一种利用RNA干扰技术防治中华蜜蜂囊状幼虫病的方法

摘要

本发明涉及一种RNA干扰技术防治中华蜜蜂囊状幼虫病的方法，它是利用中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)特异的、与病毒复制有关的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因，通过细菌原核诱导表达的方法合成dsRdRp，将该双链RNA添加到饲料中饲喂给1-2日龄幼虫。本发明的双链RNA是用大肠杆菌诱导表达的，成本低，并且对中华蜜蜂囊状幼虫病的防治具有良好的治愈效果。饲喂浓度为0.5μg/ml dsRdRp，幼虫化蛹率和羽化率分别为70%、55%；比饲喂dsGFP的化蛹率（10%）和羽化率（0%）显著高。

权利要求

1.一种利用RNA干扰技术防治中华蜜蜂囊状幼虫病的饲料添加剂的制备方法，其特征在于：其步骤包括以下：（1）收集患中华蜜蜂囊状幼虫病的幼虫或蛹放置-80℃冰箱保存；

（2）中华蜜蜂囊状幼虫病毒复制基因-RNA依赖的RNA聚合酶基因的扩增：采用Trizol法提取患病幼虫的总RNA，用RdRp基因的下游引物进行反转录合成cDNA，PCR扩增目的基因片段，将该基因片段连接到PMD18-T载体，挑取含有该基因片段的单菌落送至华大基因公司进行序列测定；

（3）dsRdRp原核表达载体的构建，将（2）中扩增的目的片段，在T4连接酶的作用下连接至L4440载体，16℃连接过夜；将T4酶连接产物转入HT115感受态细胞中，涂布于含有100 μg/mL氨苄抗生素的LB固体培养基上；

（4）dsRdRp的诱导表达：将（3）中阳性克隆接种于LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD595 = 0.5-0.6，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，即IPTG进行诱导，处理后37℃继续震荡培养4 h，收集菌液，采用CTAB法提取dsRdRp；

所述的LB固体培养基配方为：胰蛋白胨，10 g；酵母提取物5 g；氯化钠，10 g；琼脂，15 g；用去离子水定容至1 L，121℃蒸汽灭菌20 min；所述LB液体培养基配方为：胰蛋白胨，

10 g；酵母提取物5 g；氯化钠，10 g；用去离子水定容至1 L，121℃蒸汽灭菌20 min。

说明书

一种利用RNA干扰技术防治中华蜜蜂囊状幼虫病的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种RNA干扰技术防治中华蜜蜂囊状幼虫病的方法，属于昆虫病害防治领域。

背景技术

[0002] 中华蜜蜂（Apis cerana cerana, 简称中蜂），是我国土生土长的蜂种。蜜蜂很容易受到各种病害的威胁，病原物包括有病毒、细菌、真菌和原生动物等。目前，在蜜蜂中已发现的病毒病至少有22种。其中，囊状幼虫病是危害较严重的一种病毒病。中华蜜蜂囊状幼虫病最早是1972年在广东省发现的，之后迅速蔓延全国。中华蜜蜂囊状幼虫病毒感染蜜蜂幼虫后，使其不能化蛹，大量的液体和病毒粒子聚集于病虫体内，且虫体颜色由珍珠白色逐渐变为浅黄色，在死亡之后，蜜蜂虫体会逐渐变得干枯，形成一个暗褐色如龙船状的鳞片，该病害对中华蜜蜂构成了严重的威胁，往往会造成蜂群、甚至整个蜂场的蜜蜂死亡。

[0003] 目前，尚无治愈蜜蜂囊状病的方法和特效药物，主要以预防为主。主要通过选育抗病品种、适时换王、加强饲养管理和一些中草药来综合防治该病毒病。化学药物治疗造成蜂产品药物残留的食品安全问题，中草药治疗治标而不治本。RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。由于其特异性和有效性，已被认为是一种重要的特异性基因阻断技术，目前RNAi已成为疾病防治和药物筛选的重要研究手段。本发明利用中华蜜蜂囊状幼虫病毒自身复制基因合成双链RNA，采用RNA干扰方法来防治中华蜜蜂囊状幼虫病。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种RNA干扰技术防治中华蜜蜂囊状幼虫病的方法，本发明的双链RNA是用大肠杆菌诱导表达的，成本低，并且对中华蜜蜂囊状幼虫病的防治具有良好的治愈效果。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0006] 一种利用RNA干扰技术防治中华蜜蜂囊状幼虫病的方法，其步骤包括以下：

