甘草次酸衍生物及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN201410035372.8
文献号 : CN103772477B
文献日 : 2015-07-08
发明人 : 仇文卫 , 易正芳 , 刘明耀 , 高成 , 代付军 , 崔海伟 , 彭世鸿 , 贺源 , 王雪 , 熊莉
申请人 : 华东师范大学
摘要 :
本发明公开了一种式(I)所示甘草次酸衍生物及其制备方法，将甘草次酸依次通过Jones试剂氧化、C-2位甲酰化、成环、酰胺化等反应合成了在甘草次酸的C-2、C-3位稠合吡唑环，及通过修饰吡唑环，得到本发明甘草次酸衍生物。本发明还提供了甘草次酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
权利要求 :
1.一种甘草次酸衍生物，其特征在于，其结构如式(I)所示：
其中，R＝-H、-SO2Me、-Ac、
2.如权利要求1所述的甘草次酸衍生物，其特征在于，所述甘草次酸衍生物如式(4)所示：
3.如权利要求1所述的甘草次酸衍生物，其特征在于，所述甘草次酸衍生物如式(5)、(6)所示：
4.如权利要求1所述的甘草次酸衍生物，其特征在于，所述甘草次酸衍生物如式(12)、(13)、(14)、(15)、(16)所示：
5.一种甘草次酸衍生物的制备方法，其特征在于，以甘草次酸为原料，经氧化反应、甲酯化反应、甲酰化反应、关环反应后，得到如式(4)所示的甘草次酸衍生物；所述制备方法的反应路线如以下：
6.一种甘草次酸衍生物的制备方法，其特征在于，以式(4)所示的甘草次酸衍生物为原料，在DMAP催化下，酰胺化反应得到如式(5)或式(6)所示的甘草次酸衍生物；其中，与甲磺酰氯反应得到式(5)所示的甘草次酸衍生物，与醋酐反应得到式(6)所示的甘草次酸衍生物；所述制备方法的反应路线如下：
7.一种甘草次酸衍生物的制备方法，其特征在于，N,N-羰基二咪唑与哌啶酸衍生物在DMAP催化下，与式(4)所示的甘草次酸衍生物反应，分别得到化合物7、8、9、10、11，再通过三氟化硼乙醚脱去Boc保护基，得到式(12)、(13)、(14)、(15)、(16)所示的甘草次酸衍生物；其中，所述哌啶酸衍生物选自于N-Boc-3-哌啶甲酸、N-Boc-4-哌啶甲酸、N-Boc-4-哌啶乙酸、N-Boc-4-哌啶丙酸、N-Boc-4-哌啶丁酸；所述制备方法的反应路线如下：
8.如权利要求1-4任一项所述的甘草次酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述甘草次酸衍生物抑制肿瘤细胞迁移、抑制肿瘤细胞增殖。
说明书 :
甘草次酸衍生物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药及其制备和应用的技术领域，具体涉及一种甘草次酸衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
[0002] 甘草次酸是甘草的主要有效成分之一，近年来，其抗肿瘤活性受到了广泛关注。研究表明，甘草次酸可以通过诱导肿瘤细胞凋亡与分化，以及抑制肿瘤细胞侵袭等途径发挥抗癌作用，并能与许多化疗药物协同发挥抗癌功效，同时对于促癌剂诱发的癌变也表现出一定的抑制功能。随着甘草次酸抗肿瘤作用机制的进一步阐明，加之甘草次酸成本低廉，来源丰富，且甘草次酸对于正常细胞呈现较低毒性，以甘草次酸作为先导化合物，开发新的抗肿瘤药物越来越受到重视。
发明内容
[0003] 本发明提供一种甘草次酸衍生物，其结构如式(I)所示：
[0004]
[0005] 其中，R=-H、-SO2Me、-Ac、 n=0，1，2，3
[0006] 本发明提供的一种甘草次酸衍生物，如式(4)所示，其中，R=-H：
[0007]
[0008] 本发明提供的一种甘草次酸衍生物如式(5)所示，其中，R=-SO2Me。
[0009] 本发明提供的一种甘草次酸衍生物如式(6)所示，其中，R=-Ac。
[0010]
[0011] 本发明提供的一种甘草次酸衍生物如式(12)所示，其中，
