药理学活性物质的持续释放脂质预浓缩物和含有其的药物组合物

摘要

本发明公开了持续释放脂质预浓缩物，其包含：a)具有带有至少两个以上‑OH(羟基)基团的极性头的脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯；b)磷脂；和c)具有带有三酰基或碳环结构的15至40个碳原子的疏水部分的、无离子化基团的液晶硬化剂。脂质预浓缩物在没有水性流体时作为液相存在并且在水性流体存在时形成液晶。此外，本发明提供了还包括药理学活性成分加预浓缩物的药物组合物。

权利要求

1.持续释放脂质预浓缩物，其包含：

a)脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯，所述脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯在极性头上具有两个以上-OH(羟基)基团并且具有式1的结构：其中：

R1是OH；R2是OH或具有一个或多个不饱和键的4至30个碳原子的烷基酯；并且R3是具有一个或多个不饱和键的4至30个碳原子的烷基酯；

b)磷脂，所述磷脂含有4至30个碳原子的饱和或不饱和的烷基酯基团；和c)液晶硬化剂，所述液晶硬化剂选自由下列组成的组：甘油三酯、棕榈酸视黄酯、生育酚乙酸酯、胆甾醇、苯甲酸苄酯和它们的混合物，其中所述脂质预浓缩物在没有水性流体时作为液相存在并且在水性流体存在时由所述液相转变为凝胶的液晶，其中所述脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯选自由下列组成的组：脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇单亚油酸酯、脱水山梨醇单棕榈油酸酯、脱水山梨醇单肉豆蔻脑酸酯、脱水山梨醇倍半油酸酯，脱水山梨醇倍半亚油酸酯、脱水山梨醇倍半棕榈油酸酯、脱水山梨醇倍半肉豆蔻脑酸酯、脱水山梨醇二油酸酯、脱水山梨醇二亚油酸酯、脱水山梨醇二棕榈油酸酯、脱水山梨醇二肉豆蔻脑酸酯和它们的混合物，其中组分a)与组分b)的重量比为10:1至1:10，并且其中所述组分a)和b)的总量与所述组分c)的重量比是100:1至1:1。

2.权利要求1的持续释放脂质预浓缩物，其中所述脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯选自由下列组成的组：脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇单亚油酸酯、脱水山梨醇单棕榈油酸酯、脱水山梨醇单肉豆蔻脑酸酯和它们的混合物。

3.权利要求1的持续释放脂质预浓缩物，其中所述磷脂含有4至30个碳原子的饱和或不饱和烷基酯基团并且选自由下列组成的组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、鞘磷脂和它们的混合物。

4.权利要求1的持续释放脂质预浓缩物，其中所述液晶硬化剂选自由下列组成的组：甘油三酯、棕榈酸视黄酯、生育酚乙酸酯、胆甾醇和它们的混合物。

5.权利要求1的持续释放脂质预浓缩物，其中所述液晶硬化剂是生育酚乙酸酯。

6.权利要求1至5中任一项的持续释放脂质预浓缩物，其中组分a)与组分b)的重量比为

5:1至1:5。

7.权利要求1至5中任一项的持续释放脂质预浓缩物，其中所述组分a)和b)的总量与所述组分c)的重量比是50:1至2:1。

8.药物组合物，所述药物组合物包含：d)药理学活性成分，所述药理学活性成分选自由下列组成的组：蛋白质、肽、疫苗、基因、非肽激素、合成的化学药物，以及它们的组合，加上权利要求1至5中任一项的持续释放脂质预浓缩物。

9.权利要求8的药物组合物，其中所述组分a)与所述组分b)的重量比为5:1至1:5。

10.权利要求8的药物组合物，其中所述组分a)和b)的总量与所述组分c)的重量比为

50:1至2:1。

11.权利要求8的药物组合物，所述药物组合物在制剂中，所述制剂选自由下列组成的组：软膏剂、凝胶剂、胶囊剂、片剂、喷雾剂、吸入剂和贴剂。

12.权利要求8的药物组合物，所述药物组合物在制剂中，所述制剂是液体。

13.权利要求12的药物组合物，其中所述液体选自由下列组成的组：注射剂、洗剂、混悬剂和滴眼剂。

说明书

药理学活性物质的持续释放脂质预浓缩物和含有其的药物组

合物

技术领域

[0001] 本发明涉及药理学活性物质的持续释放脂质预浓缩物和包含其的药物组合物。

背景技术

[0002] 持续释放制剂被设计成以预定速率释放单一剂量的药理学活性物质以便将所述物质在血流中的有效血浆浓度保持特定时期，从而使由多剂量引起的副作用最小。

[0003] PLGA[聚乳酸-乙醇酸共聚物]是由美国食品和药物管理局(FDA)批准用于持续释放的当前使用的可生物降解材料的代表。美国专利号5,480,656报道，经由PLGA在体内经过特定时期降解成乳酸和乙醇酸持续释放药理学活性物质。然而，PLGA的酸性降解产物引起炎症，减少细胞生长(K.Athanasiou,G.G.Niederauer和C.M.Agrawal,Biomaterials(生物材料),17,93(1996))。

