一种石油降解菌的固定化方法与应用

摘要

本发明公开了一种石油降解菌的固定化方法与应用，包括以下内容：以小麦秸秆、玉米秸秆、麦麸、树叶、核桃壳质活性炭为载体材料，混合后进行预处理；接入活化好的石油降解菌种子液，进行吸附培养；在无菌条件下滤掉上层菌悬液，用无菌水冲洗载体材料，将吸附菌后的载体材料转移到新的石油降解菌种子液中，重复多次使载体材料吸附的菌量达到饱和，即得所需固定化颗粒。本发明以天然有机材料和天然无机材料为载体，克服了单独使用无机载体和单独使用有机载体的不足；通过吸附法实现对石油降解菌的固定，将制得的固定化石油降解菌应用于石油污染土壤的原位修复具有良好的效果，是一种可以推广应用的环保产品。

权利要求

1.一种石油降解菌的固定化方法，包括以下内容：以25wt%～50wt%的小麦秸秆、20wt%～30wt%的玉米秸秆、5wt%～20wt%麦麸、5wt%～20wt%树叶、10wt%～25wt%的核桃壳质活性炭为载体材料，混合后进行预处理；接入活化好的石油降解菌种子液，进行吸附培养，石油降解菌种子液是在120r/min、30℃条件下培养至对数生长期与稳定期的交界点，保证石油降解菌的数量达到1×1010～5×1010个/mL；载体材料占石油降解菌种子液的5v%～20v%；在无菌条件下滤掉上层菌悬液，用无菌水冲洗载体材料，将吸附菌后的载体材料转移到新的石油降解菌种子液中，重复多次使载体材料吸附的菌量达到饱和，即得所需固定化石油降解菌；所述预处理方式具体为：将玉米秸秆、小麦秸秆和树叶晒干、粉碎，过24目筛；然后与麦麸和自制24目核桃壳质活性炭混合，用蒸馏水浸泡12～24h，调节pH7.0～7.5，滤去上层漂浮的杂质和上清液，将滤出的混合载体50℃烘24h，121℃高压蒸汽灭菌20min；核桃壳质活性炭采用ZnCl2活化法制备，具体为：称取一定量的粉碎过24目筛的核桃壳浸渍于50wt%的ZnCl2溶液中，料液比为2:3，搅拌2小时后静置24 h，干燥后放入管式加热炉中，于300℃、N2的氛围下炭化80min，所得炭化样品再在50wt%ZnCl2溶液中浸渍20min，经抽滤、干燥后置于马弗炉中于500℃下活化40 min，冷却后将活化产物用20wt%的盐酸溶液煮沸20min，再用去离子水将所得产物洗涤至中性，置于干燥箱中于120 ℃烘干。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：以35wt%～50wt%的小麦秸秆，20wt%～

25wt%的玉米秸秆，5wt%～10wt%的麦麸，10wt%～15wt%的树叶，12.5wt%～20wt%的核桃壳质活性炭为载体材料。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的树叶为梧桐树叶。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：制备的核桃壳质活性炭的比表面积为

960m2/g，碘吸附值为820mg/g。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：石油降解菌种子液的制备采用牛肉膏蛋白胨液体培养基，配方为：NaCl 10g/L，蛋白胨 10g/L，牛肉膏 5g/L和一定体积的蒸馏水加热混合均匀，冷却后用NaOH或盐酸调节pH7.0～7.2，121 ℃水蒸气灭菌20 min。

6.权利要求1至5任一所述方法制备的固定化石油降解菌的应用，其特征在于：固定化石油降解菌的具体使用方式为：保持土壤25wt%～30wt%的水分含量，以播种的方式按每平方米土壤撒0.1～1kg固定化石油降解菌成品，并对表层0～30cm土壤进行翻耕，使之与固定化石油降解菌成品混合均匀，并保证土壤良好的通气性。

说明书

一种石油降解菌的固定化方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物固定化技术，具体地说是一种用于修复石油污染土壤的石油降解菌的固定化方法与应用。

背景技术

[0002] 石油在开采、炼制、运输和使用等过程中，由于各种原因会造成不同程度的泄漏，从而造成石油污染土壤。石油污染土壤是石油及石化企业的重要污染之一，其中的石油污染物对人体及环境具有很高的毒害作用。国内外石油污染土壤的处理方法主要有：焚烧法、填埋法、堆放法以及生物修复法等。

[0003] 微生物修复技术的核心是高效降解菌对石油污染物的降解作用，降解过程使污染物的成分趋向于更复杂，一些次生代谢物和中间降解产物的毒性更大，游离微生物修复作用的不足就逐渐显现出来，如单位体积内有效降解菌浓度低、与土著菌竞争处于弱势、抗毒性侵害能力差等。而微生物固定化技术可以克服这些缺点和弊端，使修复效果得到大大改善。

