干扰SIRT1表达试剂在制备抑制肝癌干细胞干性转录因子表达的试剂中的应用转让专利
申请号 : CN201410032609.7
文献号 : CN103751806B
文献日 : 2015-10-14
发明人 : 钱程 , 刘丽梅 , 刘春刚 , 沈俊杰 , 单娟娟
申请人 : 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
摘要 :
本发明属于化学领域，具体公开了干扰SIRT1表达试剂在制备抑制肝癌干细胞干性转录因子表达的试剂中的应用，通过抑制肝癌干细胞中干性转录因子的表达，降低肝癌干细胞的增殖能力、克隆形成能力和成球能力，从而抑制肝癌干细胞的自我更新；因此可以将干扰SIRT1表达试剂用于制备靶向治疗肝癌的药物。
权利要求 :
1.干扰SIRT1表达试剂在制备抑制肝癌干细胞干性转录因子表达的试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述干扰SIRT1表达试剂为干扰SIRT1表达的慢病毒或Tenovin-6。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述Tenovin-6的浓度为2.5～10μM。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述干扰SIRT1表达的慢病毒由Lv-sh-SIRT1质粒转染293T细胞后，经包装、纯化而得。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于：所述干性转录因子为SOX2、Oct4、c-Myc或Nanog。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述干性转录因子为SOX2或Nanog。
说明书 :
干扰SIRT1表达试剂在制备抑制肝癌干细胞干性转录因子
表达的试剂中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于化学领域，特别涉及干扰SIRT1表达试剂在制备抑制肝癌干细胞干性转录因子表达的试剂中的应用。
背景技术
[0002] 肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）是存在于肿瘤中的一小部分具有干细胞性质的细胞群体，具有无限增殖、自我更新和多向分化潜能的细胞，是肿瘤发生、发展的根源。大量的研究表明，干细胞产生后通过本身固有的多能转录因子如Oct4，SOX2和Nanog调节外在的信号，从而使干细胞寄居在能够维持“干性”特性的微环境（niche）中，进而维持自我更新能力，这些多能转录因子对于维持干细胞的潜在多能性和介导细胞增殖等作用具有至关重要的作用。研究证实，多能转录因子Oct4，SOX2和Nanog三者之间形成一个反馈调节环路，活化并促进干细胞生长和自我更新，同时抑制分化基因的表达，但对于上述转录因子激发干细胞形成机制尚不明确。此外，研究发现多个蛋白编码基因，它们的产物参与了肿瘤干细胞“干性”维持和肿瘤的发生。因此，研究这些基因与多能转录因子的相互作用，对于研究肿瘤干细胞自我更新的作用机制具有重要的作用。
[0003] 在细胞内修饰组蛋白的酶类往往也是修饰转录因子的酶类,维持多能性的重要转录因子也受到翻译后修饰的调控。去乙酰化酶SIRT1通过调节基因的功能和转录从而决定细胞的命运，其调节基因的功能和转录主要以表观遗传的方式调节组蛋白活性（主要是H4K16和H3K9位点）和乙酰化修饰调节非组蛋白的表达特别是一些关键的转录因子如p53，FOXO，c-MYC，HIF1α、HIF2α等。新近研究发现，SIRT1在维持鼠胚胎干细胞（ESC）和人胚胎干细胞（HSC）自我更新作用中具有重要的作用。SIRT1通过乙酰化作用于p53，从而调节干细胞的多能转录因子Nanog、Oct4和SOX2的表达。在人和鼠造血干细胞中，SIRT1可通过能量代谢的改变调节转录因子的活性，进而维持造血干细胞的自我更新。然而，关于SIRT1在实体肿瘤干细胞中调节多能转录因子维持干细胞自我更新的作用尚未见文献报道。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供干扰SIRT1表达试剂的新用途，为肝癌的靶向治疗具 有重要意义。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 干扰SIRT1表达试剂在制备抑制肝癌干细胞干性转录因子表达的试剂中的应用。