[0004] 对于持续释放，必须注射其中包括药物的直径为10～100微米的PLGA固体颗粒。PLGA固体颗粒的注射伴有疼痛或炎症，因为直径为10～100微米的固体颗粒应当通过皮下注射或肌肉注射施用并且经过长达数月的时期在注射部位降解。因此，需要新的持续释放制剂，所述持续释放制剂在改进的患者顺应性情况下供应有效血浆浓度的药理学活性物质达延长的时期。

[0005] 最终在本发明中，本发明人对于持续释放制剂的广泛而深入的研究导致了发现：脂质预浓缩物，所述脂质预浓缩物包含：a)具有带有至少两个以上-OH(羟基)基团的极性头的脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯；b)磷脂；和c)液晶硬化剂，所述液晶硬化剂不含离子化基团，具有含有三酰基或碳环结构的15至40个碳原子的疏水部分，在没有水性流体时作为液相存在并且在暴露于水性流体时转变成凝胶状液晶，表现出优异的持续释放特性，并且所述预浓缩物对于身体是安全的并且是高度可生物降解的。

[0006] 下面给出有关本发明的现有技术的描述。

[0007] 国际专利公开号WO2005/117830描述了预制剂，其包含至少一种中性二酰基脂质和/或至少一种生育酚，至少一种磷脂，和至少一种生物相容的含氧的低粘度有机溶剂的低粘度非液晶混合物。国际专利公开号WO2006/075124公开了含有至少一种二酰基甘油、至少一种磷脂酰胆碱、至少一种含氧有机溶剂和至少一种生长激素抑制素类似物的低粘度混合物的预配制剂。全部这些预制剂将药理学活性物质在体内释放两个星期或更长，但使用二酰基脂质，预制剂的必需成分作为药物赋形剂是不可用的并且必须证明它是足够安全的。与本发明的另一个区别是，发现所述出版物中使用的有机溶剂降低一些药物的活性(H.Ljusberg-Wahre,FS Nielse,298,328-332(2005)；H.Sah,Y.bahl,Journal of Controlled Release(控制释放杂志)106,51-61(2005))。

[0008] 美国专利号7,731,947公开了一种组合物，其包括：包含干扰素、蔗糖、甲硫氨酸和柠檬酸盐缓冲液的颗粒制剂，包含溶剂诸如苯甲酸苄酯的悬浮赋形剂，其中所述颗粒制剂分散在悬浮赋形剂中。在一个实施例中，描述了磷脂酰胆碱连同维生素E(生育酚)溶解在有机溶剂中并用于将颗粒制剂分散在其中。然而，该组合物不同于本发明的透明和可过滤的溶液制剂，因为该组合物用于分散固体颗粒并且不允许形成液晶。

[0009] 美国专利号7,871,642公开了制备用于递送药理学活性剂的分散体的方法，所述方法包括将磷脂、聚氧乙烯助乳化剂、甘油三酯和乙醇的均匀混合物分散在水中，其中聚氧乙烯助乳化剂选自聚乙氧基化脱水山梨醇脂肪酸酯(聚山梨醇酯)和聚乙氧基化的维生素E衍生物。通过将亲水聚合物聚氧乙烯缀合到脱水山梨醇脂肪酸酯和维生素E衍生的聚乙氧基化的脱水山梨醇脂肪酸酯和聚乙氧基化的维生素E衍生物分别在结构上完全不同于脱水山梨醇脂肪酸酯和维生素E。它们通常被用作亲水表面活性剂，利用聚氧乙烯的性质，其不同于本发明的组分。

