一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤药物

摘要

本发明属于药物化学技术领域，公开了一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤药物。该油茶皂苷化合物具有式I所示结构。该油茶皂苷化合物对肝癌细胞、乳腺癌细胞、黑素瘤细胞、肺癌细胞具有一定的抑制作用，且能够有效抑制肝肿瘤的生长，说明该油茶皂苷化合物具有显著的抗肿瘤活性，能够应用于制备抗肿瘤药物。

权利要求

1.一种具有式(I)结构的油茶皂苷化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：

取油茶根粉碎后，经提取，得提取液；

取所述提取液经浓缩，得流浸膏；

取所述流浸膏与水混合，过滤，收集滤液；

取所述滤液经大孔树脂分离，以乙醇-水混合液洗脱，收集体积比为70:30～95:5的乙醇-水混合液洗脱组分，得所述油茶总皂苷提取物；

步骤2：

取所述油茶总皂苷提取物，经减压硅胶色谱柱分离，以氯仿-甲醇混合液洗脱，收集体积比为80:20～60:40的氯仿-甲醇混合液洗脱组分，得第一次纯化物；

取所述第一次纯化物经中压反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱分离，以甲醇-水混合液洗脱，收集体积比为70:30～90:10的甲醇-水混合液洗脱组分，得第二次纯化物；

取所述第二次纯化物经动态轴向压缩色谱柱分离，以甲醇-水混合液洗脱，收集体积比为75:25的甲醇-水混合液洗脱组分，得第三次纯化物；

取所述第三次纯化物经半制备高效液相色谱柱分离，以甲醇-水-甲酸混合液洗脱，流速2mL/min，收集保留时间为46.5min所对应的洗脱组分，即得具有式(I)结构的油茶皂苷化合物；

所述甲醇-水-甲酸混合液为：甲醇和水按体积比为78:22组成的混合溶液再与占所述混合溶液质量百分含量为0.2％的甲酸混合所得的混合液；

说明书

一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤

药物

技术领域

[0001] 本发明属于药物化学技术领域，特别涉及一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤药物。

背景技术

[0002] 油茶(Camellia oleifera Abel)，又称为茶子树、茶油树、白花茶，系山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia Linn)常绿小乔木，主要分布于热带及亚热带地区。在我国，油茶产于西南部和东南部地区，遍布17个省区。油茶是重要的木本食用油料树种，与油橄榄、油棕、椰子并称“世界四大木本油料树种”。用油茶的种子榨油即获得茶油，茶油的不饱和脂肪酸含量高达90%，其含量远远高于菜油、花生油和豆油；与橄榄油相比，其维生素E的含量高一倍，具有极高的营养价值。油茶还具有较高的药用价值，《本草纲目》中记载，茶籽，苦寒香毒(皂素)，主治喘急咳嗽，去疾垢；《中华本草》也有记载，油茶的根及其根皮具有清热解毒、理气止痛、活血消肿的功效，主治咽喉肿痛、胃痛、牙痛、跌打伤痛和水火烫伤。

[0003] 油茶药用部位主要有茶子心、茶油、油茶根、油茶根皮和油茶叶。从油茶中分离得到的化学成分包括皂苷类、黄酮类、鞣质类、芳香苷类和生物碱类。油茶皂苷又称为油茶皂素，是从油茶籽饼粕中提取出的一种皂类，主要存在于油茶种子、油茶叶、油茶根和油茶根皮中，现多用于日用化工、农药、医药、水产、建材等诸多领域。研究还发现，油茶皂苷具有山茶属植物皂苷的一般通性，味苦、辛辣、发泡特性强；也具有多种良好的生物活性，表现在许多方面，具有溶血作用、鱼毒作用、杀菌抗菌活性、抗炎、抗高血压、抗肿瘤、保护心血管系统、杀虫驱虫、促进植物生长等作用。油茶皂苷多为齐墩果烷型的五环三萜类皂苷，包括苷元、糖、有机酸三部分，但其苷元结构复杂、糖部分种类多和组合方式不同造成了油茶皂苷类化合物众多，对油茶皂苷的进一步纯化和分离提出了挑战。所以，目前尽管研究发现油茶总皂苷提取物具有抗肿瘤的活性，但是具体是其中哪个单体皂苷发挥的作用，还是未知的，需要对其进行深入的研究。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤药物。该油茶皂苷化合物具有显著的抗肿瘤活性，可以应用于制备抗肿瘤药物。

[0005] 为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种油茶皂苷化合物，其具有式I所示结构：

[0007]

[0008] 本发明还提供了一种油茶皂苷化合物的制备方法，包括以下步骤：

[0009] 步骤1：获得油茶总皂苷提取物；

[0010] 步骤2：取步骤1所得油茶总皂苷提取物，经分离纯化，即得。

[0011] 优选地，本发明提供的制备方法中，步骤1具体为：

[0012] 取油茶根粉碎后，经提取，得提取液；

[0013] 取所得提取液经浓缩，得流浸膏；

[0014] 取所得流浸膏与水混合，过滤，收集滤液；

[0015] 取所得滤液经大孔树脂分离，以乙醇-水混合液洗脱，收集体积比为70:30～95:5的乙醇-水混合液洗脱组分，得油茶总皂苷提取物。

[0016] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤1中提取所用的溶液为乙醇-水混合液。

[0017] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤1中提取所用的乙醇-水混合液中，乙醇的体积百分含量为30%～95%。

[0018] 在本发明的另外一些实施例中，以g/mL计，本发明提供的制备方法步骤1中粉碎的油茶根与提取所用溶液的质量体积比为1:5～20。

[0019] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤1中提取之前还包括浸渍过程，具体为取步骤1中粉碎的油茶根与提取所用的溶液混合，于30℃～50℃条件下浸泡6h～12h。

[0020] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤1中浸渍、提取具体为：

[0021] 取步骤1中粉碎的油茶根与乙醇-水混合溶液混合，于30℃～50℃条件下浸泡6h～12h，经加热回流，过滤，收集滤液，得提取液。

[0022] 本发明提供的制备方法步骤1中的提取，可以通过一次加热回流进行提取，过滤，收集滤液，得提取液；也可以通过2～3次加热回流进行提取，分别收集每次加热回流所得提取液，合并每次加热回流所得的提取液，过滤，收集滤液，得提取液。

