从七叶一枝花根茎中提取薯蓣皂甙的方法

摘要

本发明涉及从七叶一枝花根茎中提取分离薯蓣皂甙的方法，将干燥过后的七叶一枝花根茎经微生物发酵后再用乙醇溶液提取、过滤、减压浓缩、萃取、柱层析、脱色结晶制得薯蓣皂甙纯品。本方法操作简单，极大的降低了七叶一枝花中薯蓣皂甙的生产成本，简化了生产过程。

权利要求

1.从七叶一枝花提取薯蓣皂甙的方法，步骤包括：

(1) 粉碎干燥七叶一枝花，过20目筛，加入5-10%棘孢曲霉培养液，在28～30℃条件下好氧固体发酵3～3.5天，其中5-10%是指棘孢曲霉培养液体积L与七叶一枝花重量kg的比值；

(2) 发酵后七叶一枝花与乙醇水溶液按一定比例进行混合，加热到60-80℃下回流提取一定时间；

(3) 过滤除渣后，滤液在50℃下减压浓缩获得干燥物；

(4) 将干燥物用石油醚进行浸提一次，陶瓷膜过滤一次，滤液在50℃下减压浓缩回收石油醚；

(5) 滤渣加入35%-40%乙醇水溶液进行溶解，上大孔吸附树脂X-5进行吸附分离，并将洗脱物减压浓缩干燥，其中洗脱液为甲醇或乙醇水溶液；

(6) 减压浓缩获得干燥物，加入70%乙醇水溶液使之充分溶解40℃左右，再加入2-4倍体积的水；

(7) 将含有薯蓣皂甙的乙醇溶液放置在低温下过夜结晶，得到淡黄色晶体，抽滤，得到薯蓣皂甙粗品，重结晶得到薯蓣皂甙纯品。

2.根据权利要求1的方法，步骤(2)所述的乙醇水溶液为含有60%-80%乙醇的水溶液，所述七叶一枝花与乙醇水溶液的比例按重量(kg)/体积(L)比为1:4-6，所述的回流提取时间为3-10小时。

3.根据权利要求1的方法，步骤(3)所述的过滤过程是纱布过滤、陶瓷膜过滤。

4.根据权利要求3的方法，所述纱布过滤是指三层纱布过滤2次，陶瓷膜过滤是指陶瓷膜过滤1次。

5.根据权利要求1的方法，步骤(4)所述石油醚的量(L)为所得干燥物(kg)重量的

2-6倍。

6.根据权利要求1的方法，其中步骤(5)中加入乙醇水溶液的量(L)为所得干燥物(kg)重量的1/4-1/2倍，所述洗脱液为55-85%的甲醇或乙醇水溶液。

7.根据权利要求1的方法，步骤(6)中70%乙醇水溶液的用量，与步骤(5)所得干燥物按体积(L)/重量(kg)比为1-4：1。

8.根据权利要求1的方法，步骤(7)的结晶温度是0-4℃。

说明书

从七叶一枝花根茎中提取薯蓣皂甙的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种七叶一枝花根茎中提取分离薯蓣皂甙的工艺技术，属于生物分离工程的技术领域。

背景技术

[0002] 七叶一枝花，又名七叶莲、重楼，为百合科多年生草本植物，药用历史悠久，是我国重要的传统中药，国家二类中药保护品种。该植物主要特征是由一圈轮生的叶子（6-7片）中冒出一朵花，花可以分成两个部分，外轮花及内轮花，外轮花与叶子很像，约有六片，而内轮花约有八片。多年生草本，高50-100厘米，3-7年挖根茎入药。喜欢生长在中海拔高度的山坡、阔叶林下或溪边、灌木丛下阴湿处。地下根茎横生，肥厚，黄褐色，有斜行环节，并生须根。茎单一，无毛。叶4-9片，通常为7片，轮生茎顶；叶片长卵形。春夏间在轮生叶的中心抽出花梗，顶端生一朵花，故名七叶一枝花。秋季果熟；葫果球形，内有多数鲜红色种子。广泛分布于云贵、两广、武陵山脉等地区。