[0004] 微生物固定化技术是20世纪80年代兴起的一种新型生物技术，是指将游离的细胞（微生物）或酶定位于限定的空间区域内，并使其保持活性且能反复使用的技术。微生物固定化技术被广泛用于修复受污染的流体介质（如废水）和半流体介质（如泥浆）环境中，且近十年来，对其修复受污染的非流体介质（如土壤）的研究也日益增多，但将其广泛应用于受石油污染的土壤修复的报道还较少。

[0005] 限制固定化微生物在土壤修复中应用的主要原因是土壤非流体介质本身所具有的复杂性和特殊性，给该技术提出了许多不同于在流体介质中应用固定化技术时所面临的科学问题，如固定化技术本身存在着不足，未开发出适用于非流体介质的固定化技术，而且缺乏对固定化颗粒的环境安全性评价和对固定化过程中环境因子调控的系统研究；固定化微生物颗粒的载体选择，如何克服在土壤中固定化颗粒的不可回收性和污染物浓度的非均质性对固定化颗粒造成的冲击；如何保证吸附法制备的固定化微生物的菌浓度等。

[0006] 应用天然载体吸附石油降解菌制备固定化微生物，在保证固定菌浓和营养充足、通风良好的前提下，可以对石油污染土壤起到良好的修复效果。天然载体来自自然，环境友好，在自然分解过程中可以为微生物的生长繁殖提供营养；将其掺入土壤中，可以起到疏松剂的作用，保证土壤的通风和持水性能。我国是一个农业大国，生产、生活和消费等过程会产生大量的农林废弃物，若直接丢弃或焚烧将会占用大量土地、造成资源浪费和环境污染。因此，将这些农林废弃物预处理后作为固定细菌的载体，结合无机载体（如活性炭、多孔陶珠、沸石等）比表面积大、吸附性能高的特点以及天然有机载体（废弃农林作物的秸秆、根茎、叶子、种子等）本身所含的纤维物质、C、N元素和具有的保水、支撑性能，可以满足细菌修复过程中所需的营养、水分、氧气等条件的要求，同时也是土壤肥料，克服了单独使用无机载体需要补充外来营养源和单独使用天然有机载体使固定化菌量不足的缺点，为农林废弃物找到一条资源化出路。

[0007] CN101177679A公开了一种用于多环芳烃污染土壤修复的固定化细菌的制备方法，以0.25～1.0mm红砖粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土或焦炭粉为载体材料，灭菌后，接入菌液，然后增殖培养，制得所需固定化颗粒。在修复过程中发现，有机载体泥炭土（含木质素和纤维素）固定化菌对土壤中芘(PYR)和苯并[a]芘(BaP)的去除率分别为62%和47%，比单独使用无机载体固定化菌的修复效率要高的多。但是，该发明在制备固定化菌的过程中需要每天按1mL/g～2mL/g载体的量补加增殖培养基，这势必会增加操作复杂性和操作成本。

发明内容

[0008] 针对现有技术的不足，本发明提供一种石油降解菌的固定化方法与应用。本发明方法以天然有机材料和无机材料为载体，克服了单独使用天然无机载体和单独使用有机载体的不足；通过吸附法实现对石油降解菌的固定，将制得的固定化石油降解菌应用于石油污染土壤的原位修复具有良好的效果，是一种可以推广应用的环保产品。

[0009] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

[0010] 一种石油降解菌的固定化方法，包括以下内容：以小麦秸秆、玉米秸秆、麦麸、树叶、核桃壳质活性炭为载体材料，混合后进行预处理；接入活化好的石油降解菌种子液，进行吸附培养；在无菌条件下滤掉上层菌悬液，用无菌水冲洗载体材料，将吸附菌后的载体材料转移到新的石油降解菌种子液中，重复多次使载体材料吸附的菌量达到饱和，即得所需固定化石油降解菌。

[0011] 本发明中，以25wt%～50wt%的小麦秸秆、20wt%～30wt%的玉米秸秆、5wt%～20wt%麦麸、5wt%～20wt%树叶、10wt%～25wt%的核桃壳质活性炭为载体材料，优选以35wt%～50wt%的小麦秸秆，20wt%～25wt%的玉米秸秆，5wt%～10wt%的麦麸，10wt%～15wt%的树叶，
12.5wt%～20wt%的核桃壳质活性炭为载体材料。