[0012] 本发明提供的一种甘草次酸衍生物如式(13)、(14)、(15)或(16)所示，
[0013] 其中， n=0、1、2、3。
[0014]
[0015] 本发明还提供了甘草次酸衍生物的制备方法，包括以下：
[0016] 一、式(4)所示甘草次酸衍生物的制备路线
[0017] 以甘草次酸为原料，经氧化反应、甲酯化反应、甲酰化反应、关环反应后，得到如式(4)所示的甘草次酸衍生物；
[0018] 所述制备方法的反应路线如以下：
[0019]
[0020] 以上可见，将GA的C-3位羟基氧化为羰基得到化合物1，化合物1与碘甲烷进行甲酯化反应得到化合物2，化合物2的C-2位甲酰化得到化合物3，化合物3与水合肼反应得到如式(4)所示的甘草次酸衍生物(化合物4)。
[0021] 二、式(5)或式(6)所示甘草次酸衍生物的制备路线
[0022] 以式(4)所示的甘草次酸衍生物为原料，在DMAP催化下，酰胺化反应得到如式(5)或式(6)所示的甘草次酸衍生物。
[0023] 其中，与甲磺酰氯反应得到式(5)所示的甘草次酸衍生物，与醋酐反应得到式(6)所示的甘草次酸衍生物。
[0024] 所述制备方法的反应路线如下：
[0025]
[0026] 三、式(12)、(13)、(14)、(15)、(16)所示甘草次酸衍生物的制备方法
[0027] N，N-羰基二咪唑分别与各种哌啶酸衍生物(N-Boc-3-哌啶甲酸N-Boc-4-哌啶甲酸、N-Boc-4-哌啶乙酸、N-Boc-4-哌啶丙酸、N-Boc-4-哌啶丁酸)在DMAP催化下，与式(4)所示的甘草次酸衍生物反应，分别得到化合物7、8、9、10、11，再通过三氟化硼乙醚脱去Boc保护基，得到式(12)、(13)、(14)、(15)、(16)所示的甘草次酸衍生物。
[0028] 所述制备方法的反应路线如下，
[0029]
[0030] 本发明制备方法中，以上反应通常用薄板层析法来跟踪测定反应的完成程度，反应完毕后采用的后处理方法包括浓缩、萃取、柱层析分离等，最终产物通过核磁共振谱来验证。
[0031] 本发明还提供了甘草次酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明甘草次酸衍生物在抑制肿瘤细胞迁移、抑制肿瘤细胞增殖等具显著效果。
[0032] 本发明抗肿瘤甘草次酸衍生物及其制备方法的优点包括，通过在天然物质甘草次酸的C2-、C3-位引入吡唑环，并通过修饰吡唑环，合成了一系列新结构的甘草次酸衍生物。本发明制备方法的反应条件温和、所用试剂价格便宜、环境友好、合成路线短，合成方法简便。
[0033] 本发明制备方法中，将甘草次酸依次通过Jones试剂氧化、C-2位甲酰化、关环、酰胺化等反应合成了在甘草次酸的C-2、C-3位稠合吡唑环，及通过修饰吡唑环，从而得到本发明甘草次酸衍生物。通过该部位的结构改造，明显增强了该类化合物的抗肿瘤活性(如图1所示)。本发明甘草次酸衍生物是一类具有抗肿瘤活性的五环三萜类化合物，具有显著的抑制肿瘤细胞迁移的作用(如图2所示)。实验表明，本发明甘草次酸衍生物比甘草次酸更好地抑制肿瘤细胞的增殖活性、迁移活性，促进肿瘤细胞凋亡，可作为潜在的抗肿瘤药物，具有良好应用前景。
附图说明
[0034] 图1表示本发明甘草次酸及其衍生物16有效抑制肿瘤细胞的迁移。
具体实施方式
[0035] 结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。下述实施例中，化合物结构由核磁共振仪测定；试剂主要由上海国药化学试剂公司提供；产品纯化主要通过柱色谱，硅胶(200-300)由青岛海洋化工厂生产。
[0036] 实施例1：式(4)所示甘草次酸衍生物的制备
[0037]
[0038] 氧化反应：将20g甘草次酸溶于55mL四氢呋喃中，0℃下滴加Jones试剂35mL，在此温度下反应40分钟，然后倒入300mL水中搅拌0.5小时，抽滤，滤饼用丙酮与水的混合溶液(丙酮∶水=1∶4)洗涤，滤饼烘干得化合物1(18g，收率92％)。
[0039] 甲酯化反应：将2.0g化合物1溶于30mL DMF中，加入1.2g碳酸钾，1.3mL碘甲烷，室温反应2小时，反应液倒入100mL水中，抽滤，滤饼用50mL水洗涤，烘干得化合物2(1.8g，收率87％)。