[0023] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤1中流浸膏与水的质量比为1:5～20。

[0024] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤1具体为：

[0025] 取油茶根粉碎；以g/mL计，取粉碎的油茶根与乙醇-水混合溶液按质量体积比1:5～20混合，于30℃～50℃条件下浸泡6h～12h，经加热回流1次～3次后，合并每次加热回流所得的提取液，过滤，收集滤液，得提取液。取所得提取液经浓缩，得流浸膏。取所得流浸膏与水按质量比1:5～20混合，100目～300目过滤，收集滤液；将所得滤液离心后，取上清液经D101型大孔树脂分离，依次用水、乙醇体积百分含量为30%～60%的乙醇-水混合液、乙醇体积百分含量为70%～95%的乙醇-水混合液进行洗脱，收集乙醇体积百分含量为70%～95%乙醇-水混合液洗脱组分，得油茶总皂苷提取物。

[0026] 优选地，本发明提供的制备方法中，步骤2具体为：

[0027] 取步骤1所得油茶总皂苷提取物，经减压硅胶色谱柱分离，以氯仿-甲醇混合液洗脱，收集体积比为80:20～60:40的氯仿-甲醇混合液洗脱组分，得第一次纯化物；

[0028] 取所得第一次纯化物经中压反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱分离，以甲醇-水混合液洗脱，收集体积比为70:30～90:10的甲醇-水混合液洗脱组分，得第二次纯化物；

[0029] 取所得第二次纯化物经动态轴向压缩色谱柱分离，以甲醇-水混合液洗脱，收集体积比为75:25的甲醇-水混合液洗脱组分，得第三次纯化物；

[0030] 取所得第三次纯化物经半制备高效液相色谱柱分离，以甲醇-水-甲酸混合液洗脱，流速2mL/min，收集保留时间为46.5min所对应的洗脱组分，即得；

[0031] 该半制备高效液相色谱柱为十八烷基硅烷半制备色谱柱，其型号为250mm×10mm，5μm；

[0032] 甲醇-水-甲酸混合液为：甲醇和水按体积比为78:22组成的混合溶液再与占所得混合溶液质量百分含量为0.2%的甲酸混合所得的混合液。

[0033] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中所用到的减压硅胶色谱柱中的硅胶的粒径为60目～100目。

[0034] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中减压硅胶色谱分离时，氯仿-甲醇混合洗脱为梯度洗脱，洗脱梯度具体为：氯仿和甲醇的体积比为90:10→80:20→70:30→60:40→50:50→40:60→30:70→20:80。

[0035] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中所用到的中压反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的流速为25mL/min。

[0036] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中中压反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱分离时，甲醇-水混合液洗脱为梯度洗脱，洗脱梯度具体为：甲醇和水的体积比为50:50→60:40→70:30→80:20→90:10→100:0。

[0037] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中所用到的动态轴向压缩色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。

[0038] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中动态轴向压缩色谱柱分离时，甲醇-水混合液洗脱为梯度洗脱，洗脱梯度具体为：60:40→75:25→80:20→90:10。

[0039] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中所用到的动态轴向压缩色谱柱的流速为150mL/min。

[0040] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中所用到的半制备高效液相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶半制备高效液相色谱柱。

[0041] 优选地，本发明提供的制备方法步骤2半制备高效液相色谱柱分离后还包括蒸馏，干燥步骤，具体为：取半制备高效液相色谱柱分离所得洗脱组分进行蒸馏，干燥，即得。

[0042] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中步骤2具体为：

[0043] 取步骤1所得油茶总皂苷提取物，经减压硅胶柱，以氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱，洗脱梯度为氯仿和甲醇的体积比为90:10→80:20→70:30→60:40→50:50→40:60→30:70→20:80，分别收集，合并体积比为80:20，70:30和60:40的氯仿-甲醇混合液洗脱组分，得第一次纯化物；

[0044] 取所得第一次纯化物经中压反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱分离，以甲醇-水系统进行梯度洗脱，洗脱梯度为甲醇和水的体积比为50:50→60:40→70:30→80:20→90:10→100:0，流速25mL/min，分别收集，合并体积比为70:30，80:20，90:10的甲醇-水混合液洗脱组分，得第二次纯化物；

[0045] 取所得第二次纯化物经动态轴向压缩色谱柱分离，以不同体积比的甲醇-水混合液进行梯度洗脱，洗脱梯度为甲醇和水的体积比为60:40→75:25→80:20→90:10，流速为150mL/min，收集体积比为75:25的甲醇-水混合液洗脱组分，得第三次纯化物；

[0046] 取所得第三次纯化物经十八烷基硅烷键合硅胶半制备高效液相色谱柱分离，以甲醇-水-甲酸混合液洗脱，流速2mL/min，收集保留时间为46.5min所对应的洗脱组分，将所得洗脱组分进行蒸馏、干燥，得白色不定形粉末状物质，即得；

[0047] 其中，甲醇-水-甲酸混合液为：甲醇和水按体积比为78:22组成的混合溶液再与占所得混合溶液质量百分含量为0.2%的甲酸混合所得的混合液。

[0048] 本发明还提供了一种油茶皂苷化合物，该油茶皂苷化合物的制备方法包括以下步骤：

[0049] 步骤1：获得油茶总皂苷提取物；

[0050] 步骤2：取步骤1所得油茶总皂苷提取物，经分离纯化，即得。

[0051] 本发明还提供了一种油茶皂苷化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，该油茶皂苷化合物具有式I所示结构，

[0052]

[0053] 该油茶皂苷化合物的制备方法包括以下步骤：

[0054] 步骤1：获得油茶总皂苷提取物；

[0055] 步骤2：取步骤1所得油茶总皂苷提取物，经分离纯化，即得。

[0056] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的应用所针对的肿瘤为肝肿瘤、黑素瘤、乳腺肿瘤或肺肿瘤。

[0057] 本发明还提供了一种抗肿瘤药物，其包括本发明提供的油茶皂苷化合物和药学上可接受的辅料，该油茶皂苷化合物具有式I所示结构，

[0058]

[0059] 该油茶皂苷化合物的制备方法包括以下步骤：

[0060] 步骤1：获得油茶总皂苷提取物；

[0061] 步骤2：取步骤1所得油茶总皂苷提取物，经分离纯化，即得。

[0062] 优选地，本发明提供的一种抗肿瘤药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、乳剂或混悬剂。