[0003] 七叶一枝花根茎含有甾体皂甙、丙氨酸等18种氨基酸及肌酐等多种成分，能治痈肿肺痨久咳、跌打损伤、蛇虫咬伤、淋巴结核、骨髓炎等症，是云南白药的主要成分之一；近年来，又相继发现其化学成分薯蓣皂甙元具有良好的抗肿瘤、抗菌、消炎和治疗胃溃疡、白血病、心血管疾病、镇静镇痛、止咳平喘以及抑精等生理活性作用，这些发现使薯蓣皂甙元身价百倍。目前世界上有十余个国家和地区在开发薯蓣皂甙元原料及制剂，被喻为继紫杉醇之后的又一新的绿色抗癌药物，被人们广泛关注。

[0004] 我国是七叶一枝花的原产国，每年的七叶一枝花除国内直接入药外，其它均是通过提取物的形式出口。目前国内七叶一枝花深加工生产厂家甚多，大约有十余家，由于生产技术或设备落后，产品绝大部分以粗产品（提取物）的形式出口，其提取物主要含有薯蓣皂甙和偏诺皂甙等活性成分。

[0005] 公开号为CN85108564的中国专利公开了一种用黑曲霉菌发酵联产薯蓣皂素和柠檬酸，以含薯蓣皂甙的薯蓣属植物为原料,用黑曲霉菌发酵,可联合生产薯蓣皂素和柠檬酸两项产品.通过发酵,薯蓣皂素的分子结构保持不变,并使薯蓣皂素的产率成倍提高;经过发酵,将淀粉转为柠檬酸进入液相,使投入水解过程的物料减少,酸、溶剂和能量的消耗降低,可使每吨薯蓣皂素的生产成本降低约3万元。

[0006] 公开号为CN1442484的中国专利公开了一种薯蓣皂甙元的生产方法，包括薯蓣药材前处理、生物酶解、酸水解、超临界流体(CO2)萃取和浓缩结晶，本方法原料综合利用率高，生产自控化程度高，产量高、质量好、生产周期短、成本低、无毒、无污染和安全性好。

[0007] 公开号为CN1793162的中国专利公开了一种薯蓣皂甙的生产新工艺，以2-3年生黄姜或穿山龙根颈为原料，其工艺为：原料→超微粉碎→超声提取→精馏→水解→溶解提纯→精馏→皂甙→裂解→精馏→皂甙。本发明提供一种薯蓣皂甙的生产新工艺，其工艺先进、投资少、原料消耗低、产品质量高、品质优、生产周期短、无污染。

[0008] 综上所述，目前主要以黄姜为原料，采用酸解方法直接将黄姜中薯蓣皂甙水解薯蓣皂苷元后结晶得到薯蓣皂苷元，尚未见到利用七叶一枝花根茎进行薯蓣皂甙的提取，由于七叶一枝花根茎还含有偏诺皂甙等多种皂甙，分离提取薯蓣皂甙难度比较大，成本比较高，一般利用在分离偏诺皂甙过程中同时把薯蓣皂甙进行分离提取出来。

发明内容

[0009] 本发明采用的技术方案包括：干燥过后的七叶一枝花根茎经微生物发酵后，再用乙醇溶液提取、过滤、减压浓缩、萃取、柱层析、脱色结晶制得薯蓣皂甙纯品。

[0010] 本发明采用的微生物菌种，棘孢曲霉（Aspergillus.aculeatus）来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号分别为CGMCC No.3876。

