一种对米克戴德军团菌wzx的特异的核苷酸及其应用

摘要

本发明涉及一种对米克戴德军团菌的wzx基因特异的核苷酸及其应用，所述核苷酸为：SEQ ID NO:1所示的核苷酸和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸；与上述的核苷酸互补的核苷酸。这些核苷酸可用于制备检测米克戴得军团菌的PCR试剂盒、基因芯片或微阵列。本发明的对米克戴得军团菌的wzx基因特异的核苷酸及包含该核苷酸的PCR试剂盒、基因芯片或微阵列的实用性强，PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于商品化生产，而检测成本却相对较低；准确性高；灵敏度高。

权利要求

1.一种对米克戴德军团菌（Legionella micdeida）的wzx基因特异的PCR引物对，其特征在于所述引物对的核苷酸是：SEQ ID NO:1所示的核苷酸和SEQ ID NO:2所示的核苷酸。

2.一种PCR试剂盒，包括权利要求1所述的PCR引物对、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，其中所述的PCR引物对为如SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2所示的核苷酸。

3.权利要求2所述的试剂盒，其中的SEQ ID NO:1 ATTTCGTAAACCTTTGACTTCC 为特异扩增米克戴得军团菌的wzx基因上游引物；SEQ ID NO:2 GAACCCGAATACGTGACT为特异扩增米克戴得军团菌的wzx基因下游引物。

4.权利要求2所述的试剂盒，其中还包括如下试剂：

10 mM dNTP 20μL；10×酶特异性反应缓冲液50μL；

5 U/μL耐热DNA聚合酶 8μL；SEQ NO:1引物和SEQ NO:2引物各10μL；

阳性对照品10μL，阴性对照品10μL；ddH2O 5mL。

5.权利要求2所述PCR试剂盒在检测米克戴得军团菌（Legionella micdeida）方面的应用，其用于非疾病诊断治疗目的。

说明书

一种对米克戴德军团菌wzx的特异的核苷酸及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种核苷酸及其应用，尤其涉及一种对米克戴得军团菌(Legionella micdadei)的wzx(LPS O-抗原转运酶Wzx，transportase of LPS O-antigen，以下简称wzx)基因特异的核苷酸及其应用。

背景技术

[0002] 军团菌是一种需氧型的革兰氏阴性杆菌，长约1.2~5μm，直径约0.3~0.5μm，没有芽孢和荚膜，不产酸，不产气，菌体有一至数根端鞭毛或侧鞭毛，可以运动。该菌可在藻类、原生动物（阿米巴）内寄居，也可在人类单核细胞和巨噬细胞内以兼性胞内寄生方式生存。由于该菌的细胞壁具有独特的泛醌和脂肪酸谱结构，因此常用Dieterle镀银染料（呈黑褐色）或Giemsa染色（呈红色）对其进行鉴定。

[0003] 军团菌在厌氧条件下生长，在含有2%~5%的CO2环境中生长良好，最适生长温度为35℃~36℃，最适pH为6.7~7.0，具有一定的耐热性和耐酸性。该菌在普通琼脂、血平板、巧克力琼脂的培养基上均不生长，生长时需要L-半胱氨酸、甲硫氨酸和三价铁离子等，在活性炭-酵母浸出液琼脂（BCYE）培养基上可形成整齐、表面光滑的菌落。菌落颜色可见白色、紫色、蓝色、绿色、深褐色、灰绿色、深红色等，在紫外灯照射下，菌落可发出荧光。军团菌一直未被发现，原因之一就在于该菌有较高的营养要求，人工培养及其困难，被成为“苛养菌”。

[0004] 军团菌最初是在美国发现的，对自然环境因素抵抗力较强，主要是引起呼吸道传染疾病，可通过气溶胶的方式在空气中散布，人类会因为吸入含菌的气溶胶而感染，引起军团病（Legionnaires disease，LD）。目前已知军团菌有52个种70多个血清型，能引起人类 疾病的约有20种。常见的有嗜肺军团菌（Legionellapneumophila，LP）、 米氏军团菌（Legionella micdadei）、 博氏军团菌（Legionella bozemanii）、 菲氏军团菌（Legionellafeeleii）、 杜莫夫军团菌（Legionella dumoffii）和 长滩军团菌（Legionella longbeachae）等。