[0040] 甲酰化反应：将0.5g化合物2溶于20mL无水四氢呋喃中，氮气保护下加入0.21g NaH(60％in oil)，室温搅拌反应0.5小时后，加入0.38g甲酸乙酯，继续反应8小时后，反应液倒入50mL1N稀盐酸溶液中，乙酸乙酯(40mL×3)萃取，合并有机层，有机相用30mL饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥后浓缩，得化合物3(0.48g，收率91％)。
[0041] 关环反应：将0.4g化合物3溶于10mL冰醋酸中，氮气保护下滴加0.5g水合肼(80％)，室温反应12小时，反应液倒入50mL水中，乙酸乙酯(40mL×3)萃取，合并有机层，有机相用50mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥、浓缩，硅胶柱层析得化合物4，即1
式(4)所示的甘草次酸衍生物(0.35g，收率88％)。H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.26(s，1H)，
5.74(s，1H)，3.75(d，J=15.3Hz，1H)，3.70(s，3H)，2.55(s，1H)，1.39(s，3H)，1.33(s，3H)，
1.25(s，3H)，1.19(s，3H)，1.15(s，3H)，1.09(s，3H)，0.83(s，3H).
式(4)所示的甘草次酸衍生物(0.35g，收率88％)。H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.26(s，1H)，
5.74(s，1H)，3.75(d，J=15.3Hz，1H)，3.70(s，3H)，2.55(s，1H)，1.39(s，3H)，1.33(s，3H)，
1.25(s，3H)，1.19(s，3H)，1.15(s，3H)，1.09(s，3H)，0.83(s，3H).
[0042] 实施例2：式(5)所示甘草次酸衍生物的制备
[0043]
[0044] 将0.2g化合物4、50mg DMAP溶于20mL无水二氯甲烷中，氮气保护下加入0.15mL甲磺酰氯，室温反应12小时，反应液浓缩，硅胶柱层析得化合物5(0.17g，73％)。
1
H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.63(s，1H)，5.74(s，1H)，3.83(d，J=15.6Hz，1H)，3.70(s，3H)，
3.22(s，3H)，2.52(s，1H)，1.39(s，3H)，1.35(s，3H)，1.29(s，3H)，1.18(s，3H)，1.15(s，3H)，
1.08(s，3H)，0.83(s，3H).
1
H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.63(s，1H)，5.74(s，1H)，3.83(d，J=15.6Hz，1H)，3.70(s，3H)，
3.22(s，3H)，2.52(s，1H)，1.39(s，3H)，1.35(s，3H)，1.29(s，3H)，1.18(s，3H)，1.15(s，3H)，
1.08(s，3H)，0.83(s，3H).
[0045] 实施例3：式(6)所示甘草次酸衍生物的制备
[0046]
[0047] 0.2g化合物4、50mg DMAP溶于20mL无水二氯甲烷中，氮气保护下加入2.0g醋酐，1
室温反应12小时，反应液浓缩，硅胶柱层析得化合物6(0.19g，收率91％)。H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.85(s，1H)，5.73(s，1H)，3.82(d，J=15.7Hz，1H)，3.70(s，3H)，2.63(s，3H)，
2.53(s，1H)，1.39(s，3H)，1.33(s，3H)，1.27(s，3H)，1.18(s，3H)，1.15(s，3H)，1.08(s，3H)，
0.83(s，3H).