[0012] 本发明中，所述的树叶为梧桐树叶。小麦秸秆、玉米秸秆和树叶晒干、粉碎，过24目筛。麦麸和核桃壳均为市售。

[0013] 本发明中，核桃壳质活性炭采用ZnCl2活化法制备，具体为：称取一定量的粉碎过24目筛的核桃壳浸渍于50wt%的ZnCl2溶液中，料液比为2:3，搅拌2小时后静置24 h，干燥后放入管式加热炉中，于300℃、N2的氛围下炭化80min，所得炭化样品再在50wt%ZnCl2溶液中浸渍20min，经抽滤、干燥后置于马弗炉中于500℃下活化40 min，冷却后将活化产物用
20wt%的盐酸溶液煮沸20min，再用去离子水将所得产物洗涤至中性，置于干燥箱中于120 ℃烘干。制备的核桃壳质活性炭的比表面积为960m2/g，碘吸附值为820mg/g。

[0014] 本发明中，载体的预处理是用蒸馏水浸泡12～24h，调节pH7.0～7.5，滤去上层漂浮的杂质和上清液，50℃烘24h，高压灭菌。

[0015] 本发明中，石油降解菌种子液的制备采用牛肉膏蛋白胨液体培养基，配方为：NaCl 10g/L，蛋白胨 10g/L，牛肉膏 5g/L和一定体积的蒸馏水加热混合均匀，冷却后用NaOH或盐酸调节pH7.0～7.2，121 ℃水蒸气灭菌20 min。

[0016] 本发明中，石油降解菌种子液是在120r/min、30℃条件下培养至对数生长期与稳10 10
定期的交界点，保证石油降解菌的数量达到1×10 ～5×10 个/mL。将高效石油降解菌培养至对数生长期与稳定期的交界点，可以保证菌的最高活性和稳定性。

[0017] 本发明中，将石油降解菌种子液与载体材料混合，载体材料占石油降解菌种子液的5v%～20v%。在120～160r/min、30℃条件下培养16～24h，用无菌水缓缓冲洗吸附石油降解菌后的载体材料，去掉未吸附上的石油降解菌，将所述吸附菌后的载体材料转移到新的石油降解菌种子液中，重复多次使载体材料吸附固定的菌量基本达到饱和，最终得到固定化的石油降解菌成品。

[0018] 本发明固定化石油降解菌的应用，具体使用方式为：保持土壤25wt%～30wt%的水分含量，以播种的方式按每平方米土壤撒0.1～1kg固定化石油降解菌成品，并对表层0～30cm土壤进行翻耕，使之与固定化石油降解菌成品混合均匀，并保证土壤良好的通气性。

[0019] 本发明的优点在于：

[0020] 1．载体材料均来源于自然界，成本低，通气性良好，对生物无毒性，不会引入二次污染。结合无机载体（自制核桃壳质活性炭）比表面积大、吸附性能高的特点以及天然有机载体（小麦秸秆、玉米秸秆、麦麸、树叶）本身所含的纤维物质和C、N元素以及具有的保水、支撑性能，可以满足细菌修复过程中所需的营养、水分、氧气等条件的要求，同时作为土壤肥料，克服了单独使用天然无机载体需要补充外来营养源和单独使用天然有机载体固定菌量不足的缺点，为农林废弃物找到一条资源化出路。

[0021] 具体表现为：①玉米秸秆、小麦秸秆含有的丰富的纤维素物质，利用其在土壤中缓慢分解形成的有机质、腐殖质，可为土壤中微生物提供原料，从而有效改善土壤的结构。②通过添加树叶、麦麸等辅助材料，使得C、N比更适合微生物生长，且利用树叶、麦麸本身含有的高持水能力以及麦麸含有的丰富的膳食纤维，可以维持土壤的含水率，提供细菌繁殖所需要的营养和水分；③利用核桃壳质活性炭巨大的比表面积和优异的吸附性能将石油降解菌牢牢吸附在其表面，在修复过程中将土壤中的石油污染物进行吸附富集，然后附着在载体上的细菌对污染物进行分解。

[0022] 2．固定化石油降解菌成品对石油污染土壤有明显的修复效果，在投料比0.5～1.0kg/m2污染土壤、修复时间40d的条件下，石油污染物去除率可达58.5wt%～64wt%，比游离菌高出16.5wt%～22.0wt%，其中饱和烃去除效果最好，可达70.3wt%～74.0wt%。

[0023] 3．采用简单的吸附法，制备工艺简单，生产费用低，净化效果好，易于批量生产，可以用于大面积石油污染土壤的生物修复的推广使用。

具体实施方式

[0024] 下面通过具体实施方式来进一步描述本发明。本发明中，wt%为质量分数，v%为体积分数。

[0025] 实施例1

[0026] （1）载体材料的预处理

[0027] 将在农田和野外收集到的玉米秸秆、小麦秸秆和梧桐树叶晒干、粉碎，过24目筛；然后与市售的麦麸和自制24目核桃壳质活性炭混合。载体材料的配比为50wt%的小麦秸秆、
20wt%的玉米秸秆、5wt%麦麸、10wt%的梧桐树叶、12.5wt%核桃壳质活性炭。混合后的载体用蒸馏水浸泡12～24h，调节pH7.0～7.5，滤去上层漂浮的杂质和上清液，将滤出的混合载体
50℃烘24h，121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