[0063] 本发明提供了一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤药物。该油茶皂苷化合物具有式I所示结构。体外细胞实验结果证实该油茶皂苷化合物对肝癌细胞、乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞、肺癌细胞具有一定的抑制作用；体内实验结果证实该油茶皂苷化合物对肝肿瘤具有显著的抑制作用，可以有效抑制肝肿瘤的生长，说明该油茶皂苷化合物具有显著的抗肿瘤活性，可以应用于制备抗肿瘤药物，

[0064]

附图说明

[0065] 图1示实施例1制得的油茶皂苷化合物的高分辨质谱谱图；

[0066] 图2示实施例1制得的油茶皂苷化合物的核磁共振氢谱图；

[0067] 图3示实施例1制得的油茶皂苷化合物的核磁共振氢谱图局部放大图；

[0068] 图4示实施例1制得的油茶皂苷化合物的核磁共振氢谱图局部放大图；

[0069] 图5示实施例1制得的油茶皂苷化合物的核磁共振碳谱图；

[0070] 图6示实施例1制得的油茶皂苷化合物的核磁共振碳谱图局部放大图；

[0071] 图7示实施例1制得的油茶皂苷化合物的核磁共振碳谱图局部放大图；

[0072] 图8示实施例1制得的油茶皂苷化合物的DEPT谱图；

[0073] 图9示实施例1制得的油茶皂苷化合物的DEPT谱图局部放大图；

[0074] 图10示实施例1制得的油茶皂苷化合物的DEPT谱图局部放大图；

[0075] 图11示实施例1制得的油茶皂苷化合物的HSQC谱图；

[0076] 图12示实施例1制得的油茶皂苷化合物的HMBC谱图；

[0077] 图13示实施例1制得的油茶皂苷化合物的H-H COSY谱图；

[0078] 图14示实施例1制得的油茶皂苷化合物的NOESY谱图。

具体实施方式

[0079] 本发明公开了一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤药物。本领域技术人员可以参考本文内容，获得该油茶皂苷化合物，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法及应用已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0080] 本发明提供的一种油茶皂苷化合物、其制备方法、应用及其制备的抗肿瘤药物中所用到的试剂和原料均可由市场购得。本发明实施例中所用到的某些仪器的型号和生产厂家如下：

[0081] 化学试剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；旋光仪241PerkinElmer Inc.,Waltham,MA,美国；旋转蒸发仪：东京理化器械独资工厂；薄层色谱硅胶板：HSGF254，烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂出品；各种柱色谱用硅胶均为青岛海洋化工厂出品；核磁共振仪500Hz:Varian Inc.,Palo Alto,CA,美国；高分辨质谱Q-TOF2:Micromass公司，英国；半制备高效液相色谱仪：LC-20AT，SPD-20A，日本岛津公司；中压反相十八烷基硅烷制备液相色谱：Büchi色谱系统，C-650泵，中压柱(460mm×26mm i.d.,Büchi Corp.,Flawil,Swiss);动态轴向柱色谱：NP7000泵(Newstyle),NU3000UV-VIS检测器(Newstyle)和十八烷基硅烷柱(650mm×100mm,30μm,1500g;Newstyle)；十八烷基硅烷半制备色谱柱（C18半制备色谱柱）:250mm×10mm，5μm，美国Kromsil公司。

[0082] 为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0083] 实施例1具有式I所示结构的油茶皂苷化合物的制备

[0084] 提取：

[0085] 取干燥的油茶根（2011年11月采自湖北蕲春）2000g，用粉碎机粉碎成木屑，加入18L体积百分比为70%的乙醇水溶液，40℃条件下浸泡12h后,加热至回流，提取3.0h，收集提取液，将提取液过滤，减压浓缩，得流浸膏598g。

[0086] 大孔树脂富集：

[0087] 取提取步骤所得的流浸膏，加入6.0L水，搅拌溶解，用100目滤布过滤，将滤液12000r/min离心10min，离心后，得6.1L上清液，取上清液经D101型大孔树脂进一步分离，依次用10L水、15L30%乙醇水溶液、15L70%乙醇水溶液进行洗脱，收集70%乙醇水溶液洗脱组分，减压浓缩，经检测，所得浓缩液中含有油茶皂苷类化合物，烘箱100℃,48h干燥,得褐色固体物63g,即为油茶总皂苷提取物。

[0088] 第一次纯化物的制备：

[0089] 取大孔树脂富集所得的油茶总皂苷提取物，经减压硅胶柱（硅胶：60-100目）分离，以氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱，洗脱梯度为氯仿和甲醇的体积比为90:10→80:20→70:30→60:40→50:50→40:60→30:70→20:80，每个梯度1000mL；分别收集每个洗脱组分，并一一标号。将所得洗脱液进行薄层板分析：薄层色谱硅胶板，BAW系统，Rf值=0.4～0.7。经检测，以下洗脱组分含有的成分相似：80:20的氯仿-甲醇溶液洗脱组分，70:30的氯仿-甲醇溶液洗脱组分，60:40的氯仿-甲醇溶液洗脱组分。合并80:20的氯仿-甲醇溶液洗脱组分，70:30的氯仿-甲醇溶液洗脱组分和60:40的氯仿-甲醇溶液洗脱组分，减压蒸干，即得第一次纯化物10.3g。

[0090] 第二次纯化物的制备：

[0091] 取所得第一次纯化物，经中压反相十八烷基硅烷制备液相色谱进行分离，以甲醇-水系统进行梯度洗脱，洗脱梯度为甲醇和水的体积比为50:50→60:40→70:30→80:20→90:10→100:0，每个梯度1000mL，流速25mL/min，检测波长203nm。分段收集洗脱组分，得六个洗脱组分，一一标记。取洗脱梯度为60:40，70:30，80:20，90:10所对应的洗脱组分进行高效分析液相色谱分析，结果表明，洗脱梯度70:30，80:20，90:10所对应的洗脱组分中含有的成分相似（高效分析液相色谱时间为30min，检测峰位于20min-28min之间），合并洗脱梯度所对应的洗脱组分，减压浓缩，即得第二次纯化物20mL。

[0092] 第三次纯化物的制备：

[0093] 取第二次纯化物，经动态轴向柱色谱进行分离(流速150mL/min，检测波长203nm)，以体积百分比计，依次用60%、75%、80%和90%甲醇水溶液进行洗脱，每个梯度
3000mL，分别收集，得四个洗脱组分，一一标记。将所得洗脱组分分别经高效分析液相色谱分析（检测峰位于13.5min-15.0min之间），收集75%洗脱组分（即体积比为75:25的甲醇-水混合液洗脱组分，高效液相检测峰位于14.5min），减压浓缩，即得第三次纯化物
15mL。