[0010] 美国专利号5,888,533公开了用于在身体内原位形成固体可生物降解植入物的可流动组合物，其包含：非聚合的水不溶性可生物降解材料；和生物相容的有机溶剂，所述生物相容的有机溶剂至少部分地使所述非聚合的水不溶性材料溶解，并且在水或体液中是可混溶的或可分散的，并在放置在体内后能够从组合物扩散出或浸出到体液中，其中所述非聚合的材料凝结或沉淀以形成固体植入物。在该组合物中，甾醇、胆甾醇酯、脂肪酸、脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪醇与脂肪酸的酯、脂肪酸的酸酐、磷脂、羊毛脂、羊毛脂醇以及它们的混合物被描述为非聚合材料，并且使用乙醇作为溶剂。然而，与本发明的不同在于，该组合物不能形成液晶并且设计成通过水不溶性材料的简单凝结或沉淀形成固体植入物并且必然使用许多有机溶剂。

发明内容

[0011] 技术问题

[0012] 因此，本发明的目的是提供基于具有含至少两个-OH(羟基)基团的极性头的脱水山梨醇不饱和酯的脂质预浓缩物，其具有显著的高安全性和生物降解性并且以有利于剂型的注射施用的液态存在，而当暴露于水性流体时形成液晶，从而提高药物在体内的持续释放。

[0013] 本发明的另一个目的是提供脂质预浓缩物，其可在不产生疼痛或炎症(常规制剂具有的问题)的情况下注射。

[0014] 本发明的进一步的目的是提供药物组合物，所述药物组合物还含有药理学活性成分加本发明的预浓缩物。

[0015] 解决问题的方案

[0016] 根据其一个方面，本发明提供用于持续释放的脂质预浓缩物，其包含a)具有带有至少两个以上-OH(羟基)基团的极性头的脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯；b)磷脂；和c)液晶硬化剂，所述液晶硬化剂不含离子化基团，具有含三酰基或碳环结构的15至40个碳原子的疏水部分，其中所述脂质预浓缩物在没有水性流体时作为液相存在并且在水性流体存在时形成液晶。

[0017] 在本发明中有用的具有含两个以上-OH(羟基)基团的极性头的脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯由下列化学式1表示：

[0018] [化学式1]

[0019]

[0020] 其中R1是OH，R2是OH或R并且R3是R，其中R是具有一个或多个不饱和键的4至30个碳原子的烷基酯。

[0021] 在本发明中导致液晶形成的脱水山梨醇脂肪酸酯，不同于常规对应物如下列化学式2的油基甘油酸酯(OG)，植烷基甘油酸酯(PG)和甘油单油酸酯(GMO)，甘油二油酸酯(GDO，一种二酰基甘油)。即，造成液晶相的常规分子都具有由甘油或甘油酸衍生的极性头和由脂质醇或脂肪酸衍生的非极性尾组成的共同结构。

[0022] [化学式2]

[0023]

[0024] 然而，造成液晶相的常规分子由于下列缺点而稍微难以应用到药物的开发。油基甘油酸酯(OG)和植烷基甘油酸酯(PG)，虽然能够容易地形成液晶，但是由于其相对高的毒性而很少用作用于人类医药的药物赋形剂。另一方面，甘油单油酸酯可用作药用赋形剂，但具有弱的结晶性以致不能形成持续释放药剂所需的液晶。

[0025] 在如上所述的国际专利公开号WO2005/117830中使用的甘油二油酸酯是一种二酰基脂质，其中甘油充当极性头。该分子一般不用作药物赋形剂，因为其安全性尚未得到证实。此外，它的生物降解性显著差。

[0026] 作为深入和彻底研究的结果，本发明人发现，脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯相对于常规使用的液晶分子甘油或甘油酸衍生物的优点在于它们形成对于持续释放活性成分非常有效的液晶，具有优异的安全性和生物降解性，并可适用于开发克服了现有技术中遇到的问题的医疗产品。为了用于药用组合物，材料必须保证是安全且可生物降解的。另外，生物降解性对于负责体内持续释放的材料是非常重要的因素。如果将使用PLGA的持续释放注射剂设计成释放活性成分达一周，则理想的是，在注射后一周PLGA在体内降解。然而，实际上，PLGA保持不变达一至数月，甚至在持续释放的功能完成后。因此，具有优异的持续释放特性、安全性和生物降解性的本发明的脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯适用于在制药工业中具有巨大价值的新的液晶诱导材料。

