一种甘蓝小孢子单倍体植株加倍的方法

摘要

本发明公开了一种甘蓝小孢子单倍体植株加倍的方法，包括下列步骤：选择小孢子单倍体植株花薹茎生幼嫩叶片，切成1cm2的小片作为外植体；将外植体放入外植体浸泡溶液中浸泡24h～48h；把外植体接种到培养基上诱导出不定芽；待不定芽生长至3.0～3.5cm高，自不定芽基部切下将其转入生根培养基上培养，经诱导生根，获得再生苗；将再生苗在室内锻炼3～5天，再移田间遮阳网棚锻炼2～3天，随后直接移栽到纱网棚内，栽培促其生长，翌年再生植株抽薹开花鉴定倍性，获得加倍的双单倍体植株。该方法不仅克服了培养基中添加秋水仙素易导致外植体褐化死亡率高、诱芽率低等问题，而且提高了再生植株诱导率和双单倍体植株加倍率。

权利要求

1.一种甘蓝小孢子单倍体植株加倍的方法，其特征在于，包括下列步骤：2

1）选择小孢子单倍体植株花薹茎生幼嫩叶片，切成1cm左右的小片作为离体培养的外植体；

2）将无菌外植体放入外植体浸泡溶液中浸泡24h～48h；

3）把浸泡后的外植体接种到培养瓶内的外植体诱导培养基上，在温度25℃下，暗培养

25d，随后转入光培养，12h～14h/d光照，光照强度 2000～2500Lx，经20～25天诱导出不定芽；

4）待不定芽生长至3.0～3.5 cm高，自不定芽基部切下将其转入培养瓶内的生根培养基上，在温度 25℃，12h～14h/d光照，光照强度 2500～3000Lx的条件下培养，经20～

25d诱导生根，获得再生苗；

5）将有再生苗的培养瓶口打开，室内锻炼3～5天，再移田间遮阳网棚锻炼2～3天，随后从培养瓶中取出再生苗，洗去根部的培养基浸蘸杀菌药剂，直接移栽到纱网棚内，栽培促其生长，翌年再生植株抽薹开花，采用再生植株形态学观察与气孔保卫细胞叶绿体计数法结合的方法鉴定倍性，获得加倍的双单倍体植株；

所述的外植体浸泡溶液是含有浓度为0.2～10 mg/L秋水仙素和浓度为1.0～5.0 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤的蒸馏水溶液；

所述的外植体诱导培养基为：MS培养基中添加30g/L蔗糖、8g/L琼脂、2.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤及0.1mg/L的α-萘乙酸，pH值为5.8～6.0；

所述的生根培养基为： MS培养基中添加30g/L蔗糖、8g/L琼脂和0.1～1.0mg/L的α-萘乙酸、0.01mg/L烯效唑，pH值为5.8～6.0。

说明书

一种甘蓝小孢子单倍体植株加倍的方法

技术领域

[0001] 本发明属于甘蓝育种技术领域，涉及利用甘蓝小孢子单倍体植株茎生叶通过离体组织培养技术实现小孢子单倍体植株加倍获得再生双单倍体植株的方法。

背景技术

[0002] 甘蓝为二倍体2n=2x=18异花授粉植物，其杂交种由基因型纯合的两个亲本配制而成。甘蓝小孢子培养是创制基因型纯合的双单倍体植株（Double haploid plants，简称DH株）亲本的一条重要途径，其除具有诸多优点外，最大缺点是小孢子植株群中单倍体植株（Haploid plants，简称H植株）比率高，严重影响着甘蓝单倍体育种效果。通常甘蓝小孢子再生植株群体中仅有10 %～50 %可自然加倍形成的双单倍体植株，由此表明相当一部分由甘蓝小孢子再生的单倍体植株不能自然加倍成为双单倍体植株，使其不能正常开花结籽和配制杂交种，达不到有效创制新资源的目的。因而，甘蓝育种家致力于甘蓝单倍体植株加倍的技术研究，常规方法主要有两种，一种是在小孢子热激培养时在培养基中添加秋水仙素，提高小孢子再生植株群中DH株比率，一般达30 %～80 %，加倍效果主要受基因型影响比较大；另一种是用秋水仙素涂抹或浸泡单倍体植株生长点或根系加倍染色体，进一步诱导发育成双单倍体或多倍体。前一种方法可得到较高加倍率，但还存在一定数量的H植株未能被充分利用，后一种方法除获得加倍植株难度较大外，加倍率为30%左右，加倍过程中单倍体植株易死亡，对于甘蓝小孢子培养中每粒小孢子仅再生1棵植株，后一种方法不能保证每棵单倍体植株能够获得加倍后代或保证植株存活。