[0007] 优选的，所述干扰SIRT1表达试剂为干扰SIRT1表达的慢病毒或Tenovin-6。
[0008] 更优选的，所述Tenovin-6的浓度为2.5～10μM。
[0009] 优选的，所述干扰SIRT1表达的慢病毒由Lv-sh-SIRT1质粒转染293T细胞后，经包装、纯化而得。
[0010] 优选的，所述干性转录因子为SOX2、Oct4、c-Myc或Nanog。
[0011] 优选的，所述干性转录因子为SOX2或Nanog。
[0012] 本发明的有益效果在于：本发明公开了干扰SIRT1表达试剂在制备抑制肝癌干细胞干性转录因子表达的试剂中的应用，通过抑制肝癌肝细胞中干性转录因子，从而抑制肝癌干细胞的增殖、克隆形成、成球能力以及皮下移植瘤形成率，延缓体内肿瘤生长，抑制肝癌干细胞的自我更新。因此可以将干扰SIRT1表达试剂用于靶向治疗肝癌，对延长肝癌生存时间具有重要意义。
附图说明
[0013] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0014] 图1为干扰SIRT1表达后检测各干性转录因子的表达。
[0015] 图2为干扰SIRT1表达后不同时间检测干性转录因子的表达。
[0016] 图3为不同浓度TV-6处理细胞检测Nanog和SOX2的表达。
[0017] 图4为5μM TV-6处理肝癌干细胞后不同时间点检测Nanog、SOX2的表达。
[0018] 图5为在肝癌组织和肝癌细胞系中SIRT1与SOX2的表达。
[0019] 图6为干扰SIRT1过表达SOX2的蛋白表达情况（A：western-blot检测；B：免疫荧光检测）。
[0020] 图7为干扰SIRT1过表达SOX2对肝癌干细胞克隆形成和成球能力的影响。
[0021] 图8为干扰SIRT1过表达SOX2对NOD/SCID小鼠移植瘤的影响（A：移植瘤观察结果；B：移植瘤的重量和体积）。
[0022] 图9为免疫荧光和免疫组化分别检测移植瘤中GFP或SIRT1和SOX2的表达。
[0023] 图10为NanogPos的肝癌干细胞中干扰SIRT1再过表达SOX2影响Nanog的表达（A：Pos
western-blot检测在Nanog 的肝癌干细胞中干扰SIRT1再过表达SOX2的细胞中GFP的表达；B：western-blot检测在干扰SIRT1再过表达SOX2的移植瘤中GFP的表达）。
western-blot检测在Nanog 的肝癌干细胞中干扰SIRT1再过表达SOX2的细胞中GFP的表达；B：western-blot检测在干扰SIRT1再过表达SOX2的移植瘤中GFP的表达）。
[0024] 图11为在NanogPos的肝癌干细胞中干扰SIRT1再过表达SOX2的细胞中用萤光素酶报告系统中检测Nanog启动子的表达变化。
[0025] 图12为NanogPos的肝癌干细胞中干扰SIRT1再过表达SOX2的细胞通过CHIP检测SOX2结合Nanog的表达。
具体实施方式
[0026] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，Shan et al.2012，hepatology，56：1014-1014所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0027] 本发明使用的肝癌干细胞模型由本实验室构建，该模型含有Nanog启动子调控GFP报告基因构建的慢病毒表达载体（Nanog/GFP报告系统），其构建方法参见Shan et al.2012,hepatology，56：1014-1014；Lv-sh-Scramble质粒和Lv-sh-SIRT1质粒、AD-GFP由本实验室构建，具体参见Shan et al.2012，hepatology，56：1014-1014；HEK293细胞由本实验室保存。AD-SIRT1由朱卫国教授惠赠，其构建方法见Liu et al.2011，Proc Natl Acad Sci U S A.108:1925-1930。
