一种检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒，属于生物技术和动物传染病诊断研究领域。该试剂盒包含有：包被抗CSFV-Erns单克隆抗体及抗CSFV-E2单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、CSFV阳性对照和CSFV阴性对照、洗涤液、生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体及生物素化兔抗CSFV-E2多克隆抗体混合液、酶标链霉亲和素、酶显色底物和终止液。其中，两种单克隆抗体与对应的多克隆抗体所针对的抗原表位不同。本发明的试剂盒采用生物素-亲和素检测系统，并对猪瘟病毒Erns及E2蛋白联合检测，大大提高了猪瘟病毒检测的灵敏度、特异性和可重复性，可用于对猪瘟的诊断及研究工作。

权利要求

1.一种检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒，其特征在于包含有：包被抗CSFV-Erns单克隆抗体及抗CSFV-E2单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、CSFV阳性对照和CSFV阴性对照、洗涤液、生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体及生物素化兔抗CSFV-E2多克隆抗体混合液、酶标链霉亲和素、酶显色底物和终止液；所述的抗CSFV-Erns单克隆抗体、抗CSFV-E2单克隆抗体和兔抗CSFV-Erns多克隆抗体、兔抗CSFV-E2多克隆抗体是采用原核表达的CSFV-Erns及CSFV-E2重组抗原分别免疫Balb/c小鼠和家兔得到；

CSFV-Erns及CSFV-E2重组抗原的制备包含如下步骤：

(1)以猪瘟病毒的RNA为模板使用如下引物分别PCR扩增CSFV-Erns和CSFV-E2片段，Erns(F)：5’-CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3’，Erns(R)：5’-CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3’；

E2(F)：5’-CGGGATCCCGTCTAGCCTGCAAGGAAG-3’，E2(R)：5’-CGCTCGAGTAGATCTTCATTTTCCACTGTGG-3’；

(2)通过限制性内切酶及DNA连接酶将CSFV-Erns和CSFV-E2片段分别连接到pET30a载体上构建重组质粒pET30a-Erns和pET30a-E2-N；

(3)将重组质粒pET30a-Erns和pET30a-E2-N分别转化到含有表达伴侣蛋白GroEL的PGrO7重组质粒的BL21中进行原核表达得到CSFV-Erns及CSFV-E2重组抗原；表达条件为：在含10μg/mL的卡那霉素和20μg/mL的氯霉素的LB培养液中，于37℃、180rpm将细菌培养至OD＝0.2；加入伴侣蛋白的诱导剂四环素和L-阿拉伯糖，四环素和L-阿拉伯糖的终浓度分别为5ng/mL、1mg/mL，37℃、180rpm继续将细菌培养至OD＝1.0；加入终浓度为0.5mM的IPTG，30℃、180rpm诱导过夜。

2.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒，其特征在于：所述的酶标板包被的两种单克隆抗体的量均为0.01～0.05μg；所述的生物素化多克隆抗体混合液中两种抗体的浓度均为10μg/mL。

3.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒，其特征在于：所述的酶标链霉亲和素的浓度为10μg/mL；所述的抗CSFV-Erns单克隆抗体与兔抗CSFV-Erns多克隆抗体所针对的抗原表位不同；抗CSFV-E2单克隆抗体与兔抗CSFV-E2多克隆抗体所针对的抗原表位不同。

4.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒，其特征在于：所述的样品稀释液为含1％BSA、0.1％深海鱼明胶、0.02％叠氮化钠的0.01mol/L，pH7.2～7.4的PBS。

5.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒，其特征在于：所述的CSFV阳性对照为预先用样品稀释液100倍稀释的猪瘟病毒感染过的猪血清；

所述的CSFV阴性对照为预先用样品稀释液100倍稀释的未感染过的猪瘟病毒的猪血清。

6.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒，其特征在于：所述的洗涤液为含0.5％Tween20的0.1mol/L，pH 7.2～7.4的PBS，使用前用去离子水稀释10倍。

7.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒，其特征在于：所述的酶显色底物为即用型单一溶液TMB显色液；所述的终止液为1mol/L的H2SO4溶液。

8.权利要求1-7任一项所述的检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将待测样品用样品稀释液按1:1稀释，每孔100μL加入酶标板中，同时阳性对照及阴性对照各加2孔设置对照；