[0005] 嗜肺军团菌是引起军团病的主要病原菌，而米克戴德军团菌位列第二。米克戴德军团菌是一种兼性胞内致病菌，广泛存在于天然淡水环境或人工水域中，能入侵阿米巴原虫和人体巨噬细胞，是引起军团病的重要病原体。吸入肺部的米克戴德军团菌，被巨噬细胞吞噬并在其胞内增殖，破出后再感染其他巨噬细胞，反复感染可引起严重的非典型肺炎。

[0006] 随着分子技术特别是PCR技术的发展，许多分子生物学方法被用于军团菌分子分型和流行病学研究。目前已用于军团菌分型的4种常用分子分型技术为：随机扩增多态性 DNA (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、脉冲场凝胶电泳( Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE)、扩增片 段长度多态 性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)、核酸测序分型(Sequence-based typing，SBT)。由于其一次即可分离出大量DNA片段，且具有操作简便，重复率好等优势，先后用于军团菌分子分型和流行病学调查。

[0007] 聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，简称PCR技术)作为微生物检测的技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需2个小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供一种对米克戴德军团菌的wzx 基因特异的核苷酸，所述核苷酸为：

[0009] 1）SEQ ID NO:1所示的核苷酸和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸；

[0010] 2）与1）所示的核苷酸互补的核苷酸。其中与SEQ ID NO:1互补的序列SEQ ID NO:3，其核酸序列为：TAAAGCATTTGGAAACTGAAGG；与SEQ ID NO:2互补的序列SEQ ID NO:4（互补），其核酸序列为：CTTGGGCTTATGCACTGA。

[0011] 上述核苷酸可以用于制备检测米克戴德军团菌的wzx基因的PCR试剂盒、基因芯片或微阵列；所述米克戴德军团菌可以取样于自来水、矿泉水、空调冷却水的培养物的粗提液，或是米克戴德军团菌的纯培养物的粗提液等，均采用常规的酚氯仿法制备。

[0012] 本发明进一步公开了PCR试剂盒在制备用于检测米克戴得军团菌方面的应用。其主要指的是军团菌目军团菌属中的一个种，即Legionella micdeida。

[0013] 本发明还提供一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括上述的核苷酸；其中所述的PCR引物优选为如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸。

[0014] SEQ NO:1 ATTTCGTAAACCTTTGACTTCC 特异扩增米克戴德军团菌的wzx 基因上游引物

[0015] SEQ NO:2 GAACCCGAATACGTGACT特异扩增米克戴德军团菌的wzx 基因下游引物[0016] 上述多重PCR检测试剂盒可以包括如下试剂：

[0017] 10 mM dNTP 20μL；10×酶特异性反应缓冲液50μL；

[0018] 5 U/μL 耐热DNA聚合酶 8μL；引物各10μL；

[0019] 阳性对照品10μL，阴性对照品10μL；ddH2O 5mL。

[0020] 上述针对米克戴德军团菌的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理—扩增—电泳检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。

[0021] 本发明还提供一种基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸优选为如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸（见实例4）。

[0022] 由上述的技术方案可见，本发明建立的一种PCR反应体系，可检测米克戴德军团菌，该试剂盒有如下优点：

[0023] （1）方法简便，周期短、速度快、可操作性强: 本发明所配制的PCR试剂盒配制方法简便，检测速度快、周期短，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却较低，市场应用前景广。本发明PCR试剂盒若用米克戴德军团菌的悬液进行PCR扩增，与经提取得到的DNA作为模板扩增所得结果一致，且敏感度和特异性无差别，可省去模板DNA的提取步骤，使操作方法得以简化。同时，相比常规生化检测方法而言，本方法所采用的待测样品可以直接是临床样品培养液，或者对检测样品进行简单分离培养就可进行检测，因而节省了物力人力。

[0024] （2）检测灵敏度高：本发明提供的PCR检测试剂盒及其检测方法敏感性高，检测精度高，可以检测到1ng/μL的DNA模板。对常见致病菌可以进行全面、系统、准确的检测与鉴定。

[0025] （3）检测成本相对较低：可以推广应用于食品卫生监督、环境监测、商品检验检疫等领域，并为其他不同致病菌检测组合提供技术模式。

[0026] （4）准确性高：本发明根据米克戴德军团菌的wzx 基因的特异核苷酸序列，设计出引物。从而利用引物组合成复合PCR检测体系，能够直接将米克戴德军团菌与其他近源菌分开。

[0027] 附图说明：

[0028] 图1为本发明的试剂盒检测两株米克戴得军团菌结果图，其中：1为米克戴得军团菌G2823；2为米克戴得军团菌G3415；M为DL2000 DNA marker；