发明内容

[0003] 针对上述现有技术中存在的问题与不足，本发明的目的在于，提供一种甘蓝小孢子单倍体植株加倍的方法。该方法首次利用甘蓝小孢子单倍体开花植株的花薹茎生叶片作为外植体，通过研制的秋水仙素和6-BA混合液浸泡后再经离体组织培养获得双单倍体植株，拟将保证每个甘蓝小孢子单倍体植株能够获得再生双单倍体植株，其比培养基添加秋水仙素离体培养和秋水仙素涂抹生长点加倍方法获得显著效果，由此解决了甘蓝单倍体植株不能加倍或加倍效率低的难题，极大地提高了甘蓝小孢子培养效率。

[0004] 为了实现上述目的，本发明采取如下的技术解决方案：一种甘蓝小孢子单倍体植株加倍的方法，包括下列步骤：

[0005] 1）选择小孢子单倍体植株花薹茎生幼嫩叶片，切成1cm2左右的小片作为离体培养的外植体；

[0006] 2）将无菌外植体放入外植体浸泡溶液中浸泡24h～48h；

[0007] 3）把浸泡后的外植体接种到培养瓶内的外植体诱导培养基上，在温度25℃下，暗培养25d，随后转入光培养，12h～14h/d光照，光照强度 2000～2500Lx，经20～25天诱导出不定芽；

[0008] 4）待不定芽生长至3.0～3.5 cm高，自不定芽基部切下将其转入培养瓶内的生根培养基上，在温度 25℃，12h～14h/d光照，光照强度 2500～3000Lx的条件下培养，经20～25d诱导生根，获得再生苗；

[0009] 5）将有再生苗的培养瓶口打开，室内锻炼3～5天，再移田间遮阳网棚锻炼2～3天，随后从培养瓶中取出再生苗，洗去根部的培养基浸蘸杀菌药剂，直接移栽到纱网棚内，栽培促其生长，翌年再生植株抽薹开花，采用再生植株形态学观察与气孔保卫细胞叶绿体计数法结合的方法鉴定倍性，获得加倍的双单倍体植株。

[0010] 所述的外植体浸泡溶液是含有浓度为0.2～10 mg/L秋水仙素和浓度为1.0～5.0 mg/L6-BA的蒸馏水溶液。

[0011] 所述的外植体诱导培养基为：MS培养基中添加30g/L蔗糖、8g/L琼脂、2.0mg/L的6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）及0.1mg/L的NAA（α-萘乙酸），pH值为5.8～6.0。

[0012] 所述的生根培养基为： MS培养基中添加30g/L蔗糖、8g/L琼脂和0.1～1.0mg/L的NAA（α-萘乙酸）、0.01mg/L稀效唑，pH值为5.8～6.0。

[0013] 与现有技术相比，本发明的方法具有以下优点：

[0014] 1.本发明研制出秋水仙素中添加一种细胞分裂素（6-苄氨基腺嘌呤（6-BA））离体浸泡加倍溶液，采用外植体浸泡后再离体培养的方法替代在培养基中添加秋水仙素诱导加倍培养的方法，获得加倍率至少高出2倍的结果。

[0015] 2.比较秋水仙素涂抹单倍体植株生长点加倍的方法，能保证每个甘蓝小孢子单倍体植株获得再生双单倍体植株并且加倍效率高，每个茎生叶片至少创造10个外植体，外植体分化率85.0%，外植体分化系数2.5；如每个小孢子单倍体植株选用2片叶，本发明至少可获再生植株数42株，双单倍体植株加倍率58.2%，则获双单倍体植株至少22株。