(2)加样完成后，混匀孔中样品，37℃孵育1小时；

(3)弃去孔中溶液，洗涤液清洗3～5次，最后拍干；

(4)每孔加入生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体混合液100μL，37℃孵育30min；

(5)重复步骤(3)，每孔加入酶标链霉亲和素100μL，37℃孵育30min；

(6)重复步骤(3)，每孔加入酶显色底物100μL，室温避光反应10-15分钟；

(7)每孔加入100μL终止液，将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值；

所述试剂盒判定标准为：检测中CSFV阳性对照的OD值与CSFV阴性对照的OD值之差大于0.4时，检测被认为有效；Cut off＝阴性对照光吸收值OD450nm×2.1倍，样品值＝样品光吸收值OD450nm/CO值，其中，样品值＞1为阳性；样品值≤1为阴性；

该使用方法不用于疾病的诊断。

说明书

一种检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术和动物传染病诊断研究领域，具体涉及一种检测猪瘟病毒（CSFV）Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒。

背景技术

[0002] 猪瘟是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种高度接触性传染病，对养猪业危害严重，是世界粮农组织和各国政府严密监控和检疫的主要传染病之一。

[0003] CSFV属黄病毒科瘟病毒属成员，是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小约12.3kb，仅含有一个大的开放性阅读框架（ORF）。此ORF翻译成含3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工成结构蛋白和非结构蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为Npro、C、Erns（E0）、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中，除C、Erns、E1和E2为结构蛋白外.其余均为非结构蛋白。

[0004] 猪感染CSFV后主要产生针对结构糖蛋白E0、E2和非结构蛋白NS3的抗体。糖蛋白E0和E2是病毒诱导机体产生中和抗体的两个主要保护性抗原，同时也是病毒吸附进入敏感细胞的必需蛋白。

[0005] Erns，是病毒的一种囊膜糖蛋白，也称gp44/48，旧称E0。有9个可能的糖基化位点，去糖基的蛋白骨架分子量约26KDa，由病毒ORF中Glu268-Ala494组成。在感染细胞中Erns在内质网内积累，并可存在于细胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中Erns以97KDa的同源二聚体形式存在于囊膜表面。由于其分子内缺乏疏水的膜锚定区，与病毒囊膜结合力弱，易从囊膜上游离下来。Erns可诱导产生猪瘟的中和抗体，免疫猪可诱导产生对致死量CSFV的保护性免疫。由于编码Erns的核酸序列在属内比编码E2的序列保守程度高，因此Erns可作为防治猪瘟的一种靶蛋白。

[0006] E2为CSFV的另一囊膜糖蛋白，又称为gp55，是病毒主要的抗原蛋白，也是三个病毒糖蛋白中保守性最低、最易变异的分子。E2常以100kDa的同源二聚体及与E1形成75kDa的异源二聚体形式存在于病毒粒子及CSFV感染的细胞表面。E2可诱导产生CSFV的中和抗体，免疫猪可诱导产生对致死量CSFV的保护性免疫。E2的蛋白骨架由370个氨基酸（ORF编码的657-1062氨基酸残基）组成，并以其C端的40个疏水氨基酸锚定在膜上。由于糖基化程度不同，E2的分子量可为51-58kDa。E2的抗原决定区在其N端部分（ORF编码的第690-866氨基酸），可分为2个独立的抗原结构单元，四个抗原结构域A、B、C、D。

[0007] 猪瘟病毒的快速检测对于猪瘟的诊断具有特别重要的意义。目前猪瘟病毒检测方法主要有应用病毒分离鉴定、免疫组织化学法、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和Elisa检测等。其中Elisa检测法以其快速、方便、敏感等优点，在众多方法中脱颖而出。但市场中的Elisa试剂盒只有检测单一抗原的试剂盒，在样品保存不理想时会出现假阴性结果。

发明内容

[0008] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒。该试剂盒通过对猪瘟病毒Erns及E2蛋白进行联合检测，大大提高了猪瘟病毒检测的灵敏度、特异性和可重复性；同时，由于采用生物素-亲和素检测系统（BAS），进一步提高了试剂盒的灵敏度和稳定性，避免了假阴性出现的可能。

[0009] 本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的使用方法。

[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0011] 一种检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒，包含有：包被抗猪瘟病毒Erns蛋白（CSFV-Erns）单克隆抗体及抗猪瘟病毒E2蛋白（CSFV-E2）单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、CSFV阳性对照和CSFV阴性对照、洗涤液、生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体及生物素化兔抗CSFV-E2多克隆抗体混合液、酶标链霉亲和素、酶显色底物和终止液。

