一种促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养方法

摘要

本发明公开了一种促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养基及培养方法。本发明的促增殖及生根培养基为含IAA和IBA的MS培养基。本发明方法是将带腋芽的黑木相思茎段经初代培养后，腋芽长成新芽，再将新芽剪成含一个腋芽的茎段，接种至本发明的促增殖及生根培养中培养，茎段生根率可达98.41%，腋芽增殖倍数达2.36，单株繁殖系数达6.57。本发明还发现细胞分裂素易诱导黑木相思茎段形成愈伤组织，且茎段的芽长势差，不利于腋芽增殖，而生长素IAA和IBA的联合作用既诱导生根，又诱导腋芽增殖。本发明方法在保证组培苗质量的同时，极大提高了组培快繁效率，实现了优良无性系快速繁殖，为黑木相思组培工厂化奠定了基础。

权利要求

1.一种促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养基，其特征在于：该培养基为在MS基-1 -1 -1本培养基中添加有0.25～0.5 mg·L IBA、0.25～0.5 mg·L IAA、25～40 g·L 蔗糖、-1

6.0～7.0 g·L 琼脂。

2.一种促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养方法，其特征在于：包括以下步聚：

1）以3年生黑木相思优树的带腋芽枝条为材料，剪成长1～2 cm的带腋芽茎段，洗净、消毒，接种至初代培养基中，培养使腋芽长成2～3cm长的新芽；

2）在无菌条件下，将1）中的新芽剪成只含一个腋芽的茎段，接种至权利要求1所述的培养基，培养15～20天使芽生根，培养40～45天使芽增殖。

3.根据权利要求2所述的一种促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养方法，其特征在于：步骤1）所述的消毒过程具体为：将洗涤干净的带腋芽茎段在洁净工作台上用70～

75%酒精和0.08～0.12%升汞分别消毒30～60 s和8～12 min，无菌水洗干净，无菌滤纸吸干表面水分。

4.根据权利要求2所述的一种促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养方法，其特征-1在于：步骤1）中所述的初代培养基为在MS基本培养基中添加有25～40 g·L 蔗糖、6.0～-1

7.0 g·L 琼脂。

5.根据权利要求2所述一种促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养方法，其特征在于：步骤1）的培养条件为：温度23～27 ℃，光周期为13～15 h光照/9～11 h黑暗，光强为2000～2500 Lx。

6.根据权利要求2所述的一种促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养方法，其特征在于：步骤2）的培养条件为温度23～27 ℃，光周期为13～15 h光照/9～11 h黑暗，光强为2000～2500 Lx。

说明书

一种促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养基及培养方法。

背景技术

[0002] 黑木相思属含羞草科(Mimosaceae)金合欢属(Acacia)，具有材质优良、速生丰产、适应性强等特点，且能与根瘤菌共生固氮，在改良土壤、提升地力、保持水土等方面作用显著，是优良的短周期工业原木供应树种和生态防护林树种。

[0003] 林木组织培养主要通过直接器官发生途径和间接器官发生途径来实现，其中直接器官发生途径是通过腋芽增殖来实现以芽繁芽的快速繁殖过程，具有性状遗传稳定，繁殖速度快，植株粗壮等优点，是良种扩繁的有效途径，而间接器官发生途径包含愈伤组织的诱导和愈伤组织再分化两个中间步骤，繁殖速度慢，植物突变率高，不适于保存优良性状。黑木相思两种组培快繁途径均有报道，但存在如下问题：

[0004] 1)以种子苗的茎段作为外植体，虽然可以实现直接器官发生途径，但没有注重优树的选择，种子苗存在性状分化等特征，不能通过组培方式获得无性系，因而会造成生产上林份分化大，林相参差不齐，无法实现规模利用。

[0005] 2)通过间接器官发生途径实现的组织培养技术，其过程包括愈伤组织的诱导和再分化，繁殖速度慢，植物突变率高，不适于保存优良性状。

[0006] 3)黑木相思极易在细胞分裂素的作用下实现间接器官发生途径，细胞分裂素使黑木相思组培过程中的芽的基部形成大量的愈伤组织，不利于根茎叶的生长，一般会出现茎段极细、颜色泛黄、叶片脱落、根系粗大、无须根等不良现象，最终导致黑木相思组培苗质量差，移栽存活率低，从而增加组培苗生产成本。而目前报道的黑木相思直接器官发生途径均有添加一定浓度的细胞分裂素。

[0007] 4)最后，黑木相思组培快繁中容易出现增殖倍数、生根率低，增殖苗用于生根时，生根率低，生根苗移栽存活率低。难以维持组培工厂化生产中多次、稳定的继代培养和较高的生根率、移栽存活率。