[0016] 3.本发明比培养基中添加秋水仙素离体诱导加倍方法外植体的褐化少、不定芽再生数多；比秋水仙素涂抹生长点加倍方法对单倍体植株危害小、植株死亡少，解决了甘蓝单倍体植株不能加倍或加倍效率低的难题。

附图说明

[0017] 图1是实施例甘蓝小孢子单倍体Ｈ10-5株（右）抽薹期图；

[0018] 图2是实施例甘蓝小孢子单倍体Ｈ10-5株茎生叶（外植体）不定芽诱导图；

[0019] 图3是实施例甘蓝小孢子单倍体Ｈ10-23株外植体再生苗图；

[0020] 图4是实施例甘蓝小孢子单倍体Ｈ10-23株外植体加倍再生植株生殖生长期图。

具体实施方式

[0021] 以下通过发明人给出的具体实施例和试验例对本发明的有益效果做进一步描述：

[0022] 实施例1

[0023] 一种甘蓝小孢子单倍体加倍双单倍体的方法，其特征在于，包括下列步骤：

[0024] 1、外植体选择

[0025] 甘蓝小孢子培养获得小孢子苗，冬前移栽塑料大棚栽培使其通过春化，翌年春季小孢子植株抽薹开花，通过植株形态、花器官和气孔保卫细胞叶绿体数鉴别植株倍性，植株长势弱、叶形窄长，花朵小、无花粉则为单倍体植株。选择小孢子单倍体植株花薹茎生幼嫩2
叶片，切成1cm左右的小片作为离体培养的外植体。

[0026] 2、秋水仙素和6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）母液配制

[0027] 其包括下列步骤：

[0028] 1）秋水仙素母液配制

[0029] ①称取秋水仙素1克；

[0030] ②在秋水仙素中滴入少许酒精导溶后再加适量蒸馏水振摇使其全部溶解；

[0031] ③在秋水仙素溶液中继续用蒸馏水定容至1000mL，即得浓度为1.0 g/L的秋水仙素母液；

[0032] 2）6-BA母液配制

[0033] ①称取6-BA 1克；

[0034] ②将称取的6-BA放进100mL的小烧杯中，滴入少许1 mol/L的NaOH溶液导溶后加适量蒸馏水振摇使其全部溶解；

[0035] ③将全部溶解后的6-BA定容到1000mL定量瓶中，即配成1.0g/L的母液。

[0036] 3．秋水仙素母液灭菌选用抽滤灭菌，包括下列步骤：

[0037] 1）用抽滤器将秋水仙素母液先用0.45μm滤膜预抽滤二遍；

[0038] 2）将灭过菌的抽滤器主要部件安装和放置在超净工作台上，并用镊子将灭过菌的0.22μm滤膜放到滤头位置安装好；将预抽滤的秋水仙素母液在无菌超净工作台上抽滤一遍，装入贮藏瓶4℃冰箱中保存，待具体使用时再按所需要浓度进行稀释。

[0039] 4．6-BA母液灭菌选用高压灭菌，包括下列步骤：

[0040] 1）将6-BA母液装入耐压瓶，封口放入高压灭菌锅；

[0041] 2）在0.2MPa下灭菌30分钟，随后冷却放在4℃冰箱中保存，待具体使用时再按所需要浓度进行稀释。

[0042] 5、秋水仙素和6-BA溶液浸泡外植体

[0043] 1）在超净台上，用微量移液器分别吸取一定量的秋水仙素母液和6-BA母液直接添加于100ml的三角瓶中，用无菌蒸馏水调释使秋水仙素浓度在0.2～10 mg/L之间，6-BA浓度在1.0～5.0 mg/L之间，成为外植体浸泡溶液。