[0029] 图2为本发明试剂盒检测军团菌属非米克戴得军团菌电泳结果图，其中：1，米克戴得军团菌 G2823；2，长滩军团菌G3416；3，博兹曼军团菌G3417；4，迈氏军团菌G4759；5，费菲军团菌G4642；6，杜莫夫军团菌G3418；7，嗜肺军团菌G2817；8，安氏军团菌G28626；9，戈尔曼军团菌G2827；10，乔丹河军团菌G4758； M，DL2000 DNA marker；

[0030] 图3 为本发明试剂盒检测其它种属近源菌种标准菌株电泳结果图，其中：1，米克戴得军团菌 G2823；2，志贺氏菌 ；3，铜绿色假单胞菌；4，沙门氏菌；5，奇异变形杆菌；6金黄色葡萄球菌；M，DL2000 DNA marker；

[0031] 图4为芯片点制示意图。

[0032] 具体实施方式：

[0033] 为保证本发明的上述和其它目的特征和优点更明白易懂，下面特举较佳实施例，同时结合说明书附图及具体实例对本发明进一步详细描述。

[0034] 实施例1：

[0035] 基因组的提取

[0036] （1）在超净工作台中，从菌种保藏管中吸取少量菌液，划线接种到军团菌BCYE生长平板上，37℃，5.0% CO2培养5-7天。

[0037] （2）向BCYE生长平板中加入2mL无菌水，用无菌圆头玻璃棒轻轻刮起菌苔，然后将菌悬液吸到1.5 mL离心管中，8000 rpm离心5分钟，弃上清，重复洗一次。

[0038] （3）加入250 μL 50 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)重悬，12000 rpm离心5分钟，弃上清。

[0039] （4）加入250 μL 50 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)重悬，再加10 μL 0.45M EDTA(pH 8.0)，充分悬浮，37℃温浴20分钟。

[0040] （5）加入10 μL 20 mg/mL溶菌酶，37℃温浴20分钟。

[0041] （6）加入1.5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，轻柔混匀。

[0042] （7）加入15 μL 10%SDS，50℃水浴2小时至溶液澄清，期间轻轻颠倒混匀若干次。

[0043] （8）加2 μL 20 mg/mL RNAse，65℃水浴30分钟。

[0044] （9）用剪去尖头的枪头将上述溶液移到新的洁净离心管中。

[0045] （10）在通风橱中加入250 μL苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混匀，12000 rpm，4℃离心10分钟，上清液转移到新的离心管，重复一次。

[0046] （11）在通风橱中加入250 μL氯仿：异戊醇（24：1），充分混匀，12000 rpm，4℃离心10分钟，上清液转移到新的离心管。

[0047] （12）加入2.5倍体积的提前预冷的无水乙醇，轻摇，于-80℃沉淀DNA。12000 rpm ，4℃离心15 min。

[0048] （13）用1 mL 70%冰乙醇洗涤DNA沉淀，然后在65℃，10 min烘干。

[0049] （14）用30 μL TE溶解，并于-20 °C冰箱备用。

[0050] 用1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果，同时用NanoDrop2000 OD仪测量DNA的纯度和浓度。

[0051] 实施例2：

[0052] 引物的设计

[0053] 米克戴得军团菌全基因组是由本实验室破译的，同时其O-抗原基因簇序列也是本实验室自测的，通过比对分析，选取wzx 基因作为该菌的特异靶基因，针对米克戴得军团菌的wzx基因的特异区设计引物；如表1所示，上游引物是5’- ATTTCGTAAACCTTTGACTTCC -3’，见序列SEQ ID NO:1；下游引物是5’- GAACCCGAATACGTGACT-3’，见序列SEQ ID NO:2。

[0054] 表1 米克戴得军团菌的特异引物序列

[0055]

[0056] 实施例3：

[0057] 特异引物的筛选

[0058] 收集了2株米克戴得军团菌的标准菌株， 9株军团菌属其他菌株、5株近缘菌验证引物的特异性，菌株编号和来源见下表2。

[0059] 表2 供试的标准菌株

[0060]

[0061] PCR体系为10 μM 引物0.3 μL、10×buffer 2.5 μL、10 mM dNTP 0.25 μL、5 U/μL Taq 聚合酶0.2 μL及3 μL的待测样品模板到0.2 mL的薄壁PCR管中，最后用ddH2O补足至25 μL。所用引物在两株米克戴得军团菌的模板中得到阳性结果，在其它组中没有得到任何PCR产物带，所以这些寡核苷酸片段是高度特异的。