[0012] 所述的酶标板包被的两种单克隆抗体的量优选均为0.1～0.5μg。

[0013] 所述的多克隆抗体混合液中两种抗体的浓度均优选为10μg/mL。

[0014] 所述的单克隆抗体和多克隆抗体是采用原核表达的CSFV-Erns及CSFV-E2重组抗原分别免疫Balb/c小鼠和家兔得到。其中，CSFV-Erns及CSFV-E2重组抗原的制备包含如下步骤：

[0015] （1）以猪瘟病毒的RNA为模板使用如下引物分别PCR扩增CSFV-Erns和CSFV-E2片段，

[0016] Erns(F)：5’-CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3’，

[0017] Erns(R)：5’-CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3’，Erns(F) 和 Erns(R) 扩 增CSFV-Erns片段；

[0018] E2(F)：5’-CGGGATCCCGTCTAGCCTGCAAGGAAG-3’，

[0019] E2(R)：5’-CGCTCGAGTAGATCTTCATTTTCCACTGTGG-3’，E2(F)和E2(R)扩增CSFV-E2片段。

[0020] （2）通过限制性内切酶及DNA连接酶将CSFV-Erns和CSFV-E2片段分别连接到pET30a载体上构建重组质粒pET30a-Erns和pET30a-E2-N。

[0021] （3）将重组质粒pET30a-Erns和pET30a-E2-N分别转化到含有PGrO7重组质粒表达伴侣蛋白GroEL的BL21（DE3）（购自Taraka公司）中进行原核表达得到CSFV-Erns及CSFV-E2重组抗原。

[0022] 优选的，所述的抗CSFV-Erns单克隆抗体与兔抗CSFV-Erns多克隆抗体所针对的抗原表位不同；抗CSFV-E2单克隆抗体与兔抗CSFV-E2多克隆抗体所针对的抗原表位不同。

[0023] 所述的酶标链霉亲和素的浓度优选为10μg/mL。

[0024] 所述的样品稀释液优选为含1%BSA、0.1%深海鱼明胶、0.02%叠氮化钠的0.01mol/L，pH7.2～7.4的PBS。

[0025] 所述的CSFV阳性对照优选为用样品稀释液100倍稀释的猪瘟病毒感染过的猪血清。

[0026] 所述的CSFV阴性对照优选为用样品稀释液100倍稀释的未感染过的猪瘟病毒的猪血清。

[0027] 所述的洗涤液优选为含0.5%Tween20的0.1mol/L，pH7.2～7.4的PBS，使用前用去离子水稀释10倍。

[0028] 所述的酶显色底物优选为TMB显色液。

[0029] 所述的终止液优选为1mol/L的H2SO4溶液。

[0030] 上述检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

[0031] （1）将待测样品用样品稀释液按1:1稀释，每孔100μL加入酶标板中，同时阳性对照及阴性对照各加2孔设置对照；

[0032] （2）加样完成后，混匀孔中样品，37℃孵育1小时；

[0033] （3）弃去孔中溶液，洗涤液清洗3～5次，最后拍干；

[0034] （4）每孔加入生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体混合液100μL，37℃孵育30min；

[0035] （5）重复步骤（3），每孔加入酶标链霉亲和素100μL，37℃孵育30min；

[0036] （6）重复步骤（3），每孔加入酶显色底物100μL，室温避光反应10-15分钟；

[0037] （7）每孔加入100μL终止液，将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值。

[0038] 所述试剂盒判定标准为：检测中阳性对照（PC）血清的OD值与阴性对照（NC）血清的OD值之差必须大于0.4时，检测被认为有效；Cut off（CO值）= 阴性对照光吸收值OD450nm×2.1倍，样品值= 样品光吸收值OD450nm/CO值，其中，样品值＞1为阳性；样品值≤1为阴性。

[0039] 本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

[0040] （1）本发明由于使用了BAS-Elisas检测系统，大大提高了试剂盒的灵敏度和稳定性。

[0041] （2）本发明通过双抗原来联合检测猪瘟病毒，大大提高了猪瘟病毒检测的灵敏度、特异性和可重复性，因此较市场上常规试剂盒更加灵敏，避免了假阳性的出现，可用于对猪瘟病毒感染的诊断及研究工作。