[0094] 白色不定形粉末状物质的制备：

[0095] 取第三次纯化物，经C18半制备色谱柱（250mm×10mm，5μm）进行分离（流速2mL/min，检测波长203nm），以甲醇-水-甲酸混合液（甲醇和水按体积比为78:22组成的混合溶液再与占所得混合溶液质量百分含量为0.2%的甲酸混合所得的混合液）进行洗脱，收集46.5min处色谱峰，将所得洗脱组分进行蒸馏、干燥，得68mg白色不定形粉末状物质。

[0096] 化合物结构鉴定：

[0097] 将所得白色不定形粉末状物质进行薄层层析、醋酐-浓硫酸反应、Molish反应鉴定，鉴定结果为：薄层层析硫酸乙醇显色结果为紫红色斑点，醋酐-浓硫酸反应阳性，Molish反应阳性，提示该物质可能为皂苷类化合物。该白色不定形粉末状物质的高分辨质-谱谱图见图1，该质谱谱图中的准离子峰m/z1287.6391[M-H]，与分子式C63H100O27的分子量-
计算值[M-H],m/z1287.6374，基本一致，表明该化合物的分子式为C63H100O27。用2N TFA完全酸水解得到单糖，糖经衍生化后进行GC分析，检测到D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖、D-木糖的存在。

[0098] 将所得白色不定形粉末状物质进行核磁共振氢谱检测、核磁共振碳谱检测和二维核磁共振谱检测。该白色不定形粉末状物质的核磁共振氢谱谱图见图2、图3和图4，其中图3和图4为该物质核磁共振氢谱的局部放大图。该白色不定形粉末状物质的核磁共振碳谱谱图见图5、图6和图7，其中图6和图7为该物质核磁共振碳谱的局部放大图。该白色不定形粉末状物质的DEPT谱图见图8、图9和图10，其中图9和图10为该物质DEPT谱图的局部放大图。该白色不定形粉末状物质的HSQC谱图见图11。该白色不定形粉末状物质的HMBC谱图见图12。该白色不定形粉末状物质的H-H COSY图谱见图13。该白色不定形粉末状物质的NOESY图谱见图14。该白色不定形粉末状物质的核磁共振谱图数据见表1。

[0099] 表1白色不定形粉末状物质的核磁共振数据

[0100]Position δH δC Position δH δC
1 0.88m,1.49m 39.0 22-O-MB -- --
2 1.92m,2.25m 26.7 1″ -- 176.9
3 3.35dd(11.0,4.5)89.8 2″ 2.34m 41.8
4 -- 39.8 3″ 1.40m,1.79m 27.1
5 0.88brd 55.9 4″ 0.88t(7.5) 12.1
6 1.35m,1.57m 18.6 5″ 1.19d(6.5) 16.9
7 1.40m,1.72m 33.3 GlcA -- --
8 -- 41.8 1 4.91d(6.5) 105.6
9 1.78m 47.0 2 4.69m 79.0
10 -- 36.9 3 4.52m 84.8
11 1.80m,1.92m 24.0 4 4.59m 71.4

[0101]12 5.49brs 123.7 5 4.52m 77.1
13 -- 143.0 6 -- 173.2
14 -- 40.2 Gal -- --
15 1.64m,1.92m 35.0 1 5.78d(7.5) 101.9
16 4.56brs 68.5 2 4.56m 83.8
17 -- 48.3 3 4.30m 75.1
18 3.18m 40.2 4 4.52m 70.1
19 1.49m,3.18m 47.3 5 4.11m 77.0
20 -- 36.6 6 4.37m,4.44m 62.0
21 6.73d(10.5) 78.9 Xyl -- --
22 6.33d(10.5) 73.7 1 5.15d(7.5) 107.6
23 1.40s 28.3 2 4.30m 76.2
24 1.23s 17.0 3 4.11m 78.4
25 0.90s 15.8 4 4.37m 70.9
26 0.95s 17.1 5 3.49m4.44m 67.7
27 1.92s 27.7 Gal -- --
28 3.49d(11.0) 63.8 1 5.93d(7.5) 103.2
-- 3.75d(10.0) -- 2 4.56m 74.0
29 1.17s 29.7 3 4.44m 75.2
30 1.40s 20.5 4 4.59m 70.4
21-O-Ang -- -- 5 4.44m 76.5
1′ -- 167.7 6 4.52m,4.56m 62.3
2′ -- 128.9 -- -- --
3′ 6.15dq(7.5,1.5) 138.6 -- -- --
4′ 2.24d(7.5) 16.2 -- -- --
5′ 2.13s 21.2 -- -- --

[0102] 注：表中化学位移以ppm为单位，偶合常数（J）以Hz为单位，nd表示存在但未检测到的信号。

[0103] 根据所得核磁共振谱图和数据对该白色不定形粉末状物质进行进一步的结构解析：

[0104] 该白色不定形粉末状物质的13C NMR谱共显示63个碳信号，通过DEPT和HSQC谱分析该化合物共含有11个甲基碳，12个亚甲基碳，29个次甲基碳以及11个季碳。进一13
步分析 C NMR谱，该谱图显示出四个糖端基碳信号δ105.6,101.9,107.6和103.2，分别是D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖、D-木糖以及另外一个D-半乳糖的端基碳。该白色不定形
1
粉末状物质的 H NMR谱中高场区有七个明显的三萜皂苷角甲基氢信号δ0.90(Me-25),0.95(Me-26),1.17(Me-29),1.23(Me-24),1.40(Me-23),1.40(Me-30) 和 1.92(Me-27)；一个连氧亚甲基δ3.49(H-28,d,J=11.0Hz)和3.75(H-28,d,J=10.0Hz)；四个连氧次甲基δ3.35(1H,dd,J=11.0,4.5Hz,H-3),4.56(1H,brs,H-16),6.73(1H,d,J=10.5Hz,H-21) 和
6.33(1H,d,J=10.5Hz,H-22)以及一个烯氢质子δ5.49(1H,brs,H-12)。此外，该白色不定
1
形粉末状物质的 H NMR谱还显示出一组当归酰基信号δ[6.15(1H,dq,J=7.5,1.5Hz,21-O-Ang-3'),2.24(3H,d,J=7.5Hz,21-O-Ang-4')和2.13(3H,s,21-O-Ang-5')]；以及一组2-甲基丁酰基信号δ[2.34(1H,m,22-O-MB-2''),1.40(1H,m,22-O-MB-3''a),1.79(1H,m,22-O-MB-3''b),0.88(3H,t,J=7.5Hz,22-O-MB-4'')和1.19(3H,d,J=6.5Hz,22-O-MB-5'')]。