[0062] 实施例4：

[0063] 基因芯片的点制

[0064] 1.引物的设计

[0065] 上游引物是5’- ATTTCGTAAACCTTTGACTTCC -3’，见序列SEQ ID NO:1；

[0066] 下游引物是5’- GAACCCGAATACGTGACT-3’，见序列SEQ ID NO:2。

[0067] 2.引物的订购与回溶

[0068] 引物的订购是由上海英骏生物技术有限公司合成。引物合成后以干粉管的形式[0069] 保存，使用时，首先对干粉管12000rpm，20℃离心10min，目的是将管壁的干粉离心到管底。然后，引物干粉管上的nmol数加入10倍nmol数体积的TE（pH 8.0）溶液回溶，回溶后在涡旋震荡器上震荡，使其充分溶解。然后800rpm，5s离心。作为引物原液放置于-20℃保存。使用时加入10倍体积的无菌水稀释使用。

[0070] 3.探针的设计

[0071] 3.1 探针的设计方法

[0072] 探针的设计是根据wzx序列的显著特异性来进行目标菌株的鉴定，将获得的wzx[0073] 序列放入MEGA3.1比对软件进行序列比对，根据比对结果找出差异明显的序列部分，特异序列应当不仅仅在检测范围内菌株之间相互特异，同时，也要比较是否和近缘种之间是否有交叉。特异序列作为探针的标准为长度设计在25-35个碱基之间，比对序列的差异碱基分布要均匀，每种待检测菌均需要设计5条左右探针以供筛选。为了增加探针的长度，在设计好的探针5’ 端连接碱基T至总长度40个碱基，同时，对其5’ 端进行氨基化的修饰。

[0074] 3.2探针的订购与回溶

[0075] 探针是通过北京奥科公司进行合成，合成时设计好的探针5’ 端连接碱基T至总长度40个碱基，同时，对其5’ 端进行氨基化的修饰。

[0076] 探针点至芯片上需要的浓度为1000 ng/μL，因此应对其进行稀释。步骤如下：

[0077] 将含有探针的干粉管12000 rpm，20℃离心5 min，目的是将管壁的干粉离到管底。

[0078] 在超净台中用50%DMSO溶液溶解探针干粉，加入订购OD数×20 μL的50%DMSO，振荡至溶解，然后室温下静置2 h。

[0079] 取溶解好的溶液1 μL，用NanoDrop OD仪测OD260，再加入DMSO使其终浓度为1 μg/μL。

[0080]

[0081] 4. 基因芯片的点制

[0082] 将探针固定到玻片上是利用芯片点样仪，要求探针浓度为1 μg/μL，步骤如下：

[0083] 取10 μL溶解好的探针加入384孔板上，放在点样仪的样品台上。

[0084] 在放置好的醛基化玻片上进行上样、预点样、正式点样、清洗和干燥五个过程，每一条探针都要在芯片上连续重复3次点样。

[0085] 将点制好的芯片在室温下干燥过夜，再于45℃烘箱干燥2 h。

[0086] 在紫外交联仪下交联后，避光保存。

[0087] 5 .基因芯片的检测

[0088] 5.1 PCR扩增

[0089] 表3 PCR扩增体系

[0090]

[0091]

[0092] 使用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，验证条带是否为目的条带。

[0093] 5.2 标记

[0094] 将PCR扩增产物进行第二次PCR，达到标记的目的。

[0095] 表4第二次PCR扩增体系

[0096]

[0097] PCR条件和第一次PCR扩增时条件相同。

[0098] 5.3 芯片杂交

[0099] 将第二次PCR产物开盖，置于65 ℃烘箱中，烘2 h左右。

[0100] 打开杂交炉，设置温度为45℃，在杂交炉内，用18 μL的-2杂交液回溶烘干后的产物（杂交液提前预热），混匀时用移液枪反复吹吸，但不产生气泡为准。

[0101] 用100 μL无菌水加到杂交仓底部，维持一定的湿度，将芯片放入杂交仓中，有标签一面朝上，盖上盖片。

[0102] 将回溶后产物加到盖片上的小孔中，目的是回溶产物能够和芯片上探针区域充分接触，避免气泡的出现。

[0103] 盖上盖子，密封，放入45℃水浴中杂交12 h，将杂交好的芯片在洗液A中洗涤3 min，洗液B中洗涤3 min，洗液C中洗涤90 s，最后吹风机吹干或室温晾干。