室温反应12小时，反应液浓缩，硅胶柱层析得化合物6(0.19g，收率91％)。H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.85(s，1H)，5.73(s，1H)，3.82(d，J=15.7Hz，1H)，3.70(s，3H)，2.63(s，3H)，
2.53(s，1H)，1.39(s，3H)，1.33(s，3H)，1.27(s，3H)，1.18(s，3H)，1.15(s，3H)，1.08(s，3H)，
0.83(s，3H).
[0048] 实施例4：式(12)、(13)、(14)、(15)、(16)所示甘草次酸衍生物的制备[0049]
[0050] 将0.19g N，N-羰基二咪唑、0.27g N-Boc-3-哌啶甲酸溶于无水二氯甲烷中，氮气保护下室温反应0.5小时，然后加入0.2g化合物4和0.15g DMAP室温反应3小时，反应液浓缩，硅胶柱层析得化合物7。
[0051] 将上述反应所得的化合物7溶于5mL无水乙醚中，加入2mL三氟化硼乙醚溶液，室温反应0.5小时，加30mL水淬灭反应，减压脱除反应液中的乙醚，抽滤，所得滤饼用5mL乙醚打浆、抽滤，烘干后得白色固体12(0.13g，两步收率61％)，即为式(12)所示甘草次1
酸衍生物。H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.81(s，1H)，5.73(s，1H)，3.83(d，J=15.8Hz，1H)，
3.75-3.63(m，4H)，3.43(d，J=13.1Hz，1H)，3.23(d，J=11.4Hz，1H)，3.09(d，J=10.3Hz，1H)，
2.87(s，1H)，2.52(s，1H)，1.39(s，3H)，1.33(s，3H)，1.26(s，3H)，1.18(s，3H)，1.15(s，3H)，
1.08(s，3H)，0.83(s，3H).
酸衍生物。H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.81(s，1H)，5.73(s，1H)，3.83(d，J=15.8Hz，1H)，
3.75-3.63(m，4H)，3.43(d，J=13.1Hz，1H)，3.23(d，J=11.4Hz，1H)，3.09(d，J=10.3Hz，1H)，
2.87(s，1H)，2.52(s，1H)，1.39(s，3H)，1.33(s，3H)，1.26(s，3H)，1.18(s，3H)，1.15(s，3H)，
1.08(s，3H)，0.83(s，3H).
[0052] 式(13)所示甘草次酸衍生物即化合物13的制备：0.19g N，N-羰基二咪唑、0.27g N-Boc-4-哌啶甲酸溶于无水二氯甲烷中，氮气保护下室温反应0.5小时，然后加入0.2g化合物4和0.15g DMAP室温反应3小时，反应液浓缩、硅胶柱层析得化合物8；
[0053] 上步反应所得化合物8溶于5mL无水乙醚中，加入2mL三氟化硼乙醚溶液，室温反应0.5小时，加30mL水淬灭反应，减压脱除反应液中的乙醚，抽滤，所得滤饼用5mL乙醚打1
浆、抽滤，烘干后得白色固体13(0.19g，两步收率77％)。H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.82(s，
1H)，5.73(s，1H)，3.82(d，J=15.8Hz，1H)，3.76(s，1H)，3.70(s，3H)，3.25(s，2H)，2.86(t，J=11.8Hz，2H)，2.52(s，1H)，1.39(s，3H)，1.33(s，3H)，1.26(s，3H)，1.18(s，3H)，1.15(s，
3H)，1.07(s，3H)，0.83(s，3H).
浆、抽滤，烘干后得白色固体13(0.19g，两步收率77％)。H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.82(s，
1H)，5.73(s，1H)，3.82(d，J=15.8Hz，1H)，3.76(s，1H)，3.70(s，3H)，3.25(s，2H)，2.86(t，J=11.8Hz，2H)，2.52(s，1H)，1.39(s，3H)，1.33(s，3H)，1.26(s，3H)，1.18(s，3H)，1.15(s，
3H)，1.07(s，3H)，0.83(s，3H).