[0027] 本发明的脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯的脂肪酸可以衍生自植物油(如，棕榈油、蓖麻油、橄榄油、花生油、脱硫油、玉米油、芝麻油、棉籽油、大豆油、葵花油、红花油、亚麻子油)，动物脂肪和油(例如，乳脂、猪油、牛脂等)，鲸油和鱼油。本发明的脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯可以选自脱水山梨醇单酯、脱水山梨醇倍半酯、脱水山梨醇二酯和它们的混合物。脱水山梨醇单酯是具有一个经由酯键与其结合的脂肪酸基团的脱水山梨醇分子并且可以选自脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇单亚油酸酯、脱水山梨醇单棕榈油酸酯、脱水山梨醇单肉豆蔻脑酸酯和它们的混合物。脱水山梨醇倍半酯是平均1.5个脂肪酸基团经由酯键与其结合的脱水山梨醇分子。在本发明中有用的脱水山梨醇倍半酯的代表是脱水山梨醇倍半油酸酯、脱水山梨醇倍半亚油酸酯、脱水山梨醇倍半棕榈油酸酯、脱水山梨醇倍半肉豆蔻脑酸酯和它们的混合物。脱水山梨醇二酯是具有两个经由酯键与其结合的脂肪酸基团的脱水山梨醇分子，并且可以选自脱水山梨醇二油酸酯、脱水山梨醇二亚油酸酯、脱水山梨醇二棕榈油酸酯、脱水山梨醇二肉豆蔻脑酸酯和它们的混合物。

[0028] 磷脂对于层状结构如脂质体的构成是必要的，但自身不能形成非层状相结构，如液晶。然而，磷脂可以参与脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯驱动的非层状相结构的形成，作用是稳定所得的液晶。本发明中有用的磷脂含有具有极性头的4至30个碳原子的饱和或不饱和的烷基酯基团。磷脂可以选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、鞘磷脂以及它们的混合物。磷脂发现于植物和动物如大豆和蛋中。在磷脂中，造成疏水尾的长脂肪酸烃链包括饱和脂肪酸链，如单棕榈酰基和二棕榈酰基、单肉豆蔻酰基和二肉豆蔻酰基、单月桂酰基和二月桂酰基以及单硬脂酰基和二硬脂酰基，不饱和脂肪酸链，如单亚油酰基或二亚油酰基、单油基和二油基、单棕榈油酰基和二棕榈油酰基、单肉豆蔻脑酰基和二肉豆蔻脑酰基和它们的混合物。

[0029] 液晶硬化剂自身不能形成非层状结构(液晶)，这与脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯不同，其也不能形成层状结构(脂质体)，这与磷脂不同。然而，液晶硬化剂通过增加非层状结构的曲率从而提高纳米尺度的油和水的有序共存而有助于脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯驱动的非层状相结构的形成。为了该功能，需要液晶硬化剂在其分子结构内部具有高度限定的极性部分和庞大的非极性部分。

[0030] 在实践中，可以仅通过实验“试差法”将可注射到身体中的生物相容分子选择作为本发明的液晶硬化剂。作为结果，适合于本发明组合物的液晶硬化剂具有这样的分子结构，所述分子结构彼此不同并且因而不能解释为一种分子结构。从全部选定的液晶硬化剂推断的共同结构特征是，它们没有离子化的基团，如羧基和胺基，并具有包括大的碳环结构或三酰基的15到40个碳原子的疏水部分。本发明的液晶硬化剂的优选实例可以不含离子化的基团，如羧基和胺基，并具有至多一个酯和-OH(羟基)基团作为极性头，并且具有包含大的碳环结构或三酰基的20至40个碳原子的疏水部分。本发明的液晶硬化剂的优选实例可包括，但不限于，甘油三酯、棕榈酸视黄酯、生育酚乙酸酯、胆甾醇、苯甲酸苄酯和混合物。

[0031] 在本发明的组合物中，组分a)和b)之间的重量比为10:1至1:10，并且优选为5:1至1:5。a)+b)与c)的重量比为100:1至1:1，并且优选为50:1至2:1。形成所需的液晶，这样重量比的组分保证有效的持续释放。

[0032] 如本文所用，术语“水性液体”旨在包括水和体液，如粘膜液、泪液、汗液、唾液、胃肠液、血管外液、细胞外液、间质液和血浆。当与外部环境为水性流体所占的身体表面、区域或腔(例如在体内)进行接触时，本发明的组合物经历从溶胶状液相到凝胶状液晶相的转变。即，本发明的组合物是这样的预浓缩物，其在施用到人体以前作为液态存在并且在体内转变成允许持续释放的液晶相。