发明内容

[0008] 为解决上述存在问题，实现黑木相思优树的直接器官发生途径，并防止该途径中出现大量愈伤组织、芽长势弱小、增殖倍数和生根率低等问题，本实验通过调整培养基中的激素种类及其浓度，建立了适宜于保持黑木相思良种优良性状的高效组织培养快繁途径。

[0009] 本发明的目的在于提供一种促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养基。

[0010] 本发明的另一目的在于提供一种促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养方法。

[0011] 本发明所采取的技术方案是：

[0012] 一种促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养基，该培养基为在MS基本培养基-1 -1 -1 -1中添加有0.25～0.5mg·L IBA、0.25～0.5mg·L IAA、25～40g·L 蔗糖、6.0～7.0g·L琼脂。

[0013] 一种促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养方法，包括以下步聚：

[0014] 1)以3年生黑木相思优株的带腋芽枝条为材料，剪成长1～2cm的带腋芽茎段，洗净、消毒，接种至初代培养基中，培养使腋芽长成2～3cm长的新芽；

[0015] 2)在无菌条件下，将1)中的新芽剪成只含一个腋芽的茎段，接种至权利要求1所述的培养基，培养15～20天使芽生根，培养40～45天使芽增殖。

[0016] 进一步的，步骤1)所述的消毒过程具体为：将洗涤干净的带腋芽茎段在洁净工作台上用70～75％酒精和0.08～0.12％升汞分别消毒30～60s和8～12min，无菌水洗干净，无菌滤纸吸干表面水分。

[0017] 进一步的，步骤1)中所述的初代培养基为在MS基本培养基中添加有25～40g·L-1-1蔗糖、6.0～7.0g·L 琼脂。

[0018] 进一步的，步骤1)所述的初代培养的培养条件为：温度23～27℃，光周期为13～15h光照／9～11h黑暗，光强为2000～2500Lx。

[0019] 进一步的，步骤3)所述的培养的条件为温度23～27℃，光周期为13～15h光照／9～11h黑暗，光强为2000～2500Lx。

[0020] 本发明的有益效果是：

[0021] 1)本发明以优良无性系为起始材料，建立组培快繁体系，确保了组培苗的优良性状。

[0022] 2)在本发明中，联合使用生长素IAA和IBA不仅可以有效诱导黑木相思的生根，还可以显著促进黑木相思腋芽的增殖，实现了黑木相思的直接器官发生途径。

[0023] 3)在本发明中，使用了一种促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养基，该培养基只含生长素不含细胞分裂素，防止了芽基部愈伤组织的过度生长，抑制了及黑木相思间接器官发生途径的出现；所培养的芽生长健壮，叶片舒展，植株颜色较绿，根系发达，组培苗质量好，移栽存活率高。

[0024] 4)在本发明中，将芽接种到促进增殖及生根培养基中，15～20天后即可生根，40～45天即可实现腋芽增殖，缩短了生产环节，节约了生产成本。

[0025] 5)在本发明中，诱导的单株繁殖系数为6.57，即1个外植体通过40～45天增殖培养，可为下一代增殖培养提供6.5个左右的外植体，生根率为98.41％，极大地提高了黑木相思组织培养繁殖效率，实现了黑木相思的优良无性系快速繁殖，为黑木相思组培工厂化奠定了基础。

附图说明

[0026] 图1为细胞分裂素对黑木相思增殖的影响，A为0.1mg·L-16-BA处理黑木相思40-1 -1天后的增殖情况，B为1mg·L 6-BA处理黑木相思40天后的增殖情况，C为2mg·L 6-BA处理黑木相思40天后的增殖情况；

[0027] 图2为生长素IAA和细胞分裂素6-BA的共同作用对黑木相思的增殖和生根影-1 -1响，A为0.1mg·L 6-BA和0.5mg·L IAA共同处理黑木相思40天后的生根和增殖情况，-1 -1
B为0.25mg·L 6-BA和0.5mg·L IAA共同处理黑木相思40天后的生根和增殖情况，C为-1 -1
0.5mg·L 6-BA和0.5mg·L IAA共同处理黑木相思40天后的生根和增殖情况；

[0028] 图3生长素交互作用对黑木相思生根和增殖的影响，A、C分别为0.5mg·L-1IBA和-1 -10.5mg·L IAA共同处理黑木相思20天、40天后的生根和增殖情况，B、D分别为1mg·L IBA-1
和1mg·L IAA共同处理黑木相思20天、40天后的生根和增殖情况。