[0042] （3）本发明通过采用即用型单一溶液TMB显色液，较常规试剂盒所用双组分显色液使用更加便利，结果更稳定。

附图说明

[0043] 图1是重组猪瘟病毒（CSFV）Erns及E2蛋白小量表达SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为全菌裂解液，泳道2为裂解液上清。

具体实施方式

[0044] 下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0045] 实施例1猪瘟病毒Erns及E2重组蛋白的制备

[0046] （1）根据NCBI GeneBank中猪瘟病毒石门株全基因组序列（登录号AF333000.1），以猪瘟病毒石门株囊膜蛋白Erns全序列及E2主要抗原区B/C区和D/A区的基因序列为模板设计合成引物，二者引物分别为：

[0047] Erns(F)：5’-CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3’，

[0048] Erns(R)：5’-CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3’，

[0049] E2(F)：5’-CGGGATCCCGTCTAGCCTGCAAGGAAG-3’，

[0050] E2(R)：5’-CGCTCGAGTAGATCTTCATTTTCCACTGTGG-3’。

[0051] 其中，下划线部分为引入的酶切位点，Erns(F)为CSFV-Erns基因上游扩增引物，引入的酶切位点为BamHI，Erns(R)为CSFV-Erns基因下游扩增引物，引入的酶切位点为XhoI；E2(F)为CSFV-E2基因上游扩增引物，引入的酶切位点为BamHI，E2(R)为CSFV-E2基因下游扩增引物，引入的酶切位点为XhoI。

[0052] （2）以从猪瘟病毒石门株中提取的RNA为模板进行PCR扩增，获取Erns及E2蛋白目的基因。

[0053] （3）构建重组表达载体：将表达质粒pET30a用限制性内切酶（同上述引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒（购自Invitrogen公司）回收载体大片段；将上述PCR扩增出的目的基因双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下与载体大片段。

[0054] （4）将步骤（3）中所得连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp/Kan或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，菌落PCR初步鉴定。

[0055] （5）重组表达载体的鉴定：提取质粒，进行双酶切鉴定，获得了约为680bp及530bp的DNA片段，与预期的CSFV-Erns（681bp）及CSFV-E2主要抗原区（531bp）大小一致。将酶切片段与预期相符的CSFV-Erns及CSFV-E2阳性克隆送至华大基因公司测序，结果显示插入的位置、方向、大小、读码框及核苷酸序列均正确，将以上两种重组质粒命名为pET30a-Erns及pET30a-E2-N。

[0056] （6）含伴侣蛋白感受态表达宿主菌的制作：为了提高CSFV-Erns及CSFV-E2在上清表达的几率，将测序正确的重组质粒pET30a-Erns及pET30a-E2-N分别转化到含有PGrO7重组质粒表达伴侣蛋白GroEL的BL21（DE3）（购自Taraka公司）感受态细胞中。

[0057] （7）小量诱导表达：挑取转化平板上的单菌落接种到3mL LB培养液（含10μg/mL的卡那霉素和20μg/mL的氯霉素）中，37℃、180rpm将细菌培养至OD=0.2；加入伴侣蛋白的诱导剂四环素（终浓度5ng/mL）和L-阿拉伯糖（终浓度1mg/mL），37℃、180rpm继续将细菌培养至OD=1.0；加入终浓度为0.5mM的IPTG，30℃、180rpm诱导过夜。

[0058] （8）表达蛋白的鉴定：将诱导过夜的宿主菌收集、破碎，进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后，经染色和脱色后发现，诱导表达的pET30a-Erns重组菌在60KD处有明显的伴侣蛋白GroEL表达，在26KD处有明显的重组蛋白Erns表达，说明表达成功；诱导表达的pET30a-E2-N重组菌在60KD处有明显的伴侣蛋白GroEL表达，在20KD处有明显的重组蛋白E2表达，说明表达成功（图1）。

[0059] （9）重组CSFV-Erns及CSFV-E2蛋白的大量诱导表达：将含有正确表达载体的大肠杆菌接种于大量培养液中以小量诱导相同条件诱导表达，培养结束后离心收集菌液，超声波裂解菌液菌液澄清或疏散状态；11000rpm、4℃离心30min，将上清与沉淀分离，保存于4℃。分别取上清与沉淀样品进行SDS-PAGE，发现重组CSFV-Erns及CSFV-E2均在上清表达。