[0028] 人原发性肝癌细胞系PLC/PRF/5和肝癌细胞系Huh7购自中国科学院上海细胞所；TM
抗SIRT1抗体购自美国Santa Cruz公司，抗Albumin抗体购自美国Abcam公司。Envision和DAB显色液购自丹麦DAKO公司；pNANOG-Luc和Lv-Over-SOX2质粒购自美国Addgene公司；转染试剂盒购自美国QIGEN公司；SOX2抗体和CHIP级别兔抗人SOX2购自美国Milliopore公司。
抗SIRT1抗体购自美国Santa Cruz公司，抗Albumin抗体购自美国Abcam公司。Envision和DAB显色液购自丹麦DAKO公司；pNANOG-Luc和Lv-Over-SOX2质粒购自美国Addgene公司；转染试剂盒购自美国QIGEN公司；SOX2抗体和CHIP级别兔抗人SOX2购自美国Milliopore公司。
[0029] TV-6（Tenovin-6）溶液的配置：使用DMSO溶解TV-6干粉分别配置成20μM的储存液，待处理细胞时使用完全培养基配置成0.5μM、2.5μM、5.0μM、7.5μM和10μM的工作液。
[0030] 实施例1
[0031] 一、SIRT1的表达影响“干性”转录因子SOX2的表达
[0032] 取人原发性肝癌细胞系PLC/PRF/5、肝癌细胞系Huh7和肝癌细胞T1224，用流式Pos细胞仪分别分选Nanog阳性肝癌干细胞（记为Nanog ）和Nanog阴性非肝癌干细胞（记为Neg
Nanog ）。
Nanog ）。
[0033] 慢病毒Lv-sh-SIRT1和Lv-sh-Scramble的包装：在10cm的培养皿中铺2～5×106个293T细胞（最好是20代之前的，细胞的状态必需良好，生长速度较快，否则对病毒产量影响很大）， 培养液含10%FBS的DMEM（v/v），待细胞汇合至70%时，换新鲜的含10%FBS的DMEM（v/v）培养液，3-4h后用于转染。
[0034] 取15-20μg的Lv-sh-SIRT1或Lv-sh-Scramble慢病毒表达质粒，分别滴加50μL2.5M的CaCl2混匀，向混合液中分别加入无菌水至总体积450μL，混匀后加入500μL2×HBS缓冲液（2×HBS缓冲液使用前于涡旋振荡器上震荡），然后置于涡旋振荡器上震荡10s以上，滴加结束后，继续震荡，室温放置5分钟后，将液体加入培养的293T中，加完后前后左右晃动混匀，加入后6-12小时换新鲜的10%FBS的DMEM（v/v）培养液。
[0035] 慢病毒Lv-sh-SIRT1和Lv-sh-Scramble的收集和纯化：自转染开始后48小时、72小时各收集一次细胞培养液，48小时收集后，再补充15mL的培养液，将收集的病毒在
1000rpm条件下离心10min去除细胞碎片，收集上清，并用0.45μm的滤膜过滤，滤液转移入Millopore的浓缩柱，在5000rpm离心至上层凹槽内的液体体积浓缩至1mL（可分多次加入）。将浓缩液分装，置于-80℃低温冰箱保存。
1000rpm条件下离心10min去除细胞碎片，收集上清，并用0.45μm的滤膜过滤，滤液转移入Millopore的浓缩柱，在5000rpm离心至上层凹槽内的液体体积浓缩至1mL（可分多次加入）。将浓缩液分装，置于-80℃低温冰箱保存。
[0036] 在NanogPos的肝癌干细胞感染Lv-shRNA-SIRT1或Lv-shRNA-Scramble慢病毒：取人原发性肝癌细胞系PLC/PRF/5、肝癌细胞系Huh7和肝癌细胞T1224，通过流式细胞仪Pos
分选Nanog 的肝癌干细胞，然后接种在6孔板内，在37℃、5%CO2培养箱培养，待细胞长至
5