[0011] 因此，本发明提供一种从七叶一枝花提取薯蓣皂甙的方法，步骤包括：

[0012] (1) 粉碎干燥七叶一枝花(过20目筛)，加入5-10%棘孢曲霉培养液，在28～30℃条件下好氧固体发酵3～3.5天，

[0013] (2) 发酵后七叶一枝花与乙醇水溶液按一定比例进行混合，加热到60-80℃下回流提取一定时间；

[0014] (3) 过滤除渣后，滤液在50℃下减压浓缩获得干燥物；

[0015] (4) 将干燥物用石油醚进行浸提一次，陶瓷膜过滤一次，滤液在50℃下减压浓缩回收石油醚；

[0016] (5) 滤渣加入35%-40%乙醇水溶液进行溶解，上大孔吸附树脂X-5进行吸附分离，并将洗脱物减压浓缩干燥，其中洗脱液为甲醇或乙醇水溶液；

[0017] (6) 减压浓缩获得干燥物，加入70%乙醇水溶液使之充分溶解40℃左右，再加入2-4倍体积的水；

[0018] (7) 将含有薯蓣皂甙的乙醇溶液放置在低温下过夜结晶，得到淡黄色晶体，抽滤，得到薯蓣皂甙粗品，重结晶得到薯蓣皂甙纯品。

[0019] 在一个实施方案中，步骤(2)所述的乙醇水溶液为含有60%-80%乙醇的水溶液，所述七叶一枝花与乙醇水溶液的比例按重量(kg)/体积(L)比为1:4-6，所述的回流提取时间为3-10小时。

[0020] 在一个实施方案中，步骤(3)所述的过滤过程是纱布过滤、陶瓷膜过滤，其中，优选是三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次。

[0021] 在一个实施方案中，步骤(4)所述石油醚的量(L)为所得干燥物(kg)重量的2-6倍。

[0022] 在一个实施方案中，其中步骤(5)中加入乙醇水溶液的量(L)为所得干燥物(kg)重量的1/4-1/2倍，所述洗脱液为55-85%的甲醇或乙醇水溶液。

[0023] 在一个具体实施方案中，步骤(6)中70%乙醇水溶液的用量，与步骤(5)所得干燥物按体积(L)/重量(kg)比为1-4：1。

[0024] 在另一个具体实施方案中，步骤(7)的结晶温度是0-4℃。

[0025] 技术效果

[0026] 1、本发明方法操作简单，极大的降低了七叶一枝花中薯蓣皂甙的生产成本，简化了生产过程。

[0027] 2、采用醇提和柱层析方法快速获得薯蓣皂甙等多种活性皂甙，同时也可在转化薯蓣皂苷元的过程中有效降低盐酸的用量，降低污染物的排放。

[0028] 3、采用醇浸提后所得到废渣可直接用于肥料的制备，降低了向环境排放废弃物的可能。

[0029] 4、采用棘孢曲霉进行发酵处理，有效降低了七叶一枝花中淀粉对提取薯蓣皂甙的影响，提高了薯蓣皂甙的溶出率，也能有效提高薯蓣皂甙的产量。

附图说明

[0030] 图1：从七叶一枝花中提取薯蓣皂甙的纯度HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。

[0031] 图2：薯蓣皂甙标准品的HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。

具体实施方式

[0032] 下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。

[0033] 实施例1

[0034] 粉碎干燥七叶一枝花，过20目筛，称取100kg，加入10L棘孢曲霉培养液，在28～30℃条件下好氧固体发酵3天，发酵后七叶一枝花与80%乙醇450L，加热至60℃下回流提取4h，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤一次，得滤液，50℃下减压浓缩获得干燥物11.5kg；
将干燥物用45L的石油醚进行浸提，陶瓷膜过滤一次，滤液在50℃下减压浓缩回收石油醚；
得滤渣7 .7kg加入3L的40%乙醇水溶液进行溶解，上大孔吸附树脂NK-2进行吸附分离，并将洗脱物减压浓缩干燥，其中洗脱液为60%乙醇溶液；减压浓缩获得干燥物2.25kg，加入4L的70%乙醇水溶液使之充分溶解40℃左右，再加入9L的水；将含有薯蓣皂甙的乙醇溶液放置在4℃过夜结晶，得到淡黄色晶体，抽滤，得到薯蓣皂甙粗品，重结晶得到薯蓣皂甙675 g纯品。检测设备为Agilent1100高效液相色谱仪，色谱柱为Hypersil ODS (250mm×4.6mm，
5μ)，薯蓣皂甙的检测条件∶流动相为85%甲醇的水溶液、检测波长为303nm、流速为l ml／min、进样量为20µL。薯蓣皂甙样品的纯度为98.36%。