[0105] H-H COSY 中，与亚甲基质子相邻的次甲基 δ H4.56(1H,brs) 与δH1.64(1H,m,H-15)和1.92(1H,m,H-15)相关，说明它们处在邻位且δH4.56为H-16信号；δH6.73(1H,d,J=10.5Hz)与δH6.33(1H,d,J=10.5Hz)间的相关信号说明它们处在邻位且δH6.73为H-21信号，δH6.33为H-22信号。

[0106] 通过白色不定形粉末状物质的HMBC 谱图分析得知该当归酰基连在该化合物的21位上，而2-甲基丁酰基连在该化合物22位上，因为
在 HMBC 中 δH6.73(1H,d,J=10.5Hz,H-21) 与 δC167.7(21-O-Ang-1') 相 关，
13 1
δH6.33(1H,d,J=10.5Hz,H-22)与δC176.9(22-O-MB-1'')相关。结合 C NMR谱和 HNMR谱数据进行综合分析，并且与已知皂苷元21β-O-angeloyl-3β,16α,28-trihydroxy-22α-O-(2-methylbutanoyl)olean-12-ene【Helvetica Chimica Acta2013.96,1126-1133】以及已知皂苷Aesculioside IVc【Phytochemistry2006,67,784-794】的苷元核磁数据对比，确定白色不定形粉末状物质的苷元结构为21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-16α,28-二羟基齐墩果-12-烯。

[0107] 对白色不定形粉末状物质的HSQC谱图进行分析，归属了该皂苷上连接的糖的端基碳、氢信号，如下：δH4.91(1H,d,J=6.5Hz),5.78(1H,d,J=7.0Hz),5.15(1H,d,J=7.5Hz)和5.93(1H,d,J=7.5Hz),分别连在δC105.6(葡萄糖醛酸-C-1),101.9(半乳糖-C-1),107.6(木糖-C-1),103.2(半乳糖′-C-1)上。另外该化合物苷元3位向低场位于约16.7ppm表明糖链连在苷元3位上，并且在HMBC谱中，葡萄糖醛酸端基质子δH4.91与苷元3位δC89.8相关，进一步证实了糖链连在苷元的3位。进一步查阅文献发现该化合物糖链与文献中报道的camellenodiol糖链数据相近【Bioorganic&medicinal chemistry letters2010,20,7435-7439】，从而推断出该化合物糖链为β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸。该糖链的连接顺序也可以通过分析HMBC谱证实，HMBC中葡萄糖醛酸端基质子δH4.91与苷元3位碳δC89.8相关，半乳糖端基质子δH5.78与葡萄糖醛酸3位碳δC84.8相关，木糖端基质子δH5.15与半乳糖
2位碳δC83.8相关，半乳糖2位氢δH4.56与木糖端基碳δC107.6相关,另一个半乳糖端基质子δH5.93与葡萄糖醛酸2位碳δC79.0相关,葡萄糖醛酸2位氢δH4.69与该半乳
3
糖端基碳δC103.2相关。此外，四个糖的端基质子偶合常数 JH-1,H-2较大，表明这四个糖都为β-构型。

[0108] NOESY 谱 中，δH6.73(1H,d,J=10.5Hz,H-21) 与 δH1.17(3H,s,H-29) 相 关，提 示H-21为α构 型；δH3.35(1H,dd,J=4.5,11.0Hz,H-3)与 δH1.40(3H,s,H-23) 相关，提 示 H-3 为 α 构 型；δH4.56(1H,brs,H-16) 与 δH3.49(1H,d,J=11.0Hz,H-28)、3.75(1H,d,J=11.0Hz,H-28)相关提示H-16为β构型,δH6.33(1H,d,J=10.5Hz,H-22)与δH1.40(3H,s,H-30)相关，提示H-22为β构型。

[0109] 因此，该化合物具有式I所示结构：

[0110]

[0111] 将该化合物结构命名为21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-16α,28-二羟基齐墩果-12-烯3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷。

[0112] 实施例2具有式I所示结构的油茶皂苷化合物的制备

[0113] 提取：

[0114] 取干燥的油茶根（2011年11月采自湖北蕲春）2000g，用粉碎机粉碎成木屑，加入10.0L体积百分比为30%的乙醇水溶液，50℃条件下浸泡6h后，加热至回流，提取三次，每次
0.5h，收集提取液，将提取液过滤，减压浓缩，得流浸膏602g。

[0115] 大孔树脂富集：

[0116] 取提取步骤所得的流浸膏，加入3.01L水，搅拌溶解，用300目滤布过滤，将滤液12000r/min离心10min，离心后，得6.2L上清液，取上清液经D101型大孔树脂进一步分离，依次用10.0L水、15.0L60%乙醇水溶液、10.0L95%乙醇水溶液进行洗脱，收集95%乙醇水溶液洗脱组分，减压浓缩经检测，所得浓缩液中含有油茶皂苷类化合物，烘箱100℃,48h干燥,得褐色固体物71g,即为油茶总皂苷提取物。

[0117] 第一次纯化物的制备：

[0118] 取大孔树脂富集所得的油茶总皂苷提取物，经减压硅胶柱（硅胶：80目）分离，以氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱，洗脱梯度为氯仿和甲醇的体积比为90:10→80:20→70:30→60:40→50:50→40:60→30:70→20:80，每个梯度1000mL；分别收集每个洗脱组分，并一一标号。将所得洗脱液进行薄层板分析：薄层色谱硅胶板，BAW系统，Rf值=0.4～0.7。经检测，以下洗脱组分含有的成分相似：80:20的氯仿-甲醇溶液洗脱组分，70:30的氯仿-甲醇溶液洗脱组分，60:40的氯仿-甲醇溶液洗脱组分。合并80:20的氯仿-甲醇溶液洗脱组分，
70:30的氯仿-甲醇溶液洗脱组分和60:40的氯仿-甲醇溶液洗脱组分，减压干燥，即得第一次纯化物9.6g。