[0033] 由本发明的组合物形成的液晶具有非层状相结构，其中油和水处于有序的混合物和排列中，其中在内相和外相之间没有差别。油和水的有序排列提供中间相的非层状相结构，这是液体和固体之间的物质中间体的状态。本发明的预浓缩物不同于已被广泛应用于设计药物制剂的形成层状结构如胶束、乳剂、微乳剂、脂质体和脂质双层的的常规组合物。这种层状结构是在水包油(O/W)或油包水(W/O)类型中，其中在内相和外相存在清楚的差别。

[0034] 如本文所用的术语“液体结晶”，是指在暴露于水性流体后从预浓缩物形成具有非层状相结构的液晶。

[0035] 本发明的脂质预浓缩物可在室温下由包含具有含至少两个以上-OH(羟基)基团的极性头的至少一种脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯、至少一种磷脂和至少一种液晶硬化剂的组合物制备，如果必要，通过加热或使用均化器。

[0036] 均化器可以是高压均化器、超声均化器、珠磨(bead mill)均化器等。

[0037] 如上所述，因为本发明的脂质预浓缩物可以是这样的药物组合物，其在没有水性流体时作为液相存在并在身体中在水性流体存在下形成液晶，所以它可以使用选自以下的方法施用：注射、涂敷、滴注、填充、口服施用和喷雾。并且可以将本发明的预浓缩物制成各种剂型，包括注射剂、软膏剂、凝胶剂、洗剂、胶囊剂、片剂、液体、混悬剂、喷雾剂、吸入剂、滴眼剂、粘合剂和贴剂。

[0038] 具体地，当采取注射途径时，本发明的预浓缩物可通过皮下或肌肉内注射或取决于所使用的药理学活性成分的性质的其它注射途径施用。

[0039] 适用于本发明的预浓缩物的药理学活性成分可以选自蛋白质、肽、疫苗、基因、非肽激素、合成化学品，和它们的组合。

[0040] 作为本发明的组合物中的药理学活性成分的蛋白质或肽的实例包括促红细胞生成素、生长激素(人、猪、牛等)、生长激素释放因子、神经生长因子、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、凝血因子、胰岛素、催产素、加压素、促肾上腺皮质激素、表皮生长因子、源自血小板的生长因子、催乳素、促生长素抑制素、胰高血糖素、白介素-2(IL-2)、白介素-11(IL-11)、胃泌素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素、促胰液素、降钙素、脑啡肽、内啡肽、血管紧张素、促甲状腺激素释放激素、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体、肝素酶、骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein)、hANP、胰高血糖素样肽、凝乳酶、缓激肽、杆菌肽、多粘菌素、粘菌素、短杆菌酪肽、短杆菌肽、环孢素、聚乙二醇缀合蛋白质和它们的合成类似物、单克隆抗体、酶、细胞因子以及组合，但不限于此。

[0041] 非肽激素是一类不属于蛋白质或肽的激素，并且可以选自，但不限于，睾酮、雌二醇、孕酮、前列腺素、非那雄胺(finateride)、度他雄胺(dutasteride)，其合成类似物，以及它们的组合。

[0042] 本发明的预浓缩物内包含的基因的实例包括质粒DNA、siRNA、多核苷酸、寡脱氧核苷酸、反义寡核苷酸，以及它们的混合物，但不限于此。

[0043] 合成化学品可以选自：他克莫司(tacrolimus)、阿那托唑(anatrozole)、奥氮平(olanzapine)、阿立哌唑(aripiprazole)、利培酮(risperidone)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、纳曲酮(naltrexone)、甲氨蝶呤(methotrexate)、松醇(pinitol)、奥洛他定(olopatadine)、拉坦前列素(latanoprost)、阿奈可他(anecortave)、曲普瑞林双羟萘酸盐(triptorelin pamoate)、米诺地尔(minoxidil)、替勃龙(tibolone)、索利那辛(solifenacin)、他达拉非(tadalafil)、伐尼克兰(varenicline)、罗匹尼罗(ropinirole)、芬太尼(fentanyl)、酮替芬(ketotifen)、孟鲁司特(montelukast)及其组合，但不限于此。

[0044] 因此，根据其另一个方面，本发明提供药物组合物，其包括：d)选自蛋白质、肽、疫苗、基因、非肽激素、合成化学品和它们的组合的药理学活性成分，以及本发明的脂质预浓缩物。

[0045] 关于药物组合物中使用的成分a)至c)和液晶的描述可参考关于脂质预浓缩物所给出的那些。

[0046] 此外，药物组合物的药理学活性成分d)的描述可以与关于脂质预浓缩物所给出的描述相同。

[0047] 药物组合物可以优选配制成注射剂、软膏剂、凝胶剂、洗剂、胶囊剂、片剂、液体、混悬剂、喷雾剂、吸入剂、滴眼剂、粘合剂和贴剂，但不限于此。更优选地，它可被配制成注射剂。