具体实施方式

[0029] 以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

[0030] 实施例1：

[0031] 一、细胞分裂素6-BA对黑木相思增殖的效果不佳

[0032] 1)材料：以3年生黑木相思优株AMN12001的带腋芽枝条为外植体，剪成长1～2cm的带腋芽茎段，流水冲洗半小时后，在洁净工作台上用75％酒精和0.1％的升汞分别消毒30s和10min，无菌水洗4～6遍，滤纸吸干表面水分后，接入初代培养基(在MS基本培-1 -1
养基中添加有30g·L 蔗糖、7g·L 琼脂)上，培养30天，无菌茎段的腋芽处长出2～3cm的新芽后，将新芽剪成含一个腋芽的茎段，作为以下试验材料。

[0033] 2)增殖处理：取含一个腋芽的黑木相思无菌茎段，分别接种到含0.1mg·L-1、-1 -1 -1 -1 -10.5mg·L 、1.0mg·L 、1.5mg·L 、2.0mg·L 细胞分裂素6-BA的MS培养基(含30g·L-1
蔗糖、琼脂7g·L )，共5个处理，每个处理接种30个上述含1个腋芽的无菌茎段，重复3次。

[0034] 培养40天后调查增殖苗的生长情况并统计其有效增殖倍数和单株繁殖系数。使用Excel，SPSS18.0对数据进行处理和方差分析，以最小显著差数法(LSD)评价差异的显著性。

[0035] 上述“有效增殖倍数”是指一株完整的无菌苗经过一次增殖培养后，得到新的完整的无菌苗的数目。“单株繁殖系数”是指以一个含腋芽茎段经一次增殖培养后，得到新的含一个腋芽的茎段的数目。

[0036] 3)结果：第40天观察发现黑木相思茎段在不同浓度的细胞分裂素6-BA诱导下，基部均有愈伤组织形成(如图1所示)，不同处理下的效增殖倍数和单株繁殖系数如表1所-1示。当6-BA浓度为0.1mg·L 时，增殖倍数为3.19，极显著高于其它处理组，但基部仍有大-1
量白色愈伤组织形成，芽矮小，颜色偏黄，有落叶(如图1A)；当6-BA浓度升高至1.0mg·L ，增殖倍数和单株繁殖系数急剧下降至1.24和1.50，芽的长势变差(图1B)；在6-BA浓度等-1
于或高于1.5mg·L 时，不仅无腋芽增殖现象，部分外植体甚至死亡，茎段基部愈伤组织颜色深绿，表面有绿色凸起物出现，即将再分化(图1C)。

[0037] 表1细胞分裂素对黑木相思增殖的影响

[0038]

[0039] 注：表中右上角字母表示LSD多重比较结果，小写字母代表P＜0.05，大写字代表P＜0.01。

[0040] 4)结论：以上实验数据说明促进细胞分裂和增殖的细胞分裂素并不适合实现黑木相思的直接器官发生途径。

[0041] 尽管细胞分裂素在植物组织培养中的主要作用是促进细胞分裂和增殖，其在桉树(Eucalyptus)、雪松(Cedrus atlantica)、杨树(Populus)、杂种相思等木本植物的直接器官发生途径中均发挥了显著作用，实现了以芽繁芽的过程，但在黑木相思的直接器官发生途径中，易形成大量的愈伤组织，引发间接器官发生途径再分化形成新的植株，且芽长势较差，不利于黑木相思的腋芽增殖和生根体系的建立，不能有效促进黑木相思以芽繁芽的过程。

[0042] 二、不同生长素对黑木相思增殖和生根的影响

[0043] 1)材料：同“一”中的材料。

[0044] 2)增殖和生根处理：取含一个腋芽的黑木相思无菌茎段，分别接种到含-1 -1 -1 -1 -10.1mg·L 、0.5mg·L 、1.0mg·L 、1.5mg·L 、2.0mg·L 的IBA 或NAA或 AA的 MS(含-1 -1
30g·L 蔗糖、琼脂7g·L )为培养基，为共15个处理，每个处理接种30个含1个腋芽的无菌茎段，重复3次，第20天时调查苗的生长情况并统计生根率、生根数(如表2所示)，第
40天调查苗的生长情况并统计增殖倍数、单株繁殖数(如表2所示)。