[0119] 第二次纯化物的制备：

[0120] 取所得第一次纯化物，经中压反相十八烷基硅烷制备液相色谱进行分离，以甲醇-水系统进行梯度洗脱，洗脱梯度为甲醇和水的体积比为50:50→60:40→70:30→80:20→90:10→100:0，每个梯度1000mL，流速25mL/min，检测波长203nm。分段收集洗脱组分，得六个洗脱组分，一一标记。取洗脱梯度为60:40，70:30，80:20，90:10所对应的洗脱组分进行高效分析液相色谱分析，结果表明，洗脱梯度70:30，80:20，90:10所对应的洗脱组分中含有的成分相似（高效分析液相色谱时间为30min，检测峰位于20min-28min之间），合并洗脱梯度所对应的洗脱组分，减压浓缩，即得第二次纯化物20mL。

[0121] 第三次纯化物的制备：

[0122] 取第二次纯化物，经动态轴向柱色谱进行分离(流速150mL/min，检测波长203nm)，以体积百分比计，依次用60%、75%、80%和90%甲醇水溶液进行洗脱，每个梯度
3000mL，分别收集，得四个洗脱组分，一一标记。将所得洗脱组分分别经高效分析液相色谱分析（检测峰位于13.5min-15.0min之间），收集75%洗脱组分（即体积比为75:25的甲醇-水混合液洗脱组分，高效液相检测峰位于13.5min），减压浓缩，即得第三次纯化物
15mL。

[0123] 白色不定形粉末状物质的制备：

[0124] 取第三次纯化物，经C18半制备色谱柱（250mm×10mm，5μm）进行分离（流速2mL/min，检测波长203nm），以甲醇-水-甲酸混合液（甲醇和水按体积比为78:22组成的混合溶液再与占所得混合溶液质量百分含量为0.2%的甲酸混合所得的混合液）进行洗脱，收集46.5min处色谱峰，将所得洗脱组分进行蒸馏、干燥，得61mg白色不定形粉末状物质。

[0125] 采用实施例1相同的化合物结构鉴定方法对本实施例制得的白色不定形粉末状物质进行结构鉴定，获得的高分辨质谱谱图、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、DEPT谱图、HSQC谱图、HMBC谱图、H-H COSY谱图、NOESY谱图与实施例1所得的相关谱图数据基本一致，结果显示该白色不定形粉末状物质为具有式I所示结构的化合物，

[0126]

[0127] 实施例3具有式I所示结构的油茶皂苷化合物的制备

[0128] 提取：

[0129] 取干燥的油茶根（采自湖北蕲春）2000g，用粉碎机粉碎成木屑，加入40.0L体积百分比为95%的乙醇水溶液，30℃条件下浸泡8h后，加热至回流，提取两次，每次1h，收集提取液，将提取液过滤，减压浓缩，得流浸膏578g。

[0130] 大孔树脂富集：

[0131] 取提取步骤所得的流浸膏，加入11.56L水，搅拌溶解，用200目滤布过滤，将滤液12000r/min离心10min，离心后，得5.9L上清液，取上清液经D101型大孔树脂进一步分离，依次用10L水、15L40%乙醇水溶液、15L80%乙醇水溶液进行洗脱，收集80%乙醇水溶液洗脱组分，减压浓缩，经检测，所得浓缩液中含有油茶皂苷类化合物，烘箱100℃,48h干燥,得褐色固体物58g,即为油茶总皂苷提取物。

[0132] 第一次纯化物的制备：

[0133] 取大孔树脂富集所得的油茶总皂苷提取物，经减压硅胶柱（硅胶：60-100目）分离，以氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱，洗脱梯度为氯仿和甲醇的体积比为90:10→80:20→70:30→60:40→50:50→40:60→30:70→20:80，每个梯度1000mL；分别收集每个洗脱组分，并一一标号。将所得洗脱液进行薄层板分析：薄层色谱硅胶板，BAW系统，Rf值=0.4～0.7。经检测，以下洗脱组分含有的成分相似：80:20的氯仿-甲醇溶液洗脱组分，70:30的氯仿-甲醇溶液洗脱组分，60:40的氯仿-甲醇溶液洗脱组分。合并80:20的氯仿-甲醇溶液洗脱组分，70:30的氯仿-甲醇溶液洗脱组分和60:40的氯仿-甲醇溶液洗脱组分，减压蒸干，即得第一次纯化物8.8g。

[0134] 第二次纯化物的制备：

[0135] 取所得第一次纯化物，经中压反相十八烷基硅烷制备液相色谱进行分离，以甲醇-水系统进行梯度洗脱，洗脱梯度为甲醇和水的体积比为50:50→60:40→70:30→80:20→90:10→100:0，每个梯度1000mL，流速25mL/min，检测波长203nm。分段收集洗脱组分，得六个洗脱组分，一一标记。取洗脱梯度为60:40，70:30，80:20，90:10所对应的洗脱组分进行高效分析液相色谱分析，结果表明，洗脱梯度70:30，80:20，90:10所对应的洗脱组分中含有的成分相似（高效分析液相色谱时间为30min，检测峰位于20min-28min之间），合并洗脱梯度所对应的洗脱组分，减压浓缩，即得第二次纯化物20mL。

[0136] 第三次纯化物的制备：

[0137] 取第二次纯化物，经动态轴向柱色谱进行分离(流速150mL/min，检测波长203nm)，以体积百分比计，依次用60%、75%、80%和90%甲醇水溶液进行洗脱，每个梯度
3000mL，分别收集，得四个洗脱组分，一一标记。将所得洗脱组分分别经高效分析液相色谱分析（检测峰位于13.5min-15.0min之间），收集75%洗脱组分（即体积比为75:25的甲醇-水混合液洗脱组分，高效液相检测峰位于15.0min），减压浓缩，即得第三次纯化物
15mL。

[0138] 白色不定形粉末状物质的制备：

[0139] 取第三次纯化物，经C18半制备色谱柱（250mm×10mm，5μm）进行分离（流速2mL/min，检测波长203nm），以甲醇-水-甲酸混合液（甲醇和水按体积比为78:22组成的混合溶液再与占所得混合溶液质量百分含量为0.2%的甲酸混合所得的混合液）进行洗脱，收集46.5min处色谱峰，将所得洗脱组分进行蒸馏、干燥，得57mg白色不定形粉末状物质。

[0140] 采用实施例1相同的化合物结构鉴定方法对本实施例制得的白色不定形粉末状物质进行结构鉴定，获得的高分辨质谱谱图、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、DEPT谱图、HSQC谱图、HMBC谱图、H-H COSY谱图、NOESY谱图与实施例1所得的相关谱图数据基本一致，结果显示该白色不定形粉末状物质为具有式I所示结构的化合物，