[0054] 式(14)所示甘草次酸衍生物即化合物14的制备：0.19g N，N-羰基二咪唑、0.29g N-Boc-4-哌啶乙酸溶于无水二氯甲烷中，氮气保护下室温反应0.5小时，然后加入0.2g化合物4和0.15g DMAP室温反应3小时后，反应液浓缩，硅胶柱层析得化合物9；
[0055] 上步反应所得化合物9溶于5mL无水乙醚中，加入2mL三氟化硼乙醚溶液，室温反应0.5小时，加30mL水淬灭反应，减压脱除反应液中的乙醚，抽滤，所得滤饼用5mL乙醚打1
浆、抽滤，烘干后得白色固体14(0.17g，两步收率68％)。H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.82(s，
1H)，5.74(s，1H)，4.17(s，1H)，3.85(d，J=16.0Hz，1H)，3.70(d，J=5.7Hz，3H)，3.60(d，J=15.4Hz，2H)，3.42(s，2H)，2.53(s，1H)，1.40(s，3H)，1.33(s，3H)，1.27(s，3H)，1.18(s，
3H)，1.16(s，3H)，1.07(s，3H)，0.84(s，3H).
浆、抽滤，烘干后得白色固体14(0.17g，两步收率68％)。H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.82(s，
1H)，5.74(s，1H)，4.17(s，1H)，3.85(d，J=16.0Hz，1H)，3.70(d，J=5.7Hz，3H)，3.60(d，J=15.4Hz，2H)，3.42(s，2H)，2.53(s，1H)，1.40(s，3H)，1.33(s，3H)，1.27(s，3H)，1.18(s，
3H)，1.16(s，3H)，1.07(s，3H)，0.84(s，3H).
[0056] 式(15)所示甘草次酸衍生物即化合物15的制备：0.19g N，N-羰基二咪唑、0.30g N-Boc-4-哌啶丙酸溶于无水二氯甲烷中，氮气保护下室温反应0.5小时，然后加入0.2g化合物4和0.15g DMAP室温反应3小时后，反应液浓缩硅胶柱层析得化合物10；
[0057] 上步反应所得化合物10溶于5mL无水乙醚中，加入2mL三氟化硼乙醚溶液，室温反应0.5小时，加30mL水淬灭反应，减压脱除反应液中的乙醚，抽滤，所得滤饼用5mL1
乙醚打浆、抽滤，烘干后得白色固体15(0.18g，两步收率71％)。H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.84(s，1H)，5.73(s，1H)，3.82(d，J=15.8Hz，1H)，3.71(s，3H)，3.56(d，J=12.4Hz，
2H)，3.13-2.93(m，4H)，2.53(s，1H)，1.40(s，3H)，1.33(s，3H)，1.27(s，3H)，1.19(s，3H)，
1.16(s，3H)，1.08(s，3H)，0.83(s，3H).
乙醚打浆、抽滤，烘干后得白色固体15(0.18g，两步收率71％)。H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.84(s，1H)，5.73(s，1H)，3.82(d，J=15.8Hz，1H)，3.71(s，3H)，3.56(d，J=12.4Hz，
2H)，3.13-2.93(m，4H)，2.53(s，1H)，1.40(s，3H)，1.33(s，3H)，1.27(s，3H)，1.19(s，3H)，
1.16(s，3H)，1.08(s，3H)，0.83(s，3H).
[0058] 式(16)所示甘草次酸衍生物即化合物16的制备：0.19g N，N-羰基二咪唑、0.32g N-Boc-4-哌啶丁酸溶于无水二氯甲烷中，氮气保护下室温反应0.5h，然后加入0.2g化合物4和0.15gDMAP室温反应3小时后，反应液浓缩硅胶柱层析得化合物11；
[0059] 上步反应所得化合物11溶于5mL无水乙醚中，加入2mL三氟化硼乙醚溶液，室温反应0.5小时，加30mL水淬灭反应，减压脱除反应液中的乙醚，抽滤，所得滤饼用5mL乙醚1
打浆、抽滤，烘干后得白色固体16(0.17g，两步收率67％)。HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.84(s，
1H)，5.73(s，1H)，3.82(d，J=15.8Hz，1H)，3.70(s，3H)，3.52(s，2H)，3.11-2.92(m，4H)，
2.53(s，1H)，1.40(s，3H)，1.33(s，3H)，1.27(s，3H)，1.19(s，3H)，1.16(s，3H)，1.08(s，3H)，
0.83(s，3H).