[0045] 3)结果：第20天调查发现，黑木相思在含不同的浓度的3种生长素的培养基中均有生根现象，但在生根率和生根数目上有所区别。由表3可知，NAA诱导生根效果最差，不仅生根率偏低，生根数目也偏低，而不同浓度的IBA、NAA、IAA诱导黑木相思的生根率差异均显著，随着IBA浓度增加，生根数目增多，苗长势先变好后变差；随着NAA浓度的增加，生根率和生根数目均递增，苗长势也逐渐变好；而黑木相思的生根率随着IAA浓度的增加先-1上升后下降，在IAA为1.0mg·L 时最高，黑木相思的生根率为94.87％(如表2所示)。

[0046] 第40天调查发现，不同的浓度的3种生长素不仅能诱导黑木相思生根，还能诱导其腋芽增殖，但3种生长素对黑木相思增殖的影响差异不显著，不同浓度的IAA之间则差异也不明显，仅不同浓度的IBA、NAA对黑木相思增殖倍数的影响存在显著差异，另外，3种生长素的不同浓度对黑木相思的单株繁殖系数的影响也均达到了显著水平。随着IBA浓度升高，增殖倍数变化不大，单株繁殖系数逐步上升；随着NAA和IAA浓度升高，增殖倍数变化不-1大，而单株繁殖系数表现出先逐步上升后逐渐下降的趋势，当IAA为1.0mg·L 时，腋芽增殖效果最佳，其增殖倍数为2.44，单株繁殖系数为6.47(如表2所示)。

[0047] 表2不同生长素及其不同浓度对黑木相思增殖和生根的影响

[0048]

[0049]

[0050] 注：右上角字母表示多重比较结果(p＜0.05)，苗的生长状况以“+”表示，“+”越多表示长势越好。

[0051] 4)结论：上述实验结果说明，不同的浓度的3种生长素IBA、NAA、IAA不仅能诱导-1黑木相思生根，还能诱导其腋芽增殖，其中浓度为1.0mg·L 的IAA对黑木相思生根率的诱导率相对最好为94.87％，，但IBA、NAA、IAA三者对腋芽增殖的效果之间没有显著的差异。

[0052] 三、细胞分裂素6-BA和生长素IAA的联合作用对黑木相思增殖的影响[0053] 1)材料：同“一”中的材料。

[0054] 2)增殖处理：取含一个腋芽的黑木相思无菌茎段，分别接种到含不同浓度的IAA-1 -1和6-BA的MS(含蔗糖30g·L 、琼脂7g·L )培养基，共设计6组处理，每组中的生长素IAA和细胞分裂素6-BA的浓度如表3所示，每组处理接种30个含1个腋芽的无菌茎段，重复3次，40天后观察增殖苗的生长情况并统计其有效增殖倍数和单株繁殖系数(如表3所示)，探索生长素IAA和细胞分裂素6-BA的联合作用对黑木相思增殖是否具有明显的促进效果。

[0055] 表3细胞分裂素和生长素共同作用对黑木相思增殖的影响

[0056]

[0057]

[0058] 注：表中右上角字母表示多重比较结果，小写字母代表P＜0.05，大写字代表P＜0.01。

[0059] 3)结果：处理结果显示6组外源激素组合诱导的黑木相思均有愈伤组织形成，增殖芽茎干细小，颜色偏黄，部分芽出现生根现象。当细胞分裂素浓度极低时(6-BA为-1 -1 -10.1mg·L 、IAA为1.0mg·L 或0.5mg·L )，增殖芽细长且透明，长势极差，基部形成大量愈伤组织，从愈伤组织中长出的根短且粗大、无须根(如图2A)；随着6-BA浓度升高(6-BA-1 -1
为0.25mg·L 、IAA为0.5mg·L )，增殖现象减少，增殖芽变矮小，愈伤组块变大、颜色趋向-1 -1
绿色(图2B)；当6-BA为0.5mg·L 、IAA为0.5mg·L 时，其增殖倍数极显著优于其它激素组合，为3.12，但此时形成的增殖芽是由愈伤组织经再分化而来，芽矮小，茎段细且透明，长势较差(图2C)。

[0060] 4)结论：上述实验结果说明生长素IAA和细胞分裂素6-BA的共同作用对黑木相思增殖没有起到显著的促进效果。

[0061] 四、两种生长素的共同作用对黑木相思增殖和生根的影响

[0062] 1)材料：同“一”中的材料。

[0063] 2)增殖和生根处理：取含一个腋芽的黑木相思无菌茎段，分别接种到含不同浓-1 -1度的IBA和IAA的MS(含蔗糖30g·L 、琼脂7g·L )培养基，其中IBA浓度分别选取-1 -1 -1 -1 -1 -1
0.5mg·L ，1.0mg·L ，1.5mg·L 和IAA浓度分别选取0.5mg·L ，1.0mg·L ，1.5mg·L ，两种生长素3×3组合浓度，共9组试验，如表4所示。每个处理接种30个无菌茎段，重复
3次。培养至第20天和第40天观察苗的生长情况并分别统计生根率、生根数和增殖倍数、单株繁殖系数(如表4所示)。