5×10时，吸出孔内液体，加1mL的10%FBS/DMEM（v/v）培养液，然后每孔以10个MOI值，加入Lv-shRNA-SIRT1或Lv-shRNA-Scramble慢病毒，空白对照组不加入慢病毒，再于37℃、
5%CO2培养箱培养，6-8小时后，吸出孔内液体，加2mL的10%FBS/DMEM培养液，72h后，检测Pos
Nanog 细胞中干性转录因子SOX2、Nanog、Oct4和c-Myc的表达情况，检测结果如图1所示。结果显示，干扰SIRT1表达后，SOX2下调的趋势最显著，其次为Nanog和Oct4，而c-Myc下调不明显。
分选Nanog 的肝癌干细胞，然后接种在6孔板内，在37℃、5%CO2培养箱培养，待细胞长至
5
5×10时，吸出孔内液体，加1mL的10%FBS/DMEM（v/v）培养液，然后每孔以10个MOI值，加入Lv-shRNA-SIRT1或Lv-shRNA-Scramble慢病毒，空白对照组不加入慢病毒，再于37℃、
5%CO2培养箱培养，6-8小时后，吸出孔内液体，加2mL的10%FBS/DMEM培养液，72h后，检测Pos
Nanog 细胞中干性转录因子SOX2、Nanog、Oct4和c-Myc的表达情况，检测结果如图1所示。结果显示，干扰SIRT1表达后，SOX2下调的趋势最显著，其次为Nanog和Oct4，而c-Myc下调不明显。
[0037] 按照相同的方法将Lv-shRNA-SIRT1慢病毒感染PLC/PRF/5的NanogPos细胞，分Pos别于感染后0小时、12小时、24小时和36小时收集细胞，检测Nanog 细胞干性转录因子SOX2、Nanog、Oct4和c-Myc的表达情况，结果如图2所示。结果显示，在干扰SIRT1表达
24h时，SOX2蛋白表达显著性地下调；干扰SIRT1表达36h时，c-Myc蛋白的表达显著下调，而Nanog、Oct4蛋白表达随时间变化不明显。
24h时，SOX2蛋白表达显著性地下调；干扰SIRT1表达36h时，c-Myc蛋白的表达显著下调，而Nanog、Oct4蛋白表达随时间变化不明显。
[0038] 将分选的PLC/PRF/5NanogPos和Huh7NanogPos分别种植在6孔板内，待细胞长至80%左右，分别滴加浓度为0.0μM、0.5μM、2.5μM、5.0μM、7.5μM、10μM的TV-6培养48小时后，然后收集蛋白利用western-blot方法检测SOX2和Nanog的表达，同时以GAPDF为内参，检测结果如图3所示。结果显示，在加SIRT1的抑制剂TV-6后，5μM的TV-6作用对肝癌干细 胞中SOX2蛋白的下调显著。
[0039] 将分选的PLC/PRF/5NanogPos种植在6孔板内，待细胞长至80%左右，滴加浓度为5.0μM的TV-6，分别收集滴加后0h、4h、8h、12h、24h和36h的蛋白，western-blot检测SOX2和Nanog的表达，同时以GAPDF为内参，其结果如图4所示。结果显示，5.0μM的TV-6作用4小时后SOX2蛋白的表达量急剧下降，而Nanog蛋白在5.0μM的TV-6作用36小时后表达量才出现下降。
[0040] 上述结果显示，在肝癌干细胞中，干扰SIRT1的表达不但能显著抑制SOX2的表达，而且是早期发生事件。
[0041] 二、检测肝癌细胞系和临床肝癌组织样本中SIRT1和SOX2蛋白表达的相关性[0042] 取6例肝癌细胞系和22例临床肝癌组织样本，通过Western blot检测SIRT1与SOX2的表达量，然后计算Person值，结果如图5所示。结果显示，在6例肝癌细胞系中，SIRT1与SOX2的相关性即Person值为0.708；在22例临床肝癌样本中，其Person值为0.825，表明SIRT1与Sox2具有着正相关性。上述结果表明在肝癌干细胞中，SIRT1可能通过激活SOX2的表达进而维持肝癌干细胞自我更新。
[0043] 实施例2
[0044] 一、在肝癌干细胞中干扰SIRT1同时过SOX2对克隆形成、成球以及成瘤能力的影响