[0060] （10）重组CSFV-Erns及CSFV-E2蛋白的纯化：Ni-NTA琼脂糖柱（Qiagen，货号30210）按说明书说明纯化。

[0061] 实施例2抗猪瘟病毒Erns蛋白（CSFV-Erns）多克隆抗体及抗猪瘟病毒E2蛋白（CSFV-E2）多克隆抗体的制备及生物素标记

[0062] （1）将实施例1纯化的重组CSFV-Erns及CSFV-E2蛋白分别免疫实验用家兔，三免后7天采血检测Elisa效价，达到兔血清效价达到1:100000后，进行冲击免疫，7天后采集兔血清；

[0063] （2）以重组CSFV-Erns及CSFV-E2蛋白分别偶联CNBr-activated Sepharose4B beads（购自GE），制备抗原亲和纯化层析柱；

[0064] （3）将步骤（1）制得的兔血清用步骤（2）制得的亲和纯化层析柱纯化，获得兔抗CSFV-Erns多克隆抗体及兔抗CSFV-Erns多克隆抗体；

[0065] （4）将步骤（1）制得的兔抗CSFV-Erns多克隆抗体及兔抗CSFV-Erns多克隆抗体以0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH9.0）或0.5mol/L硼酸缓冲液（pH8.6）稀释到2-5mg/mL；

[0066] （5）将活化的生物素（Sulfo-NHS-Biotin，购自Thermo，货号21425），以去离子水溶解，并与步骤（4）稀释的抗体混合，在室温下反应1-3小时；

[0067] （6）在4℃条件下，以0.01mol/L、pH7.2-7.4的PBS充分透析反应混合物或以脱盐柱脱盐，除去游离的生物素，即得生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体。

[0068] （7）将步骤（6）制得生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体以Bradford法测定浓度，然后按2mg每支的规格将两种生物素化抗体分别进行分装，并冻干保存备用。

[0069] 实施例3抗猪瘟病毒Erns蛋白（CSFV-Erns）单克隆抗体及抗猪瘟病毒E2蛋白（CSFV-E2）单克隆抗体的制备

[0070] （1）将实施例1纯化的重组CSFV-Erns及CSFV-E2蛋白分别免疫Balb/c小鼠，三免后，取Elisa效价达到1:10000的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，以HAT培养基37℃、饱和湿度、5%CO2培养融合细胞。

[0071] （2）融合后第四天开始观察集落，待集落生长至孔底约1/6时半量换HT培养基，次日分别以重组CSFV-Erns及CSFV-E2蛋白包板进行间接Elisa检测，挑选出阳性孔进行亚克隆。

[0072] （3）亚克隆：以常规有限稀释法进行亚克隆。亚克隆板第5天以CSFV阳性血清1:1000包板进行间接Elisa检测，挑选出阳性孔转入24孔板进行第二次亚克隆（二亚）。

[0073] （4）二亚第5天，取培养上清同步进行免疫荧光（IF）及以下五种Elisa检测：

[0074] A.以重组CSFV-Erns及CSFV-E2蛋白包板的间接Elisa检测；

[0075] B.以CSFV阳性血清1:1000包板的间接Elisa检测；

[0076] C.先以CSFV-Erns中和抗CSFV-Erns的阳性孔上清、以CSFV-E2中和抗CSFV-E2的阳性孔上清，将中和后的上清进行B检测；

[0077] D.先以CSFV-E2中和抗CSFV-Erns的阳性孔上清、以CSFV-Erns中和抗CSFV-E2的阳性孔上清，将中和后的上清进行B检测；

[0078] E.以实施例2制得的兔抗猪瘟病毒Erns蛋白（CSFV-Erns）多克隆抗体及兔抗猪瘟病毒E2蛋白（CSFV-E2）多克隆抗体分别包板，以CSFV-Erns及CSFV-E2重组作为中间抗原进行的阻断Elisa检测。

[0079] （5）最终分别筛选出同时满足免疫荧光（IF）阳性及A、B、D、E检测阳性，C检测阴性的抗CSFV-Erns细胞株及抗CSFV-E2的细胞株。此两株杂交瘤细胞即为可识别猪瘟病毒Erns蛋白的细胞株及E2蛋白的的细胞株，同时二者又与实施例2制得的兔抗猪瘟病毒Erns蛋白（CSFV-Erns）多克隆抗体及兔抗猪瘟病毒E2蛋白（CSFV-E2）多克隆抗体所针对的抗原表位不同。