[0104] 洗液的配方：

[0105] 洗液A：1×SSC，10%SDS

[0106] 洗液B：0.05×SSC

[0107] 洗液C：95%乙醇

[0108] 5.4 扫描和分析

[0109] 打开Genepix Personal 4100A型生物芯片扫描仪和电脑开关，开启后，双击[0110] GenePix Pro 6.0软件图标，预热扫描仪，待扫描仪启动结束。

[0111] 打开扫描仪盖子，将待扫芯片标签面朝下放入芯片槽中，盖上盖子。

[0112] 点击软件粗扫图标，对芯片进行粗扫，然后用选取框选取精扫区域，精扫操作。

[0113] 存取图片，格式为JPG、TIF格式

[0114] 取出芯片，先关闭GenePix Pro6.0软件程序，再关闭生物芯片扫描仪，最后关闭电脑。

[0115] 实施例5：

[0116] PCR检测试剂盒

[0117] 一、检测实验所需材料及设备的准备

[0118] 1. 试剂盒组成：

[0119] 1）dNTP（10mM） 50μL

[0120] 2）10×buffer（10×酶特异性反应缓冲液） 300μL

[0121] 3）MgCl2 （25mM） 300μL

[0122] 4）Taq 聚合酶（5 U/μL） 5μL

[0123] 5）引物混合物（5 μM） 70μL

[0124] 6）阳性对照品（KP） 10μL

[0125] 7）阴性对照品（KN） 10μL

[0126] 8）ddH2O 5mL

[0127] 每个试剂盒可用于检测10个样品。

[0128] 其中10×buffer 、dNTP、Taq 聚合酶由宝生物工程（大连）有限公司提供；引物混合物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；

[0129] 使用上述PCR检测试剂盒进行米克戴得军团菌检测的方法包括以下步骤：

[0130] (1)待测环境样品模板的提取:

[0131] 环境样品模板通常为痰、血、胸水肺组织、支气管抽提物、矿泉水取样、自来水取样、空调冷却水取样等的培养物的粗提液，或是米克戴得军团菌的纯培养物的粗提液，或是纯DNA，或者是阳性对照品和阴性对照品。

[0132] 用1.5 mL 50 mM Tris-HCl (pH8.0) 刮取培养物，在12000 rpm条件下离心1分钟，去掉上清液；用500 μL的ddH2O重悬沉淀，在12000 rpm条件下离心5分钟，去掉上清液，倒干；用100 μLddH2O重悬沉淀，在100℃沸水中水浴10分钟；再置于冰上10分钟后，在12000 rpm条件下离心2分钟；用5 μL中层上清做为PCR反应的模板。

[0133] （2）在PCR薄壁管中加入dNTP、10×酶特异性反应缓冲液、Taq聚合酶、引物、待测样品模板和ddH2O，混匀，将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：

[0134] 94℃ 5分钟

[0135] 94℃ 30秒

[0136] 58℃ 40秒

[0137] 72℃ 30秒 回到第二步，共35个循环

[0138] 72℃ 5分钟

[0139] （3）在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果

[0140] ①取3μL扩增产物与10×溴酚蓝上样缓冲液以9：1的体积比混合；

[0141] ②将混合液上样于2％的琼脂糖凝胶上；

[0142] ③将琼脂糖凝胶电泳120V稳压电泳约15分钟，用DL2000 Marker进行对照；

[0143] ④观察并记录结果。

[0144] （4）分析并进行结果判断。

[0145] 本发明通过配制一种可检测米克戴得军团菌，可商品化生产的PCR试剂盒，将PCR检测方法需要使用的成分组合在一起，使用时，提取待测样品，同时经过简单的操作程序就能进行灵敏、快速、简便的检测，检测试剂盒中各组分的用量和浓度均为试验所得，用该试剂盒检测米克戴得军团菌所使用的试验设备简单，检测成本低。

[0146] 使用阳性和阴性对照品的目的是用于质控整个操作过程，以便得出准确的判断。

[0147] 本发明一次检测试验所使用的试剂盒中的试剂量见下表5所示，DNA模板量为0.5μL。

[0148] 表5一次检测试验所使用的试剂盒中的试剂量

[0149]成分 浓度 加样量（μL）
ddH2O - 18
10×酶特异性反应缓冲液 10× 2.5
MgCl2 25mM 2.5
dNTP 10mM 0.25
P-1 10μM 0.5
P-2 10μM 0.5
Taq酶 5U/μl 0.25