[0045] 为明确在SOX2在SIRT1调控肝癌干细胞自我更新过程中的关键作用，将分选的PosHuh7Nanog 感染慢病毒Lv-sh-SIRT1的同时，转染Lv-Over-SOX2慢病毒（其制备方法与慢病毒Lv-sh-SIRT1相同），在共同作用24h、48h、72h后，检测SIRT1和SOX2蛋白的表达量，然后通过免疫荧光检测共同作用48h后SIRT1和SOX2蛋白的表达情况，结果如图6所示。
由图6可知，在干扰SIRT1同时过表达SOX2共同作用48h时，SOX2的蛋白表达呈增加的趋势。
由图6可知，在干扰SIRT1同时过表达SOX2共同作用48h时，SOX2的蛋白表达呈增加的趋势。
[0046] 然后在Lv-sh-SIRT1慢病毒和Lv-Over-SOX2慢病毒共同作用72h后观察肝癌干细胞的克隆形成能力和成球能力，结果如图7所示。结果显示，与对照组相比，在干扰SIRT1同时过表达SOX2，其克隆形成（p=0.0009）和成球形成呈显著性增加（p=0.0054），具有显著性差异。
[0047] 二、在肝癌干细胞中干扰SIRT1同时过表达SOX2对移植瘤成瘤能力的影响[0048] 在NOD/SCID鼠体内进行皮下分别注射1×106数量的control（只转染慢病毒，不含表达质粒）、shSIRT1（干扰SIRT1）以及shSIRT+SOX2（干扰SIRT1同时过表达SOX2）的6
PLC/PRF/5Nanog阳性肝癌干细胞，每只注射1×10细胞数，分10个点注射，待四周后，处死小鼠，剥 离肿瘤，观察其成瘤情况，然后统计肿瘤的重量和体积，结果如图8所示。结果显示，control组成瘤率为100%（10/10），shSIRT1组成瘤率为60.0%（6/10），shSIRT+SOX2组成瘤率为83%(10/12)；相比shSIRT1组，shSIRT+SOX2组其移植瘤瘤体重量和植移瘤体积呈显著上升。然后将移植瘤用石蜡包埋并切片，经免疫组化染色后用激光共聚焦显微镜观察。具体方法为：将固定的NOD/SCID鼠皮下移植瘤，脱水并用石蜡包埋，H&E染色并连续切片，每张4-5μm厚，用免疫组化玻片裱片，常温放置备用，然后将切片用烤片仪烘烤切片
20min，放入二甲苯中，脱蜡10-20min，再用体积分数为70%-100%梯度酒精水化，蒸馏水漂洗切片3次，每次5min，接着将切片置于由41mL柠檬酸和9mL柠檬酸钠并定容至为500mL的pH为6.0的枸橼酸钠溶液中，在800W条件下微波修复3.30min至溶液沸腾后，再在150W条件下16min维持沸腾状态，修复完毕后至冷水中冷却至室温，蒸馏水漂洗切片3次，每次
5min，然后按50μL/片滴加质量分数3%的H2O2溶液，37℃孵育20min，用双蒸水漂洗5min后，再用PBS漂洗切片2次，每次5min；用滴加1:300（v/v）稀释的兔抗SIRT1抗体，4℃孵TM
育过夜；次日取出用PBS漂洗切片3次，每次5min，然后按50μL/片滴加EnVision 二抗，
37℃孵育30min，PBS漂洗切片3次，每次5min，漂洗后滴加DAB显色液，自来水终止反应，接着用苏木素衬染45s，盐酸酒精分化，自来水冲洗、蓝化，最后用体积分数70%-100%梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，结果如图9所示。结果显示，相比shSIRT1组，过表达SOX2组的GFP表达呈显著性增强，免疫组织化学方法同样表明在移植瘤中过表达SOX2能增加SOX2的表达。以上结果显示，不管在体内或体外，过表达SOX2不但能恢复干扰SIRT1后对肝癌干细胞的克隆形成、成球能力，而且也能增加成瘤能力。因此，干细胞转录因子SOX2在SIRT1维持肝癌干细胞自我更新的作用中发挥着关键的作用。
PLC/PRF/5Nanog阳性肝癌干细胞，每只注射1×10细胞数，分10个点注射，待四周后，处死小鼠，剥 离肿瘤，观察其成瘤情况，然后统计肿瘤的重量和体积，结果如图8所示。结果显示，control组成瘤率为100%（10/10），shSIRT1组成瘤率为60.0%（6/10），shSIRT+SOX2组成瘤率为83%(10/12)；相比shSIRT1组，shSIRT+SOX2组其移植瘤瘤体重量和植移瘤体积呈显著上升。然后将移植瘤用石蜡包埋并切片，经免疫组化染色后用激光共聚焦显微镜观察。具体方法为：将固定的NOD/SCID鼠皮下移植瘤，脱水并用石蜡包埋，H&E染色并连续切片，每张4-5μm厚，用免疫组化玻片裱片，常温放置备用，然后将切片用烤片仪烘烤切片