[0064] 表4生长素IAA和IBA的共同作用对黑木相思生根和增殖的影响

[0065]

[0066]

[0067] 注：右上角字母表示多重比较结果(p＜0.05)，苗的生长状况以“+”表示，“+”越多表示长势越好。

[0068] 3)结果：由表4可知，选用IBA和IAA两种激素进行组合诱导黑木相思的生根率比仅用一种生长素诱导的生根率高，且增殖苗长势较好、单株繁殖系数高。且当IBA为0.5mg·L-1、IAA为0.5mg·L-1时，生根率最高，为98.41％，其培养20天后的长势如图3A所示，根系粗壮，生根苗长势较好；继续培养20天后，其增殖倍数和单株繁殖系数也最高，分别为2.36和6.57，增殖苗叶片舒展、茎段粗壮(如图3C)，宜于移栽，是最理想的腋芽增殖培养基。

[0069] 另外，随着IBA浓度增加，增殖倍数和单株繁殖系数呈梯度下降。经分析可知，生根率还受生长素总浓度的影响，总浓度等于或高于2.0mg·L-1时，如表4第5组的处理(含IBA和IAA浓度均为1mg·L-1)，在培养第20天时在生根苗基部形成白色愈伤组织，根系多且短，生根率下降趋势明显(图3B)，继续培养20天后，愈伤组块变大，根系出现黑色节点，增殖苗矮且弱(图3D)。

[0070] 4)结论：上述实验结果说明含有0.5mg·L-1IBA和0.5mg·L-1IAA的培养基，诱导黑木相思生根的效果最佳，同时对黑木相思腋芽增殖的促进效果也最好。

[0071] 以上实验所用到的MS培养基均为在MS基本培养基中添加有7g.L-1琼脂、25～-140g·L 蔗糖(文中所有所述的MS基本培养基为现有常规所述的MS基本培养基，不含琼脂和糖类物质)，pH值为5.5～6.5，且在121℃下高压灭菌15min；上述所有黑木相思培养的条件为温度25±2℃，光周期为14h光照／10h黑暗。

[0072] 五、总结

[0073] (1)促进黑木相思优树腋芽增殖及生根的培养方法

[0074] 1)取3年生黑木相思优株AMN12001的带腋芽枝条，剪成长1～2cm的带腋芽茎段，流水冲洗半小时后，在洁净工作台上用73～77％酒精和0.08～0.12％的升汞分别消毒30～60s和8～12min，无菌水洗4～6遍，滤纸吸干表面水分；

[0075] 2)在无菌条件下，将上述带腋芽茎段接入初代培养基(在MS基本培养基中添加有-1 -125～40g·L 蔗糖、6.0～7.0g·L 琼脂)，初代培养30天左右，茎段的腋芽处长出2～
3cm的新芽，培养条件为温度23～27℃，光周期为13～15h光照/9～11h黑暗，光强为
2500Lx；

[0076] 3)在无菌条件下，将2)中新芽剪成只含一个腋芽的茎段，称为1个处植体，接-1种到促增殖及生根培养基(在MS基本培养基中添加有0.25～0.5mg·L IBA、0.25～-1 -1 -1
0.5mg·L IAA、25～40g·L 蔗糖、6.0～7.0g·L 琼脂)中，进行促增殖及生根培养，培养条件为温度23～27℃，光周期为13～15h光照／9～11h黑暗，光强为2500Lx，培养
15～20天即可观察到可观的生根率，培养40～45天可观察到显著的腋芽增殖效果。

[0077] (2)黑木相思优树腋芽增殖及生根效果

[0078] 采用(1)中的培养方法，黑木相思在促增殖及生根培养的第15～20天时，出现生根现象，其生根率为98.41％，平均每株的根数达到4.62条，再继续培养20～25天后，腋芽增殖倍数为2.36，单株繁殖系数可达6.57，即1个外植体通过40～45天的促增殖及生根培养，可为下一代增殖培养提供约6.5个外植体。

[0079] 上述促增殖及生根培养效果说明，本发明方法在保证黑木相思组培苗质量的同时，极大地提高了组培快繁效率，实现了黑木相思的优良无性系快速繁殖，为黑木相思组培工厂化奠定了基础。