[0044] 2）在超净台上，将无菌外植体放入适宜浓度的秋水仙素和6-BA溶液中浸泡24h。

[0045] 6、浸泡外植体的不定芽分化诱导

[0046] 把浸泡24h的外植体接种到培养瓶内的外植体诱导培养基上，在温度25℃下，暗培养25天（d），随后转入光培养，12h～14h/d光照，光照强度 2000～2500Lx，经20～25天（d）诱导出不定芽。上述的MS培养基，含30g/L蔗糖、8g/L琼脂、2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤（6-BA）及0.1mg/L的α-萘乙酸（NAA），pH值为5.8～6.0。

[0047] 7、不定芽的生根诱导

[0048] 待不定芽生长至3.0～3.5厘米（cm）高时，自不定芽基部切下将其转入培养瓶内的生根培养基上，在温度 25℃，12h～14h/d光照，光照强度 2500～3000Lx的条件下培养，经20～25天（d）诱导生根，获得再生苗。所述的生根培养基为：MS培养基，其中含30g/L蔗糖、8g/L琼脂和0.1～1.0mg/L的α-萘乙酸（NAA）、0.01mg/L稀效唑，pH值为5.8～6.0。

[0049] 8、再生苗的锻炼与移栽

[0050] 将有再生苗的培养瓶口打开，室内锻炼3～5天（d），再移田间遮阳网棚锻炼2～3天（d），随后从培养瓶中取出再生苗，洗去根部的培养基浸蘸杀菌药剂，直接夹苗移栽到纱网棚内，栽培促其生长。

[0051] 9、外植体再生植株倍性鉴定

[0052] 栽培再生植株，冬前纱网棚上覆盖塑料薄膜使再生植株越冬，翌年再生植株抽薹开花，采用再生植株形态学观察与气孔保卫细胞叶绿体计数法相结合的方法鉴定倍性。

[0053] 倍性鉴定标准：在再生植株开花期观察记录每个植株的主要形态学特征，包括植株的形态大小、生长势、花器官大小和花粉，以此鉴定倍性。当植株表现生长势相对较弱、个体较小，花蕾小而瘪，花小，无雄蕊或雄蕊发育不正常，无花粉时，其即为单倍体植株；当植株表现为生长健壮，与正常双单倍体表现相同，雄蕊和雌蕊发育均正常，有花粉时，其即为加倍的双单倍体植株（DH株）；当植株表现植株生长势强，个体大，花蕾大，花大，但有或无花粉时即为多倍体。再生植株花期形态学鉴定的同时，再利用气孔保卫细胞叶绿体数的镜检进一步判断倍性（参考袁素霞等，甘蓝类蔬菜小孢子再生植株染色体倍性与气孔保卫细胞叶绿体数的相关性，中国农业科学，2009，01:189-197）。

[0054] 试验例1：

[0055] 本试验例选用申请人所在甘蓝育种和生物技术研究室，通过甘蓝小孢子培养获得的小孢子单倍体植株H10-5为实验材料。

[0056] 1、外植体选择

[0057] 甘蓝小孢子H10-5植株为单倍体植株(图1)。选择H10-5植株花薹茎生嫩叶片，2
切成1cm左右的小片作为离体培养的外植体。

[0058] 2、秋水仙素和6-BA溶液浸泡外植体

[0059] 1）在超净台上，用微量移液器分别吸取0.1ml秋水仙素1.0g/L母液和0.2ml 6-BA1.0g/L母液直接添加于100ml的三角瓶中，用无菌蒸馏水烯释使秋水仙素浓度为1.0 mg/L和6-BA浓度为2.0mg/L，成为外植体浸泡溶液。

[0060] 2）将无菌外植体放入秋水仙素浓度为1.0 mg/L和6-BA浓度为2.0mg/L浸泡溶液中浸泡36h。

[0061] 3、浸泡外植体的不定芽分化诱导

[0062] 把浸泡36h的外植体接种到培养瓶内的MS+2.0mg/L 6-BA+0.1

[0063] mg/L NAA+ 30g/L蔗糖+8g/L琼脂的培养基上，pH值为5.8。在温度25℃下，暗培养25天（d），随后光培养（图2），在14h/d光照，光照强度 2000 Lx，光培养22天（d）诱导出不定芽。