[0035] 对照实施例

[0036] 粉碎干燥七叶一枝花，过20目筛，称取100kg，用80%乙醇450L，加热至60℃下回流提取4h，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤一次，得滤液，50℃下减压浓缩获得干燥物13.8kg；将干燥物用50L的石油醚进行浸提，陶瓷膜过滤一次，滤液在50℃下减压浓缩回收石油醚；得滤渣8.5kg加入3.5L的40%乙醇水溶液进行溶解，上大孔吸附树脂NK-2进行吸附分离，并将洗脱物减压浓缩干燥，其中洗脱液为60%乙醇溶液；减压浓缩获得干燥物
2.03kg，加入4L的70%乙醇水溶液使之充分溶解40℃左右，再加入9L的水；将含有薯蓣皂甙的乙醇溶液放置在4℃过夜结晶，得到淡黄色晶体，抽滤，得到薯蓣皂甙粗品，重结晶得到薯蓣皂甙648 g纯品。按实施例1的检测方法进行检测薯蓣皂甙样品，薯蓣皂甙样品的纯度为98.40%。

[0037] 实施例2

[0038] 粉碎干燥七叶一枝花，过20目筛，称取200kg，加入15L棘孢曲霉培养液，在28～30℃条件下好氧固体发酵3天，发酵后七叶一枝花与70%乙醇1100L，加热至70℃下回流提取5h，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤一次，得滤液，50℃下减压浓缩获得干燥物24.5kg；
将干燥物用50L的石油醚进行浸提，陶瓷膜过滤一次，滤液在50℃下减压浓缩回收石油醚；
得滤渣15 .5kg加入5L的40%乙醇水溶液进行溶解，上大孔吸附树脂NK-2进行吸附分离，并将洗脱物减压浓缩干燥，其中洗脱液为65%乙醇溶液；减压浓缩获得干燥物4.58kg，加入6L的70%乙醇水溶液使之充分溶解40℃左右，再加入14L的水；将含有薯蓣皂甙的乙醇溶液放置在4℃过夜结晶，得到淡黄色晶体，抽滤，得到薯蓣皂甙粗品，重结晶得到薯蓣皂甙1.57kg纯品。按实施例1的检测方法进行检测薯蓣皂甙样品，薯蓣皂甙样品的纯度为
98.65%。

[0039] 实施例3

[0040] 粉碎干燥七叶一枝花，过20目筛，称取400kg，加入25L棘孢曲霉培养液，在28～30℃条件下好氧固体发酵3.5天，发酵后七叶一枝花与65%乙醇2400L，加热至80℃下回流提取6h，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤一次，得滤液，50℃下减压浓缩获得干燥物
50.1kg；将干燥物用120L的石油醚进行浸提，陶瓷膜过滤一次，滤液在50℃下减压浓缩回收石油醚；得滤渣32 .1kg加入9L的40%乙醇水溶液进行溶解，上大孔吸附树脂NK-2进行吸附分离，并将洗脱物减压浓缩干燥，其中洗脱液为70%乙醇溶液；减压浓缩获得干燥物
9.85kg，加入15L的70%乙醇水溶液使之充分溶解40℃左右，再加入35L的水；将含有薯蓣皂甙的乙醇溶液放置在4℃过夜结晶，得到淡黄色晶体，抽滤，得到薯蓣皂甙粗品，重结晶得到薯蓣皂甙3.85kg纯品。按实施例1的检测方法进行检测薯蓣皂甙样品，薯蓣皂甙样品的纯度为98.42%。