[0048] 本发明的药物组合物中的药理学活性成分的含量取决于其种类和所用的制剂而变化，并且其通常为0.0001至99重量％(基于药物组合物的总重量)。

[0049] 可以通过将药理学活性成分添加到本发明的预浓缩物而制备本发明的药物组合物。如果需要，热或均化器可用于本发明的药物组合物的制备，但是这不是对本发明的限制因素。

[0050] 本发明的药物组合物的剂量遵循所使用的药理学活性成分的公知的剂量，并且可根据各种因素，包括患者的病况、年龄和性别而变化。它可以经口或经肠胃外施用。

[0051] 根据其另一方面，本发明预期通过将本发明的药物组合物施用到哺乳动物(包括人)通过药理学活性成分的持续释放维持药效的方法，以及药物组合物用于药理学活性成分的持续释放的用途。

[0052] 发明的有益效果

[0053] 如迄今为止所述，基于脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯的本发明的脂质预浓缩物是高度安全的和可生物降解的，并且在不存在水性流体时作为液相存在而当在身体内暴露于水性流体后迅速转变为液晶。因此，当与药理学活性成分一起配制时，相比于固体颗粒相的常规持续释放制剂，液相的预浓缩物改善患者的顺应性并表现出优异的持续释放，且没有副作用如疼痛和炎症。

附图说明

[0054] 从下列结合附图的详述，将更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特征和其它优点，其中：

[0055] 图1显示实施例4和5以及比较例1至3的组合物的体内生物降解性。

[0056] 图2显示实施例14的组合物的体外药物释放行为；

[0057] 图3是显示实施例16和比较例5的组合物的体内药物释放行为的药代动力学特征曲线；

[0058] 图4显示实施例4和比较例4的组合物在暴露于水性流体后的相变；和

[0059] 图5以冷冻TEM显微照片显示实施例4的组合物的液晶结构。

[0060] 方面的实施方式

[0061] 下面的非限制性实施例用于说明本发明的选择实施方案。应当理解，显示的组分的要素的比例和备选物的变化对于本领域技术人员将是显而易见的并且在本发明的实施方案的范围内。

[0062] 在本发明中使用的添加剂和赋形剂满足韩国药典的要求并且购自Aldrich、Lipoid和Croda。

[0063] 实施例1-11：脂质预浓缩物的制备

[0064] 将具有含至少两个-OH基团的极性头的脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯、磷脂和液晶硬化剂以下表1中所示的重量比任选在溶剂中混合。在实施例1至4中，将成分在保持在25～45℃的水浴中用均化器(PowerGen model125.Fisher)在3,000rpm混合约10分钟。将实施例
5和6的成分在保持在30～50℃的水浴中搅拌3小时。在实施例7至11中，将成分在保持在45～75℃的水浴中用均化器(PowerGen model125.Fisher)在3,000rpm混合约20分钟。其后，将所得的脂质溶液在室温放置以在25℃进行热平衡，之后将其加载到1cc一次性注射器中。
将通过上述方法得到的脂质预浓缩物注射到水(2克蒸馏水)中并形成液晶相。

[0065] 表1

[0066]

[0067]

[0068] *LC：液晶.

[0069] 实施例12至21：含有药理学活性成分的药物组合物的制备

[0070] 将具有含至少两个-OH基团的极性头的脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯、磷脂和液晶硬化剂以下表2中所示的重量比混合。

[0071] 在实施例12至15中，将成分在保持在30～60℃的水浴中使用均化器(PowerGen model125.Fisher)在3,000rpm混合约10分钟。在实施例16至21中，将成分在保持在25～50℃的水浴中使用均化器(PowerGen model125.Fisher)在3,000rpm混合约5分钟。将所得的脂质溶液在室温下放置以在25℃造成热平衡，随后向其中加入药理学活性成分。作为药理学活性成分，使用基因药物siRNA(Bioneer)和荧光缀合的siRNA(Invitrogen，Block-iT Fluorescent oligo)、肽药物艾塞那肽(exenatide)(Teva)以及合成的药物坦洛新(tamsulosin)(Lekpharmaceuticals)。随后，使用均化器将成分在3,000rpm均化约5分钟以得到在溶液相中的药物组合物。在基因药物(siRNA，荧光缀合的siRNA)的情况中，将其以表2中所示的量与在蒸馏水中的脱乙酰壳多糖的溶液一起混合以形成复合物，之后施用到脂质溶液。