[0080] （6）细胞株冻存及腹水制备：将上述成功建株的两株杂交瘤细胞株进行冻存，同时5 6
各打3只小鼠制备腹水，每只小鼠腹腔注射细胞量为5×10～1×10 个/0.5mL。

[0081] （7）将制得的小鼠腹水以辛酸硫酸铵沉淀法纯化，透析，制得抗猪瘟病毒Erns蛋白（CSFV-Erns）单克隆抗体及抗猪瘟病毒E2蛋白（CSFV-E2）单克隆抗体。

[0082] 实施例4检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒的制备

[0083] （1）试剂盒中溶液的配制：

[0084] 1）包被缓冲液（0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）：准确称取1.59g碳酸钠，2.93g碳酸氢钠，加蒸馏水至1000mL。

[0085] 2）样品稀释液：在0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中加入1%（m/v）BSA、0.1%（m/v）深海鱼明胶、0.02%（m/v）叠氮化钠（NaN3）配制而成。

[0086] 3）浓缩洗涤液（10×）：在0.1mol/L，pH7.2～7.4的PBS中加入体积比为0.5%的Tween20，使用前以去离子水稀释10倍备用。

[0087] 4）终止液：取54.3mL浓度为95%的浓硫酸，加蒸馏水至1000mL，制成浓度为1mol/L的H2SO4溶液。

[0088] （2）抗猪瘟病毒Erns蛋白（CSFV-Erns）单克隆抗体及抗猪瘟病毒E2蛋白（CSFV-E2）单克隆抗体的包被：将实施例3中所纯化的抗体以包被缓冲液稀释成1μg/mL，取等量抗猪瘟病毒Erns蛋白（CSFV-Erns）单克隆抗体及抗猪瘟病毒E2蛋白（CSFV-E2）单克隆抗体混匀，两种单抗终浓度均为0.5μg/mL，每孔加此单抗混合液100μL，4℃包被过夜。

[0089] （3）酶标板的封闭：用5%的BSA（以0.01mol/L，pH7.2～7.4的PBS配制）封闭，每孔150μL，37℃温育1h，洗涤2～-3次，拍干。

[0090] CSFV阳性对照的制备：采集猪瘟病毒感染过的猪血清，以样品稀释液100倍稀释。

[0091] CSFV阴性对照的制备：采集未感染过的猪瘟病毒的健康猪血清，以样品稀释液100倍稀释。

[0092] （4）生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体混合液制备：取实施例2中制得的生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体冻干品，分别以1mL50%甘油溶解成2mg/mL。然后将溶解好的两种生物素化多抗各取100μL加入样品稀释液至20mL，制备成生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体混合工作液。

[0093] （5）酶标链霉亲和素制备：所述酶标链霉亲和素为终浓度为10μg/mL的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，该酶标链霉亲和素可以商购，或按本领域常规方法——过碘酸钠法将HRP标记于链霉亲和素。其步骤是：称取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06mol/L NaIO4水溶液0.5mL，混匀置冰箱4度反应30分钟，取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL，于室温避光反应30分钟后加入含5mg链霉亲和素（Strepavidin）的水溶液1mL，混匀并装透析袋与0.05mol/L，pH9.5碳酸盐缓冲液缓慢搅拌透析6h或过夜，使之结合。然后吸出加入NaBH4溶液（5mg/mL）0.2mL，置冰箱2h，取出加入等体积饱和硫酸铵。放冰箱30min后离心，将所得沉淀物溶于少量0.02mol/L、pH7.4PBS中，并透析过夜。次日再离心除去不溶物，即得酶标链霉亲和素。用0.02mol/L、pH7.4PBS加至5mL进行测定后，冷冻干燥保存。使用时，以含1%BSA、0.01mol/L pH7.4的PBS稀释成10μg/mL备用。

[0094] （4）酶显色底物：为购自Sigma的商用即用型单一溶液TMB显色液（货号：T8665）。

[0095] 实施例5猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒的检测方法

[0096] 利用本发明（实施例4）的检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒在检测猪瘟病毒中的应用，其步骤是：