20min，放入二甲苯中，脱蜡10-20min，再用体积分数为70%-100%梯度酒精水化，蒸馏水漂洗切片3次，每次5min，接着将切片置于由41mL柠檬酸和9mL柠檬酸钠并定容至为500mL的pH为6.0的枸橼酸钠溶液中，在800W条件下微波修复3.30min至溶液沸腾后，再在150W条件下16min维持沸腾状态，修复完毕后至冷水中冷却至室温，蒸馏水漂洗切片3次，每次
5min，然后按50μL/片滴加质量分数3%的H2O2溶液，37℃孵育20min，用双蒸水漂洗5min后，再用PBS漂洗切片2次，每次5min；用滴加1:300（v/v）稀释的兔抗SIRT1抗体，4℃孵TM
育过夜；次日取出用PBS漂洗切片3次，每次5min，然后按50μL/片滴加EnVision 二抗，
37℃孵育30min，PBS漂洗切片3次，每次5min，漂洗后滴加DAB显色液，自来水终止反应，接着用苏木素衬染45s，盐酸酒精分化，自来水冲洗、蓝化，最后用体积分数70%-100%梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，结果如图9所示。结果显示，相比shSIRT1组，过表达SOX2组的GFP表达呈显著性增强，免疫组织化学方法同样表明在移植瘤中过表达SOX2能增加SOX2的表达。以上结果显示，不管在体内或体外，过表达SOX2不但能恢复干扰SIRT1后对肝癌干细胞的克隆形成、成球能力，而且也能增加成瘤能力。因此，干细胞转录因子SOX2在SIRT1维持肝癌干细胞自我更新的作用中发挥着关键的作用。
[0049] 实施例3
[0050] 一、在肝癌干细胞和移植瘤中干扰SIRT1同时过表达SOX2影响Nanog的表达[0051] 在实施例1的研究发现，干扰SIRT1不仅能下调SOX2的表达，而且也能下调Nanog的表达。为了进一步研究SIRT1在维持肝癌干细胞自我更新过程中Nanog所起的作用，首先在肝癌干细胞中检测干扰SIRT1过表达SOX2后能否恢复Nanog表达，具体为，control（只转染慢病毒，不含表达质粒）、shSIRT1（干扰SIRT1）以及shSIRT+SOX2（干扰SIRT1同Pos时过表达SOX2）的PLC/PRF/5Nanog和Huh7Nanog 阳性肝癌干细胞中转染，以GAPD为内参，结果如图10中A所示。结果显示，在干扰SIRT1同时过表达SOX2能显著促进GFP的表达上调。将干扰SIRT1同时过表达SOX2的肝癌干细胞移植至NOD/SCID小鼠皮下，每只注
6
射1×10细胞数，分10个点注射，待四周后，处死小鼠，然后检测移植瘤中GFP的表达量，并以GAPD为内参，结构如图10中B所示。结果显示，在干扰SIRT1同时过表达SOX2的NOD/SCID小鼠移植瘤组织中检测也证实了体外的结果，即促进了Nanog或GFP的表达。这些结果表明了，在肝癌干细胞中，Nanog在SIRT1维持肝癌干细胞自我更新作用中同样占有重要地位。
6
射1×10细胞数，分10个点注射，待四周后，处死小鼠，然后检测移植瘤中GFP的表达量，并以GAPD为内参，结构如图10中B所示。结果显示，在干扰SIRT1同时过表达SOX2的NOD/SCID小鼠移植瘤组织中检测也证实了体外的结果，即促进了Nanog或GFP的表达。这些结果表明了，在肝癌干细胞中，Nanog在SIRT1维持肝癌干细胞自我更新作用中同样占有重要地位。
[0052] 二、在肝癌干细胞，干扰SIRT1同时过表达SOX2影响Nanog启动子活性[0053] 多能转录因子Oct4，SOX2和Nanog是调节与干细胞有关的一系列基因表达的重要转录因子。为了进一步研究Nanog在SIRT1维持肝癌干细胞自我更新的作用，将流式细Pos胞仪分选的Nanog 细胞种植在6孔板内，待细胞长至60%左右，分别感染Lv-shRNA-SIRT1和Lv-Over-SOX2，然后在37℃、5%CO2的培养箱继续培养36h，消化、离心细胞，并种植在