[0072] 表2

[0073]

[0074]

[0075]

[0076] 比较例1至4

[0077] 在比较例1至3中，二油基甘油酯(一类二酰基甘油酯)以表3中所示的量与磷脂酰胆碱、生育酚和/或乙醇一起使用，然后在均化器(PowerGen model125.Fisher)中以3,000rpm均化约10分钟。

[0078] 在比较例4中，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、磷脂酰胆碱和生育酚乙酸酯以表3中所示的量使用，接着在均化器中以3,000rpm均化约30分钟。这里，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯具有取代了脱水山梨醇极性头上的-OH基团的聚氧乙烯基并且不同于本发明中使用的脱水山梨醇单油酸酯。由于大的聚氧乙烯部分，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯通常用作亲水表面活性剂或乳化剂。

[0079] 表3

[0080]

[0081]

[0082] 比较例5

[0083] 向1mL生理盐水加入20μg的艾塞那肽，接着在室温下均化。

[0084] 实验例1：体外安全的比较

[0085] 本发明的组合物的安全性是通过执行如下的提取集落测定细胞毒性试验体外检测的。在18mL补充有10％胎牛血清的Eagle最低必需培养基(EMEM)中，提取2克实施例1、4和比较例1和2的组合物中的每个。将L929细胞(小鼠成纤维细胞，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection))以1×102个细胞/孔的密度接种到6孔板中并在5％CO2加湿培养箱中在37℃温育24小时。将提取物稀释在EMEM(0、5、25、50％)中，然后以
2mL/孔的量与稳定化的L929细胞接触放置。在5％CO2加湿培养箱中在37℃温育7天以后，将细胞用10％福尔马林溶液固定并用Giemsa溶液染色以计数集落。结果总结在下面的表4中。

[0086] 表4

[0087]

[0088] *相对集落形成率(％)＝测试培养基上的集落数/0％培养基上的集落数×100(％)

[0089] **提取物培养基％＝提取物培养基/(稀释培养基+提取物培养基)×100(％)[0090] 如从表4可以看出，相比于施用比较例1和2的组合物的那些，施用实施例1和4的组合物的组在全部稀释培养基(5％、25％和50％)上显示显著高的细胞生长率，说明本发明的组合物(脂质预浓缩物)远比常规组合物(国际专利公开号WO2005/117830中公开的)更安全。

[0091] 实验例2：体内生物降解性的比较

[0092] 在下面的实验中评价本发明的组合物的体内生物降解性。将实施例4和5的组合物中的每个以400mg的剂量皮下注射到SD大鼠的背部，并进行监测达预定的时间。为了比较，以相同方式测试比较例1至3的组合物。注射后两周给注射部位拍照并且示于图1中。

[0093] 如图1中可以看到，观察到实施例4和5的组合物大部分被生物降解，几乎不产生刺激的感觉，而比较例1至3的组合物保持它们的原始体积的三分之一至三分之二。

[0094] 因此，相对于比较例1至3的组合物(国际专利公开号WO2005/117830)，实施例4和5的组合物表现显著高的生物降解性。

[0095] 供参考，已知广泛地用于持续释放的常规材料PLGA[聚乳酸-乙醇酸共聚物]即使在两个或三个月后在体内也保持未降解。

[0096] 因此，本发明的脂质预浓缩物克服的问题是，即使在其完全释放药物后，常规载体系统由于其低的生物降解性仍然保持在体内。

[0097] 实验例3：持续释放的体外试验

[0098] 在下列试验中在体外检验本发明的组合物的药物释放行为。将前列腺癌细胞(前列腺癌-3，韩国细胞系银行)以5×104个细胞/孔的密度接种到transwell板并在5％CO2增湿培养箱中在37℃温育2天。将实施例14的组合物以100mg的量加入到含有3mL的补充有10％胎牛血清的RPMI1640的transwell插入物。使用荧光显微镜(Eclipse Ti-S，尼康)测定从实施例14的组合物发射的荧光，同时每24小时将插入物施用到transwell板达7天。其结果示于图2中。

[0099] 使用微分干涉相衬(DIC)显微术拍摄图2的左侧的照片，而右侧的照片显示荧光缀合的siRNA的细胞内摄取。如从图2中的数据所理解，本发明的组合物不变地释放药理学活性成分达至少7天。