[0028] 核桃壳质活性炭采用ZnCl2活化法制备，具体为：称取一定量的粉碎过24目筛的核桃壳浸渍于50wt%的ZnCl2溶液中，料液比2:3，搅拌2小时后静置24 h，干燥后放入管式加热炉中，于300℃、N2的氛围下炭化80min，所得炭化样品再在50wt%ZnCl2溶液中浸渍20min，经抽滤、干燥后置于马弗炉中于500℃下活化40 min，冷却后将活化产物用20wt%的盐酸溶液煮沸20 min，再用去离子水将所得产物洗涤至中性，置于干燥箱中于120 ℃烘干。自制的核桃壳质活性炭的比表面积为960m2/g，碘吸附值为820mg/g.。

[0029] （2）石油降解菌种子液的制备

[0030] 将石油降解菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在120r/min、30℃条件下培养至石油降解菌的对数生长期与稳定期的交界点，制得石油降解菌的种子液，保证种子液中10
石油降解菌的数量达到1×10 个/mL。

[0031] 所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方为：NaCl 10g/L，蛋白胨 10g/L，牛肉膏 5g/L和一定体积的蒸馏水混合均匀，用NaOH或盐酸调节pH7.0～7.2，121 ℃水蒸气灭菌20 min。

[0032] （3）固定化石油降解菌的制备

[0033] 将按（2）所述制备的石油降解菌种子液与（1）所述的载体材料混合，所述载体材料占石油降解菌种子液的10v%，120r/min、30℃条件下培养16h，取出，无菌条件下滤掉上层菌悬液，用无菌水缓缓冲洗吸附石油降解菌后的载体材料，去掉未吸附上的石油降解菌，将所述吸附菌后的载体转移到新的石油降解菌种子液中，重复上述步骤三次，使载体材料吸附固定的菌量基本达到饱和，最终得到固定化石油降解菌的成品。

[0034] （4）固定化石油降解菌的应用

[0035] 保持土壤25wt%～30wt%的水分含量，将固定化石油降解菌成品以播种的方式按0.5kg/m2撒入受石油污染的土壤中，并对表层0～30cm土壤进行翻耕，修复时间40d的条件下，石油污染物去除率可达60.1wt%，比游离菌高出22.0wt%，其中饱和烃去除效果最好，可达73.1wt%。

[0036] 实施例2

[0037] 与实施例1不同之处在于：载体材料的配比为37.5wt%的小麦秸秆、20wt%的玉米秸秆、10wt%麦麸、12.5wt%梧桐树叶、20wt%核桃壳质活性炭。

[0038] 同条件下修复40d，石油污染物去除率达62wt%，其中饱和烃去除率可达72.5wt%。

[0039] 实施例3

[0040] 与实施例1不同处之一在于：载体材料的配比为25wt%的小麦秸秆、30wt%的玉米秸秆、15wt%麦麸、15wt%梧桐树叶、15wt%核桃壳质活性炭。不同处之二在于：固定化石油降解菌成品的撒入量为1kg/m2。

[0041] 其他条件相同，修复时间40d，石油污染物去除率达58.5wt%，其中饱和烃去除率可达70.3wt%。

[0042] 实施例4

[0043] 与实施例1不同处之一在于：制备石油降解菌种子液时，保证石油降解菌种子液中石油降解菌的数量达到5×1010个/mL；不同处之二在于：固定化石油降解菌制备时，载体材料与石油降解菌种子液的体积比为20v%，160r/min，30℃条件下培养24h。

[0044] 同条件下修复40d，石油污染物去除率达64wt%，其中饱和烃去除率可达74wt%。

[0045] 比较例1

[0046] 与实施例1不同之处在于，载体材料的配比为30wt%的小麦秸秆、30wt%的玉米秸秆、15wt%麦麸、25wt%梧桐树叶，不含无机载体核桃壳质活性炭。

[0047] 同条件下修复40d，石油污染物去除率达53.6wt%，其中饱和烃去除率为62.7wt%。

[0048] 比较例2

[0049] 与实施例1不同之处在于，固定化石油降解菌制备时，只进行一次吸附固定化步骤，不重复吸附三次。

[0050] 同条件下修复40d，石油污染物去除率达50.8wt%，其中饱和烃去除率为61.3wt%。