24孔板培养，第二天转染。转染方法为依次向细胞中加入加入PBS，荧光素酶报告基因载体pGL31.0μg，内参质粒Renillia0.5μg，共计50μL，然后于37℃、5%CO2培养箱中继续培养，转染48h后使用Dual-luciferase报告基因检测系统（购自美国Promega公司）检测报告基因活性和检测Nanog启动子活性，检测方法参见说明书进行，检测结果如图11所示。结果显示，在干扰SIRT1同时过表达SOX2的情况下，荧光素酶活性增强，表明Nanog启动子活性增强。然后设计Nanog引物，利用染色质免疫共沉淀（ChIP）技术检测（试剂盒美国Promega公司）SOX2结合到Nanog启动子区的能力，检测方法按试剂盒说明书进行，引物的具体序列为：Nanog1：上游引物：gggatagacaagaaaccaaac（SEQ ID NO.1）；下游引物：caactagctccattttcctc（SEQ ID NO.2）；Nanog2：上游引物：cggcctcccaatttactg（SEQ ID NO.3）；下游引物：tctaggttcaccacgtttc（SEQ ID NO.4）；Nanog3：上游引物：
tggaaacgtggtgaacctag（SEQ ID NO.5）；下游引物：agtctcaccaaggccattg（SEQ ID NO.6）[0054] 然后进行结果分析，
24孔板培养，第二天转染。转染方法为依次向细胞中加入加入PBS，荧光素酶报告基因载体pGL31.0μg，内参质粒Renillia0.5μg，共计50μL，然后于37℃、5%CO2培养箱中继续培养，转染48h后使用Dual-luciferase报告基因检测系统（购自美国Promega公司）检测报告基因活性和检测Nanog启动子活性，检测方法参见说明书进行，检测结果如图11所示。结果显示，在干扰SIRT1同时过表达SOX2的情况下，荧光素酶活性增强，表明Nanog启动子活性增强。然后设计Nanog引物，利用染色质免疫共沉淀（ChIP）技术检测（试剂盒美国Promega公司）SOX2结合到Nanog启动子区的能力，检测方法按试剂盒说明书进行，引物的具体序列为：Nanog1：上游引物：gggatagacaagaaaccaaac（SEQ ID NO.1）；下游引物：caactagctccattttcctc（SEQ ID NO.2）；Nanog2：上游引物：cggcctcccaatttactg（SEQ ID NO.3）；下游引物：tctaggttcaccacgtttc（SEQ ID NO.4）；Nanog3：上游引物：
tggaaacgtggtgaacctag（SEQ ID NO.5）；下游引物：agtctcaccaaggccattg（SEQ ID NO.6）[0054] 然后进行结果分析，
[0055] （1）首先标准化DNA的量（Normalize DNA）
[0056] △Ct[normalized CHIP]=Ct[ChIP]-(Ct[Input]-Lg(2×Input Diluttion Factor))[0057] Input Dilution Factor=(fraction of the input control chromation -1saved)
[0058] （2）计算ChIP样品中的DNA片段占Input Control中的百分比%
[0059] Input=2（-△Ct[normalized CHIP]）
[0060] 分析结果如图12所示。结果显示，干扰SIRT1的表达能够降低SOX2结合到Nanog启动子区的能力；相应地过表达SOX2后可显著增强SOX2结合到Nanog启动子区的能力。
[0061] 以上结果表明，在肝癌干细胞中，SIRT1通过维持SOX2表达从而增强其对Nanog的转 录调控，进而维持肝癌干细胞自我更新的特性。但是，SIRT1在肝癌干细胞中如何调节SOX2的表达及其分子机制仍不清楚。
[0062] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。