[0097] （1）从试剂盒中取出酶标板，将待测血清或其它样品用样品稀释液按1:1稀释，每孔100μL加入酶标板中，同时阳性对照及阴性对照各加2孔设置对照；

[0098] （2）加样完成后，轻振酶标板混匀孔中样品，37℃孵育1小时；

[0099] （3）弃去孔中溶液，洗涤液清洗3～5次，最后一次在吸水纸上拍干；

[0100] （4）每孔加入生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体混合液（10μg/mL）100μL，37℃孵育30min；

[0101] （5）重复步骤（3），每孔加入酶标链霉亲和素（10μg/mL）100μL，37℃孵育30min；

[0102] （6）重复步骤（3），每孔加入TMB显色液100μL，室温避光反应10-15分钟；

[0103] （7）每孔加入100μL终止液，将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值（OD450nm）。

[0104] 本发明试剂盒判定标准为：检测中阳性对照（PC）血清的OD值与阴性对照（NC）血清的OD值之差必须大于0.4时，检测被认为有效；Cut off（CO值）= 阴性对照光吸收值OD450nm×2.1倍，样品值= 样品光吸收值OD450nm/CO值，其中，样品值＞1为阳性；样品值≤1为阴性。

[0105] 实施例6本发明试剂盒的特异性、灵敏度和稳定性测试

[0106] （1）特异性检测

[0107] 按实施例5所述的检测方法，利用实施例4制得的试剂盒分别检测猪瘟病毒（CSFV）感染的血清、猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV，又称猪蓝耳病毒）感染的血清、猪圆环病毒2型（PCV2）感染的血清、猪伪狂犬病毒（PRV）感染的血清、猪乙型脑炎病毒（JEV）感染的血清和猪瘟病毒阴性血清。

[0108] 每种血清平行加样三个孔，测定OD450nm值，计算其OD450nm平均值。结果如下表所示：

[0109]

[0110] 由上表可见，OD450nm(PC)-OD450nm(NC)=1.619 ＞0.4，表 示 结 果有 效；CO 值=OD450nm(NC)×2.1=0.181，PRRSV、PCV2、PRV、JEV的抗体阳性血清和CSFV阴性血清OD450平均值均小于CO值，为阴性；猪瘟抗体阳性血清OD450平均值大于CO值，为阴性。表示无交叉反应的产生，特异性为100%。

[0111] （2）灵敏度检测

[0112] 按实施例5所述的检测方法，利用实施例4制得的试剂盒分别检测不同稀释度的猪瘟病毒（CSFV）感染的血清。将猪瘟病毒（CSFV）感染的血清用样品稀释液以如下梯度稀释 1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120、1:10240、1:20480进行检测。每个梯度平行加样3个孔，测定OD450nm值，计算其OD450nm平均值。结果如下表所示：

[0113]

[0114] 由上表可见，OD450nm(PC)-OD450nm(NC)=1.697 ＞0.4，表 示 结 果有 效；CO 值=OD450nm(NC)×2.1=0.172，由上表可知，CSFV感染的血清稀释2500倍时，本发明的试剂盒仍可有效检测到阳性。可见本发明的试剂盒敏感度较高。

[0115] （3）稳定性检测

[0116] 1）批内差检测：按实施例5所述的检测方法，随机抽取3盒利用实施例4制得的试剂盒进行检测。结果如下表所示：

[0117]

[0118] 由上表可见，3个试剂盒OD450nm(PC)与OD450nm(NC)差值均大于0.4，表示结果有效。

[0119] 取上表阳性对照数据及阴性对照数据分别计算OD450平均值（X）和标准差（SD），从而计算变异系数，检验其批间重复性。结果如下表所示，3个试剂盒OD450nm(PC)与OD450nm(NC)的变异系数均小于10%，检测结果具有很好的批间重复性。

[0120]

[0121] 2）批间差检测：按实施例5所述的检测方法，随机抽取3批在不同时间利用实施例4制得的试剂盒进行检测。结果如下表所示：

[0122]

[0123]

[0124] 由上表可见，3个试剂盒OD450nm(PC)与OD450nm(NC)差值均大于0.4，表示结果有效。

[0125] 取上表阳性对照数据及阴性对照数据分别计算OD450平均值(X)和标准差（SD），从而计算变异系数，检验其批间重复性。结果如下表所示，3个试剂盒OD450nm(PC)与OD450nm(NC)的变异系数均小于10%，检测结果具有很好的批间重复性。

[0126]

[0127] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。