[0141]

[0142] 实施例4具有式I所示结构的油茶皂苷化合物的制备

[0143] 提取：

[0144] 取干燥的油茶根2000g，用粉碎机粉碎成木屑，加入到20L乙醇水溶液中进行提取，将所得提取液进行浓缩，得流浸膏615g。

[0145] 大孔树脂富集：

[0146] 向所得流浸膏中加入水6.0L，搅拌至溶解，过滤，得滤液6.1L；将所得滤液过大孔树脂进行分离，以乙醇-水混合液洗脱，收集体积比为70:30～95:5的乙醇-水混合液洗脱组分，经检测，其中含有油茶皂苷类化合物，烘箱100℃,48h干燥,得褐色固体物65g,即为油茶总皂苷提取物。

[0147] 第一次纯化物的制备：

[0148] 取大孔树脂富集所得的油茶总皂苷提取物，经减压硅胶柱分离，以氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱，每个梯度1000mL，分别收集体积比为80:20，70:30，60:40的氯仿-甲醇混合液洗脱组分。将所得三个洗脱组分进行薄层板分析：薄层色谱硅胶板，BAW系统，Rf值=0.4～0.7。经检测，三个洗脱组分含有的成分相似，合并这三个洗脱组分，减压蒸干，即得第一次纯化物9.5g。

[0149] 第二次纯化物的制备：

[0150] 取所得第一次纯化物，经中压反相十八烷基硅烷制备液相色谱进行分离，以甲醇-水系统进行梯度洗脱，每个梯度1000mL，分别收集体积比为70:30，80:20，90:10的甲醇-水混合液洗脱组分。将所得三个洗脱组分进行高效分析液相检测，得这三个洗脱组分中含有的成分相似（高效分析液相色谱时间为30min，检测峰位于20min-28min之间），合并这三个洗脱组分，减压浓缩，即得第二次纯化物20mL。

[0151] 第三次纯化物的制备：

[0152] 取第二次纯化物，经动态轴向柱色谱进行分离，以甲醇-水系统进行洗脱，收集体积比为75:25的甲醇-水混合液洗脱组分3000mL。将所得洗脱组分经高效分析液相色谱分析，于15.0min处出现检测峰，收集该洗脱组分，减压浓缩，即得第三次纯化物15mL。

[0153] 白色不定形粉末状物质的制备：

[0154] 取第三次纯化物，经半制备高效液相色谱柱（250mm×10mm，5μm）进行分离（流速2mL/min，检测波长203nm），以甲醇-水-甲酸混合液（甲醇和水按体积比为78:22组成的混合溶液再与占所得混合溶液质量百分含量为0.2%的甲酸混合所得的混合液）进行洗脱，收集46.5min处色谱峰，将所得洗脱组分进行蒸馏、干燥，得70mg白色不定形粉末状物质。

[0155] 采用实施例1相同的化合物结构鉴定方法对本实施例制得的白色不定形粉末状物质进行结构鉴定，获得的高分辨质谱谱图、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、DEPT谱图、HSQC谱图、HMBC谱图、H-H COSY谱图、NOESY谱图与实施例1所得的相关谱图数据基本一致，结果显示该白色不定形粉末状物质为具有式I所示结构的化合物，

[0156]

[0157] 实施例5体外细胞实验

[0158] 实验材料：

[0159] 人肺癌A549细胞，B16小鼠黑色素瘤细胞，人肝癌BEL-7402细胞和人乳腺癌细胞MCF-7，均购与中国科学院上海细胞所。这四种细胞均用含10%灭活NBS的RPMI1640培养基(另加Glu0.03%，Hepes0.06%，NaHCO30.2%)于37℃、5%CO2条件下培养，3天传代。取对数生长期细胞进行实验。实验所用油茶皂苷化合物为按照实施例1提供的制备方法制得的具有式I所示结构的油茶皂苷化合物，

[0160]

[0161] 实验方法：

[0162] 采用常规MTT法，测定肿瘤细胞株对药物的敏感性。具体实验安排如下：

[0163] 实验分为阴性对照组、实验组和阳性对照组。阴性对照组受试细胞中加入的溶液为完全培养基，设3个复孔。实验组受试细胞中加入含有不同浓度的实施例1制得的油茶皂苷化合物的溶液，溶剂为体积比为1:99的DMSO与PBS的混合溶液，实验设置5个浓度，其中该油茶皂苷化合物的浓度分别为：6.25μg/mL、9.375μg/mL、12.5μg/mL、18.25μg/mL、25.00μg/mL，每组均设3个复孔。阳性对照组受试细胞中加入含5-FU（5-氟尿嘧啶）的溶液，溶剂为体积比为1:99的DMSO与PBS的混合溶液，5-FU的浓度为50μg/mL，设3个复孔。

[0164] 按照实验安排，用完全培养基调整各个细胞浓度为5×104/mL，分别接种于96孔培养板中，一一标记，100μL/孔，37℃、5%CO2条件下培养过夜。实验组加入不同浓度的实施例1制得的具有式I所示结构的油茶皂苷化合物(终浓度分别为：6.25μg/mL、9.375μg/mL、
12.5μg/mL、18.25μg/mL、25.00μg/mL)，10μL/孔；阳性对照组加入5-FU(50μg/mL)，
10μL/孔；阴性对照组加入等体积完全培养基，10μL/孔；每组均设3复孔，分别培养24h。
终止培养前4h分别加入MTT(5mg/mL)，10μl/孔，在培养结束后每孔加入DMSO100μL，放置摇床振荡10min后，用酶标仪检测波长为490nm处的吸光度A值。

[0165] 实验数据处理方法：

[0166] 以IC50值评价油茶皂苷化合物对不同肿瘤细胞的抑制作用。

[0167] 按下面的公式计算肿瘤细胞生长抑制率(Inhibition Rate)：

[0168] 肿瘤细胞生长抑制率（%）=[（A阴性对照组-A实验组）/A阴性对照组]×100%；

[0169] 以油茶皂苷化合物的浓度为横坐标，肿瘤细胞生长抑制率为纵坐标作图，得抑制率-浓度曲线，然后得出50%抑制率时药品的浓度，即油茶皂苷化合物对受试细胞的IC50值（半数抑制浓度），实施例1制得的油茶皂苷化合物对不同受试细胞的IC50值见表2。