打浆、抽滤，烘干后得白色固体16(0.17g，两步收率67％)。HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.84(s，
1H)，5.73(s，1H)，3.82(d，J=15.8Hz，1H)，3.70(s，3H)，3.52(s，2H)，3.11-2.92(m，4H)，
2.53(s，1H)，1.40(s，3H)，1.33(s，3H)，1.27(s，3H)，1.19(s，3H)，1.16(s，3H)，1.08(s，3H)，
0.83(s，3H).
[0060] 实施例5：甘草次酸衍生物抗肿瘤细胞增殖测试
[0061] 采用SRB法对8组肿瘤细胞株HCT-116、HCT-8、HT-29、CT-26、PC-3、DU-145、MDA-MB-231、4T1进行抗增殖抑制活性测试。
[0062] 1.测试原理：SRB(磺酰罗丹明B)是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合；在540nm波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。
[0063] 2.样品测试：(1)细胞以适当的密度接种到96孔板上，经过24小时培养后，用各测试化合物的DMSO溶液处理细胞，处理时间为96小时。药物组分别用本发明式(4)、(5)、(6)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)甘草次酸衍生物。对照组用DMSO，其浓度与化合物处理组相当，最终的DMSO浓度不超过0.4％。(2)药物作用96小时后，取出培养板，加入50％TCA溶液固定细胞，4℃放置1小时后，用水冲洗5遍之后用吹风机吹干。(3)加入0.4％SRB溶液50μL／孔，染色10分钟，弃去染色液，1％冰醋酸洗涤并用吹风机吹干。(4)用100μLTris-base碱液(10mM)溶解与细胞蛋白结合的染料，采用酶标仪测定光吸收值。(5)IC50用GraphPad软件计算得到。
[0064] 各测试化合物(分别为本发明式(4)、(5)、(6)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)甘草次酸衍生物)对不同细胞株IC50值见表1。
[0065] 表1
[0066]
[0067] 表1表示甘草次酸和本发明所述化合物抗肿瘤活性数据(IC50)，由表1可见，相对于甘草次酸(GA)，本发明一系列甘草次酸衍生物包括式(4)、(5)、(6)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)甘草次酸衍生物等，对肿瘤细胞增殖活性的抑制均显著提高。较佳地，本发明式(16)甘草次酸衍生物即化合物16的抑制效果提高了近11倍。
[0068] 实施例6：本发明甘草次酸衍生物的抗肿瘤细胞迁移测试
[0069] 细胞迁移实验用改良的Boyden Chamber法对小鼠CT-26结直肠癌细胞进行实验。
[0070] 实验原理：Boyden Chamber法又称Transwell技术，是目前最常用的检测细胞运动性方法，通过将细胞加入上孔室，在下孔室加入血清或其它趋化因子诱导细胞迁移到下室。利用统计迁移细胞数目来评估细胞的迁移。
[0071] 样品测试：(1)细胞饥饿24小时后，收集离心，重悬细胞，得到无血清的细胞悬液；(2)在上空室加入含有10×104小鼠CT-26结肠癌细胞的100μL无血清RMPI1640培养基上，培养基中含有浓度为80μM的GA或浓度为4μM、8μM、16μM的化合物16，下孔室也同时加入和上空室相同浓度的GA或化合物16的700μL培养基，让细胞迁移12小时；(3)吸走培养基，将4％的多聚甲醛加入到孔中固定细胞30分钟，将膜上表面没有发生迁移的细胞用棉签擦掉；(4)PBS缓冲液洗涤细胞三次后，用0.2％的结晶紫进行染色；(5)孔室用水洗涤，让微孔膜自然晾干，使用倒置显微镜拍照(Olympus)。
[0072] 实验结果如图1所示，和对照组相比，GA在80μM时能够明显的抑制细胞迁移，而本发明化合物16抑制细胞迁移具有剂量依赖性，本发明化合物16抑制小鼠CT-26结直肠癌细胞迁移的IC50约为4μM，此浓度下其抑制迁移能力和80μM GA在相当。与GA相比，化合物16抑制迁移的能力增强了20倍。在16μM的浓度下，本发明化合物16几乎完全抑制了肿瘤细胞的迁移。