[0100] 实验例4：持续释放的体内试验

[0101] 在以下试验中体内检验本发明的组合物的药物释放行为。将实施例16的组合物以对应于140μg/kg的艾塞那肽的剂量皮下注射到6只9周龄、平均体重为300g的SD大鼠(雄性)中。

[0102] 使用市售的试剂盒(免疫测定试剂盒，Bachem)监测取自SD大鼠的血浆样品中的艾塞那肽浓度达14天，以画出PK特征曲线(profile)(药代动力学特征曲线)，如图3中所示。为了比较，以对应于10μg/kg的艾塞那肽的剂量施用比较例5的组合物(在本文中，实施例16的艾塞那肽的剂量为比较例5的艾塞那肽的剂量的14倍的原因是，持续释放制剂的1周剂量(7天)对应于一般注射剂量的14倍(因为每天使用两次))。

[0103] 如图3中所示，相比于作为一般注射的比较例1的组合物，实施例16的组合物使生物活性成分的体内半衰期增加约25倍，证明其优异的持续释放效果(在图3中，绘制6只大鼠所取的测量的平均)。

[0104] 实验例5：药理作用的体内试验

[0105] 在以下试验中评价本发明的组合物的药理学作用。将含有可诱发体重减轻的艾塞那肽(抗糖尿病药)的实施例16的组合物以对应于140μg/kg艾塞那肽的剂量皮下注射到6只9周龄、平均体重为300克的SD大鼠(雄性)中。在第0天和第14天计算平均重量并且结果在下表5中给出。

[0106] 表5

[0107]  实施例16(g) 生理盐水(g)
第0天 303 308
第14天 356 379
重量改变(％)* 75 100

[0108] (*重量改变(％)＝施用实施例16的组合物(g)的组的重量改变/施用生理盐水(g)的组的重量改变×100)

[0109] 如表5中所示，相比施用生理盐水的组的重量，施用实施例16的组合物的组经历了约25％的重量损失达两周。因此，通过持续释放的体内试验，本发明的持续释放组合物确保生物活性成分的长效体内药理学效力以及显著增加的半衰期(实验例4)。

[0110] 实验例6：水性流体中液晶的形成

[0111] 在以下试验中评价本发明的组合物在水相中形成液晶的能力。在加载到注射器以后，将实施例4和比较例4的组合物滴入到2g的PBS(pH 7.4)中并且结果示于图4中。

[0112] 基于具有含至少两个-OH(羟基)基团的极性头的脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯(脱水山梨醇单油酸酯)的实施例4的组合物在不存在水性流体时作为液相存在，但是在暴露于水性流体后形成液晶。另一方面，基于聚氧乙烯脱水山梨醇不饱和脂肪酸酯(聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)的比较例4的组合物在PBS中作为液相存在并分散，但即使在暴露于水性流体后也不形成液晶。因此，在水性流体存在下，如在体内的环境中，仅本发明的组合物迅速形成有助于持续释放效果的液晶。

[0113] 在液晶内，存在大量类似于莫比乌斯带的纳米尺寸(20nm以下)的双连续水通道。水通道被双连续的脂质层环绕。因此，一旦脂质组合物形成半固相的液晶，药理学活性物质可以仅在它已经通过大量水通道和脂质层以后从液晶结构释放，这提高了药理学活性物质的持续释放效果。因此，本发明的组合物可以应用到持续释放药物制剂。

[0114] 实验例7：使用冷冻TEM测定液晶的内部结构

[0115] 在以下实验中检验了本发明的组合物的液晶的内部结构。将液相的实施例4的组合物滴至2克水以产生液晶结构。使用均化器，使水相中的液晶充分分散并在室温保持在平衡态直到分析。将稀释的液晶吸附到网格(grid)上并冷冻，随后在冷冻透射电子显微镜(Cryo TecaiF20G2，FEI)中检验结构。结果示于图5中。

[0116] 如在图5的照片中所示，观察到液晶具有晶体结构如立方相或六角相。一般，层状结构如胶束、乳剂、微乳、脂质体等，通常以完整的球形状态存在，而根据本发明的组合物的非层状结构采取具有一定角度的有序形式，这相当不同于球体形式。

[0117] 虽然关于一个或多个实施说明并描述了本发明，其它技术人员在阅读和理解该说明书和附图时将想到等效的改变和修改。此外，虽然本发明的特定特征可能已经仅相对于数个实现中的一个所披露，这样的特征可以与如可能是期望的和有利于任何给定或特定的应用的其它实现的一个或多个其它特征结合。