[0170] 表2油茶皂苷化合物对四种不同肿瘤细胞的IC50值

[0171]受试细胞 A549 B16 BEL-7402 MCF-7
IC50（μg/mL） 12.03±0.24 10.81±0.53 12.59±0.16 12.76±0.42

[0172] 由实验组数据可知，实施例1制得的油茶皂苷化合物对这四种肿瘤细胞的IC50值都小于15μg/mL，表明该油茶皂苷化合物具有较好的抗肿瘤活性，尤其是对于B16细胞的抑制效果最为明显，其IC50值仅为10.81μg/mL。实验结果表明，实施例1制得的具有式I所示结构的油茶皂苷化合物对肝肿瘤、黑素瘤、乳腺肿瘤或肺肿瘤具有一定的抑制作用，可以应用于制备抗肿瘤药物。

[0173] 采用相同的实验方法考察实施例2至实施例4制得的油茶皂苷化合物对人肺癌A549细胞，B16小鼠黑色素瘤细胞，人肝癌BEL-7402细胞和人乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用，获得了相似的实验结果，说明实施例2至实施例4制得的具有式I所示结构的油茶皂苷化合物对肝肿瘤、黑色素瘤、乳腺肿瘤或肺肿瘤具有一定的抑制作用，可以应用于制备抗肿瘤药物。

[0174] 实施例6体内实验

[0175] 实验材料：

[0176] ICR小鼠，清洁级，雄性，体重18-22g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。H22肝癌、S180肉瘤细胞购于中科院上海细胞库。实验所用油茶皂苷化合物为按照实施例1提供的制备方法制得的具有式I所示结构的化合物，

[0177]

[0178] 实验方法：

[0179] 本实施例考察实施例1制得的具有式I所示结构的油茶皂苷化合物对肝癌的作用。受试对象为H22移植瘤模型小鼠、S180移植瘤模型小鼠。

[0180] 小鼠H22移植瘤模型、小鼠S180移植瘤模型的建立与实验安排：

[0181] 取H22或S180肝癌(肉瘤)细胞冻存管，置于37℃恒温水浴中解冻，离心收集细胞，用PBS液洗涤两次，再用PBS液重悬细胞，经ICR小鼠腹腔传3代以上，取腹部明显膨大的小鼠，脱臼处死，对腹部酒精消毒，一次性无菌注射器抽取乳白色腹水，注入已灭菌的离心管中，细胞计数器计数，用生理盐水调整细胞密度至5×106/mL，给每只小鼠右腋下接种0.2mL细胞悬液进行造模。次日将小鼠随机分为空白对照组、实验组和阳性对照组，每组12只，并进行给药。实验组提供实施例1制得的具有式I所示结构的油茶皂苷化合物，给药方式为腹腔注射，给药剂量为：3mg/kg，溶媒为0.9%的生理盐水，每日一次。阳性对照组提供CTX(环磷酰胺)，给药方式为腹腔注射，给药剂量为：20mg/kg，溶媒为0.9%的生理盐水，隔日一次。空白对照组提供空白溶媒，即0.9%的生理盐水，腹腔注射，注射量为0.2mL，每日一次。所有组别小鼠连续给药10天，每天称取小鼠体重，记录小鼠的临床表现。最后一次给药2h后，剥离瘤体，称取瘤重，并计算抑瘤率。

[0182] 实验数据处理方法：

[0183] 以抑瘤率来考察不同组别肿瘤的抑制情况，按照下面的公式计算抑瘤率：

[0184] 抑瘤率（%）=[（空白对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/空白对照组平均瘤重]×100%

[0185] 各个组别的移植瘤瘤重以及抑瘤率见表3。

[0186] 表3不同组别的移植瘤瘤重及抑瘤率

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[0188] 注：与空白对照组相比较，*P<0.05，**P<0.01

[0189] 实验结果表明，针对H22移植瘤模型，与空白对照组相比，阳性对照组和实验组的移植瘤的瘤重明显小于空白对照组的移植瘤的瘤重，差异显著，说明实施例1制得的具有式I所示结构的油茶皂苷化合物能够显著抑制H22肝癌的生长。针对S180移植瘤模型，与空白对照组相比，阳性对照组和实验组的移植瘤的瘤重明显小于空白对照组的移植瘤的瘤重，差异显著，说明实施例1制得的具有式I所示结构的油茶皂苷化合物能够显著抑制S180肝癌的生长。实验结果还表明，当实施例1制得的具有式I所示结构的油茶皂苷化合物的给药量为3.0mg/kg时，对H22移植瘤的抑制率达到35.8%，提示该油茶皂苷化合物具有显著的抗小鼠H22肝癌生长的作用；当实施例1制得的具有式I所示结构的油茶皂苷化合物的给药量为3.0mg/kg时，对S180移植瘤的抑制率达到42.1%，提示该油茶皂苷化合物具有较强的抗小鼠S180肝癌生长的作用。以上结果表明实施例1制得的具有式I所示结构的油茶皂苷化合物具有较好的抗肿瘤活性，可以应用于制备抗肿瘤药物。

[0190] 采用相同的实验方法考察实施例2至实施例4制得的油茶皂苷化合物对小鼠H22肝癌、S180肉癌的抑制作用，获得了相似的实验结果，说明实施例2至实施例4制得的油茶皂苷化合物能够有效抑制H22肝癌生长、S180肝癌生长。说明实施例2至实施例4制得的油茶皂苷化合物具有较好的抗肿瘤活性，可以应用于制备抗肿瘤药物。

[0191] 实施例7片剂的制备

[0192] 取实施例1制得的具有I所示结构的油茶皂苷类化合物添加常规辅料，按照常规方法制成片剂。

[0193] 实施例8颗粒剂的制备

[0194] 取实施例2制得的具有I所示结构的油茶皂苷化合物添加常规辅料，按照常规方法制成颗粒剂。

[0195] 实施例9胶囊剂的制备

[0196] 取实施例3制得的具有I所示结构的油茶皂苷化合物添加常规辅料，按照常规方法制成胶囊剂。

[0197] 实施例10注射剂的制备

[0198] 取实施例4制得的具有I所示结构的油茶皂苷化合物添加常规辅料，按照常规方法制成注射剂。

[0199] 实施例11乳剂的制备

[0200] 取实施例1制得的具有I所示结构的油茶皂苷化合物添加常规辅料，按照常规方法制成乳剂。

[0201] 实施例12混悬剂的制备

[0202] 取实施例1制得的具有I所示结构的油茶皂苷化合物添加常规辅料，按照常规方法制成混悬剂。

[0203] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。