 实施例3：油脂样品中ECN值不同的甘油三酯和ECN值相同而双键数不同的12种甘油三酯的同时分离检测

[0073] 油脂样品中ECN值不同的甘油三酯和ECN值相同而双键数不同的甘油三酯的同时分离检测：色谱柱为安捷伦Zorbax Eclipse Plus phenyl-hexyl(4.6mm×250mm i.d.)，流动相为A：乙腈，B：甲醇（内含0.4%氨水，v/v），梯度洗脱:0-7.5min,50%A；7.5-8.0min，50-28%A；8.0-12.9min，28%A;12.9-13.0min,28-50%A;13.0-26.0,50%A；流速0.8mL/min，进样量10μL，紫外检测波长是205nm,柱温35℃，进行液相色谱分离。图3是同时分离油脂样品中ECN值不同的甘油三酯和ECN值相同而双键数不同的12种甘油三酯的（γ-LnLnLn，LLL，LLP，LLO，POL，PPO，OOP，SOL，OOS，SPO，SSO，OOA）的液相色谱图,所用样品浓度均为
0.02mg/mL。

[0074] 实施例4：大豆油、猪油、花生油样品的色谱三维分离图

[0075] 大豆油、猪油、花生油样品的色谱三维分离图：其中x轴1D，t(min)表示的是第一维的分离时间；y轴2D,t(min)表示的是第二维的分离时间，z轴表示峰的强度（cps）。一维流动相条件：乙腈100%，二维流动相条件：甲醇（内含0.2%氨水，v/v）：异丙醇=93:7,(v/v)。流速均为1mL/min，进样量10μL，柱温35℃。如图4是大豆油、猪油、花生油样品的色谱三维分离图，所用样品浓度均为0.06mg/mL。

[0076] 实施例5：不同的单脂肪酸甘油三酯的RF随TAG上脂肪酸上的碳数和双键数的变化。

[0077] 油脂样品中不同的单脂肪酸甘油三酯的RF随TAG上脂肪酸上碳数和双键数的变化。色谱柱为安捷伦Zorbax Eclipse Plus phenyl-hexyl(4.6mm×250mm i.d.)，流动相是甲醇（内含0.2% 氨水，v/v）：异丙醇=93:7,(v/v)，流速均为1mL/min，进样量10μL，质谱检测器4000Q-Trap，测定标准曲线并作出拟合曲线。如图5所示是13种单脂肪酸甘油三酯的RF值及变化趋势。

[0078] 实施例6：不同品牌的大豆油、花生油、玉米油、芝麻油的PCA分析图。

[0079] 不同品牌的大豆油、花生油、玉米油、芝麻油的PCA分析图：分别选取6种以上不同品牌的大豆油、花生油、玉米油和芝麻油，通过建立的在线单柱二维液相色谱-质谱的分离方法和内标法的定量方法分析其中的甘油三酯。样品浓度均为0.01mg/mL，内标浓度0.006mg/mL，根据TAG的相对百分含量做PCA分析。图6为6种不同品牌的大豆油、花生油、玉米油、芝麻油的PCA分析图，图中C-玉米油；P-花生油；S-大豆油；Z-芝麻油。

[0080] 实施例7：不同品牌的大豆油、猪油、花生油的PCA分析图。

[0081] 不同品牌的大豆油、猪油、花生油的PCA分析图：分别选取6种不同品牌的大豆油、猪油和花生油，通过建立的离线2D-HPLC-MS的分离方法和校准曲线结合响应因子的定量方法分析其中的甘油三酯，样品浓度0.06mg/mL,共收集8次，氮吹干定容至120μL，以TAG的绝对含量做PCA分析。

[0082] 图7分别掺杂5%，10%，15%（v）猪油的大豆油的主成分分析得分图。图中L-猪油；SL-掺杂油；S-大豆油。

[0083] 图8为分别掺杂5%，10%，15%（v）大豆油的花生油样品的主成分分析得分图。图中P-花生油；PS-掺杂油；S-大豆油。