[0007] （1）收集患中华蜜蜂囊状幼虫病的幼虫或蛹放置-80℃冰箱保存；

[0008] （2）中华蜜蜂囊状幼虫病毒复制基因-RNA依赖的RNA聚合酶基因的扩增：采用Trizol法提取患病幼虫的总RNA，用RdRp基因的下游引物进行反转录合成cDNA，PCR扩增目的基因片段，将该基因片段连接到PMD18-T载体，挑取含有该基因片段的单菌落送至华大基因公司进行序列测定；

[0009] （3）dsRdRp原核表达载体的构建，将（2）中扩增的目的片段，在T4连接酶的作用下连接至L4440载体，16℃连接过夜；将T4酶连接产物转入HT115感受态细胞中，涂布于含有100 μg/mL氨苄抗生素的LB固体培养基上；

[0010] （4）dsRdRp的诱导表达：将（3）中阳性克隆接种于LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD595 = 0.5-0.6，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，即IPTG进行诱导，处理后37℃继续震荡培养4 h，收集菌液，采用CTAB法提取dsRdRp；

[0011] （5）dsRdRp的大量表达并添加懂到饲料中饲喂给蜜蜂幼虫。

[0012] 所述的LB固体培养基配方为：胰蛋白胨，10 g；酵母提取物5 g；氯化钠，10 g；琼脂，15 g；用去离子水定容至1 L，121℃蒸汽灭菌20 min；所述LB液体培养基配方为：胰蛋白胨，10 g；酵母提取物5 g；氯化钠，10 g；用去离子水定容至1 L，121℃蒸汽灭菌20 min。

[0013] 本发明的优点在于：用RNA干扰方法对中华蜜蜂囊状幼虫病进行防治，该方法采用细菌原核表达dsRNA，成本低，且选用的基因片段RdRp是病毒复制的基因，沉默该基因的表达，抑制中华蜜蜂囊状幼虫病毒的复制，特异性强。

附图说明

[0014] 图1 RNA依赖的RNA聚合酶基因PCR的扩增。

[0015] 图2 dsRdRp的原核表达结果。

[0016] 图3中华蜜蜂幼虫的化蛹率和羽化率。其中dsGFP为对照组；dsRdRp（0.5）为0.5 μg/ml的dsRdRp；dsRdRp（0.2）为0.2 μg/ml的dsRdRp；dsRdRp（0.8）为0.8 μg/ml的dsRdRp。

具体实施方式

[0017] 实施例1

[0018] 收集患中华蜜蜂囊状幼虫病的幼虫或蛹放置-80℃冰箱保存。

[0019] 中华蜜蜂囊状幼虫病毒（Chinese Sacbrood virus, CSBV）复制基因—RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因的扩增。采用Trizol法提取患病幼虫的总RNA，用RdRp基因的下游引物进行反转录合成cDNA，PCR扩增目的基因片段。将该基因片段连接到PMD18-T载体，阳性克隆送至华大基因公司测序。

[0020] dsRdRp原核表达载体的构建。将（2）中扩增的目的片段，在T4连接酶的作用下连接至L4440载体，16℃连接过夜；将T4酶连接产物转入HT115感受态细胞中，涂布于含有100 μg/mL氨苄抗生素的LB固体培养基上。

[0021] dsRdRp的诱导表达。将（3）中阳性克隆接种于液体LB培养基中，37℃震荡培养至OD595 = 0.5-0.6，分别加入0. 4 mM和0. 8 mM IPTG进行诱导，处理后37℃继续震荡培养4 h。收集菌液，采用CTAB法提取dsRNA。0. 8 mM IPTG成功诱导dsRdRp。

[0022] dsRdRp的大量表达并添加懂到饲料中饲喂给蜜蜂幼虫。dsRdRp的终浓度分别为0.2 μg/ml、0.5 μg/ml和0.8 μg/ml进行饲喂，并且以dsGFP做对照。

[0023] 给1-2日龄中华蜜蜂幼虫饲喂含有dsRNA的饲料，第二天给幼虫饲喂含有中华蜜蜂囊状幼虫病毒的饲料，之后3-4天饲喂含有dsRNA的饲料至幼虫预蛹期，统计不同处理组蜜蜂幼虫的化蛹率和羽化率。

[0024] 饲喂浓度为0.5 μg/ml的dsRdRp，幼虫化蛹率和羽化率分别为70%、55%；比饲喂dsGFP的化蛹率（10%）和羽化率（0%）显著高（见图3）。

[0025] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。