[0150] 本发明中的耐热DNA聚合酶为Taq聚合酶。

[0151] 2.仪器设备

[0152] SANYO高压灭菌锅（SANYO公司）；T Gradient PCR仪（Biometra公司）；

[0153] 各种型号移液器（Eppendorf公司）；Sigma1-13K离心机（Sigma公司）；5804R高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；ND-2000 NanoDrop OD仪器（ NanoDrop公司）；SIM-F124制冰机（日本SANYO）；超纯水净化系统（Milli-Q）；凝胶成像仪（UVP公司）和0.2mL PCR薄壁管。

[0154] 3.待测样品的提供

[0155] 本发明所用实验菌株如表1和表2所示。

[0156] 二、检测实施的具体操作：将上述16株标准菌株在同样条件下采用本发明所提供的PCR检测试剂盒进行PCR方法的检测。

[0157] 1. 待测样品模板的提取

[0158] A.针对标准菌株

[0159] 1）20μL接菌量，无菌操作，划线接种于BCYE培养基中， 37℃、5%CO2培养2-3天；

[0160] 2）用50mM Tris-HCl(pH8.0)刮取菌落，12000rpm离心5分钟，去上清。

[0161] 3）用500μL ddH2O重悬沉淀，12000rpm离心5分钟，去上清，尽量空干。

[0162] 4）用100μL ddH2O重悬沉淀，混匀，100℃沸水浴10分钟，

[0163] 5）置冰上10分钟后，12000rpm离心2分钟。

[0164] 6）取5μL中层上清做为PCR反应的模板。

[0165] B．针对环境培养物（痰、血、胸水肺组织、支气管抽提物、矿泉水、自来水、空调冷凝水等）

[0166] 1）用50mM Tris-HCl(pH8.0)刮取菌落，12000rpm离心5分钟，去上清。

[0167] 2）用500μLddH2O重悬沉淀，12000rpm离心5分钟，去上清，尽量控干。

[0168] 3）用100μLddH2O重悬沉淀，混匀，100℃沸水浴10分钟，

[0169] 4）置冰上10分钟后，12000rpm离心2分钟。

[0170] 5）取5μL中层上清做为PCR反应的模板。

[0171] 2. 用微量移液器分别吸取PCR试剂盒中5μM 引物0.4μL，25mM的10×buffer2.5μL、10mM的dNTP 0.25μL，5 U/μL Taq 聚合酶0.25μL及5μL的待测样品模板到
0.2mL的薄壁PCR管中，最后用ddH2O补足至25μL，充分混匀；

[0172] 3. 将混合物高速离心数秒后在PCR仪上依下列温度和时间进行扩增：94℃ 5分钟1个循环；94℃ 40秒，58℃ 40秒，72℃ 30秒，35个循环；72℃ 5分钟 1个循环。

[0173] 4. 在电泳设备中电泳PCR扩增产物，记录结果。

[0174] 1）取3μL扩增产物与10×溴酚蓝上样缓冲液混合；

[0175] 2）将混合液上样于1.5％的琼脂糖凝胶上；

[0176] 3）将琼脂糖凝胶经120V电压稳压电泳约10分钟，用DL2000 Marker进行对照；

[0177] 4）观察前沿溴酚蓝指示剂迁移至距加样孔至少3cm停止电泳，在凝胶成像仪上观察并记录试验结果。

[0178] 5. 依据如下条件进行结果判断米克戴得军团菌应在889bp处有一条带。

[0179] 阳性对照和阴性对照试验只要将待测样品模板换成米克戴得军团菌阳性模板和米克戴得军团菌阴性模板（含大肠杆菌）即可，含有米克戴得军团菌的样品模板具有889bp片段，不含米克戴得军团菌的样品模板无此片段。电泳结果记录见图1-3所示：所有标准菌株除米克戴得军团菌有889bp片段外，其他菌株均无扩增产物。这说明采用PCR检测方法可排除假阳性反应，根据有无以上片段进行的米克戴得军团菌的检测鉴定，检测准确度提高了，避免了因检测失误而导致的损失。

[0180] 利用上述实验步骤得到的杂交试剂盒，可用于检测米克戴得军团菌。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。