[0064] 4、不定芽的生根诱导

[0065] 待不定芽生长至3.0厘米高时，自不定芽基部切下将其转入培养瓶内的生根培养基，即MS+0.2mg/L NAA+0.01mg/L稀效唑+ 30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH值为5.8上。在温度25℃，14h/d光照，光照强度 2500 Lx的条件下培养，经23天（d）诱导生根，获得再生苗。

[0066] 5、再生苗的锻炼与移栽

[0067] 将H10-5再生苗的培养瓶口打开，室内锻炼4天，田间遮阳网棚锻炼2天，随后从培养瓶中取出再生苗，洗去根部的培养基浸蘸150ppm农用链霉素药液后，直接夹苗移栽到纱网棚内，栽培促其生长。翌年再生植株抽薹开花，倍性鉴定H10-5再生的39株中加倍的双单倍体植株（DH株）22株（表1），加倍率56.4%，比对照增加2倍（表2），22株DH单株自交授粉6月25日获得种子。

[0068] 试验例2：

[0069] 本试验例选用申请人所在甘蓝育种和生物技术研究室，通过甘蓝小孢子培养获得的小孢子单倍体植株H10-23为实验材料。

[0070] 1、外植体选择

[0071] 甘蓝小孢子H10-23植株为单倍体植株。选择H10-23植株花薹茎生嫩叶片，切成2
1cm左右的小片作为离体培养的外植体。

[0072] 2、秋水仙素和6-BA溶液浸泡外植体

[0073] 1）在超净台上，用微量移液器分别吸取0.5 ml秋水仙素1.0g/L母液和0.3 ml6-BA 1.0g/L母液直接添加于100ml的三角瓶中，用无菌蒸馏水烯释使秋水仙素浓度为5.0 mg/L和6-BA浓度为3.0mg/L，成为外植体浸泡溶液。

[0074] 2）将无菌外植体放入秋水仙素浓度为5.0 mg/L和6-BA浓度为3.0mg/L浸泡溶液中浸泡24 h。

[0075] 3、浸泡外植体的不定芽分化诱导

[0076] 把浸泡24h的外植体接种到培养瓶内的MS+2.0mg/L 6-BA+0.1

[0077] mg/L NAA+ 30g/L蔗糖+8g/L琼脂的培养基上，pH值为6.0。在温度25℃下，暗培养20天，随后光培养，在12h/d光照，光照强度2500Lx，光培养25天诱导出不定芽。

[0078] 4、不定芽的生根诱导

[0079] 待不定芽生长至3.0厘米高时，自不定芽基部切下将其转入培养瓶内的生根培养基，即MS+0.2mg/L NAA+0.01mg/L稀效唑+ 30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH值为6.0上。在温度 25℃，12h/d光照，光照强度 3000 Lx的条件下培养，经23天诱导生根，获得再生苗（图3）。

[0080] 5、再生苗的锻炼与移栽

[0081] 将H10-23再生苗的培养瓶口打开，室内锻炼5天，田间遮阳网棚锻炼2天，随后从培养瓶中取出再生苗，洗去根部的培养基浸蘸150ppm农用链霉素药液后，直接夹苗移栽到纱网棚内，栽培促其生长。翌年再生植株抽薹开花（图4），倍性鉴定H10-23再生的30株中加倍的双单倍体植株（DH株）18株，（表3），加倍率60.0%，比对照增加2.6倍（表2），18株DH单株自交授粉6月27日获得种子

[0082] 表1：秋水仙素与6-BA溶液浸泡外植体后离体培养再生植株倍性表现[0083]

[0084] 注：DH：为双单倍体植株；H：单倍体植株；多：三倍体以上植株。

[0085] 表2：甘蓝小孢子单倍体植株加倍效果

[0086]

[0087] 注：A：秋水仙素+6-BA溶液浸泡外植体36h；B：秋水仙素+6-BA溶液浸泡外植体24h；CK：秋水仙素添加外植体不定芽诱导培养基中。

[0088] 表3：秋水仙素与6-BA溶液浸泡外植体后离体培养再生植株倍性表现[0089]

[0090] 注：DH：为双单倍体植株；H：单倍体植株；多：三倍体以上倍性植株。