一种猪克隆胚胎的制备方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种猪克隆胚胎的制备方法。该制备方法包括：获得供体细胞；取重编程因子重组载体，转入所得供体细胞，得核供体细胞；将所得核供体细胞移植到去除细胞核的卵细胞中，融合和激活，即得。本发明提供的制备方法在获得核供体细胞之后直接移植到去除细胞核的卵细胞中，缩减了利用重编程因子制备猪克隆胚胎的步骤，操作简单易行，缩短了工作周期，且有效提高了猪克隆胚胎发育效率。

权利要求

1.一种猪克隆胚胎的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：获得供体细胞；

步骤2：取重编程因子重组载体，与所述供体细胞混合，于-4℃～4℃条件下孵育

5min～10min，得核供体细胞；将所述核供体细胞移植到去除细胞核的卵细胞中，融合和激活，即得。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述混合所得的混合液中所述重编程因子重组载体的浓度为20ng/μL～80ng/μL。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述孵育的时间为5min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述移植具体为：取所述核供体细胞，用显微注射针注入所述去除细胞核的卵细胞。

5.根据权利要求1至4任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述供体细胞包括猪胎儿成纤维细胞、成体猪耳缘成纤维细胞或颗粒细胞。

6.根据权利要求1至4任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2重编程因子包括Oct4、K1f4、c-Myc、Sox2、Lin28或Nanog中的一种或者两者以上混合物。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述重编程因子为Oct4。

说明书

一种猪克隆胚胎的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种猪克隆胚胎的制备方法。

背景技术

[0002] 克隆猪在畜牧业生产、基础科学和医学研究中具有重要的应用价值，例如，在畜牧业生产上可以保种和丰富猪品种；在医学研究中猪可以为人类异种器官移植、疾病模型和新药筛选提供理想材料。目前，广泛用于制备克隆猪的技术为体细胞克隆技术。

[0003] 体细胞克隆技术是指采用核移植的方法，利用细胞拆合或细胞重组技术，将卵母细胞去核作为核受体，以体细胞或含少量细胞质的细胞核即核质体作为核供体，将核供体移入核受体中构建重组胚胎，供体核在去核卵母细胞的胞质中被重新编程，并启动卵裂，开始胚胎发育，获得克隆动物的技术，也称为体细胞核移植技术。传统理论上认为，分化和发育是一个不可逆的过程，在这个过程中，细胞从全能的状态逐步分化成具有较低潜能的状态，表达特定的基因以执行特定的功能。体细胞克隆则与之相反，它需要细胞从低潜能的分化状态转变成具有较高发育潜能的胚胎状态并使其随后发育成动物个体，这个过程即为细胞核重编程(nuclear reprogramming)。体细胞克隆中的细胞核重编程包括两个步骤：首先，使分化的供体细胞去分化以达到全能的胚胎状态；接着在随后的发育过程中使克隆胚胎再分化成不同的体细胞类型。

[0004] 细胞核重编过程包括了基因表达模式的改变和表观遗传标记的改变。在体细胞克隆中，卵母细胞首先必须擦除供体细胞核中的分化记忆并建立类似胚胎的全能状态，这个过程需要表观遗传重编(epigenetic reprogramming)以擦除体细胞核中原先的表观遗传模式并在克隆胚胎中建立胚胎的表观遗传特性和基因表达模式。目前的观点认为，表观遗传重编不完善是导致克隆胚胎发育失败、胚胎发育效率较低和表型异常的主要因素。因此，植入前胚胎期的表观遗传重编程对于正确的发育是至关重要的，它能够调节早期胚胎基因表达、细胞分裂进而决定细胞命运。某些重编程因子在该表观遗传重编过程中发挥重要的作用，例如重编程因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28和Nanog。研究发现Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4基因就足以将成纤维细胞重编成为胚胎干细胞样细胞。因此，重编程因子目前被研究者用于体细胞克隆技术中，来提高克隆胚胎重编程能力进而提高克隆胚胎发育效率。

[0005] 利用体细胞克隆技术制备克隆猪的步骤可分为两大步骤：步骤一为获得克隆胚胎；步骤二为将胚胎移植入合适的受体猪进行进一步的发育，至克隆猪的出生。其中，将重编程因子应用于制备猪克隆胚胎的具体操作流程包括：含重编程因子载体的构建；供体细胞的转染；含重编程因子基因的核供体细胞的筛选；核体细胞核移植；体外培养，即得。目前，研究认为采用重编程因子来提高克隆胚胎发育效率时，需要将重编程因子整合到供体细胞的基因组中以有效提高克隆胚胎中重编程因子的水平，这需要在供体细胞转染含重编程因子载体之后，还需要对供体细胞进行进一步培养、筛选以获得整合了重编程因子基因的核供体细胞，造成整操作流程复杂、工作周期较长，不利于克隆猪的推广和应用。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种猪克隆胚胎的制备方法，该制备方法操作步骤少、操作简单、缩短了工作周期，且有效提高了猪克隆胚胎发育效率，更有利于克隆猪的推广和应用。

[0007] 为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 本发明提供了一种猪克隆胚胎的制备方法，包括以下步骤：

[0009] 步骤1：获得供体细胞；

[0010] 步骤2：取重编程因子重组载体，转入步骤1所得供体细胞，得核供体细胞；将所得核供体细胞移植到去除细胞核的卵细胞中，融合和激活，即得。

[0011] 目前，研究者为了提高克隆胚胎中重编程因子的水平，采用在将重编程因子基因转入供体细胞之后，进行进一步的培养、筛选以获得整合了重编程因子基因的核供体细胞。但是，研究发现，并不是核供体细胞中重编程因子基因整合的量越多胚胎发育效率越高，相反有些实验中供体细胞在转入重编程因子基因后反而不利于胚胎的发育，这可能是由于重编程因子持续大量表达干扰了胚胎的正常发育造成的，因为供体细胞被重编程过程中需要大量的重编程因子，而在之后的胚胎发育过程中需要下调重编程因子表达水平。本发明提供的制备方法采用将重编程因子重组载体转入供体细胞之后，直接将所得核供体细胞移植到去除细胞核的卵细胞中，既提高了克隆胚胎中重编程因子的水平，又避免了外源重编程因子基因被整合到基因组中，实现了在克隆胚胎一细胞期提供高水平的重编程因子，促进卵细胞细胞质启动重编程程序，进行核供体细胞核重编程，而随着胚胎发育中细胞有丝分裂的进行，转入的重编程因子重组载体浓度逐渐被稀释，有效地降低了细胞中外源的重编程因子的含量，更有利于克隆胚胎的正常生长，有效提高了克隆胚胎发育效率。

[0012] 优选地，本发明提供的制备方法中，步骤2中转入具体为：

[0013] 取重编程因子重组载体与步骤1所得供体细胞混合，于-4℃～4℃条件下孵育5min～10min。

[0014] 本发明采用将重编程因子重组载体与供体细胞在-4℃～4℃条件下共孵育的方法，将重编程因子重组载体转入供体细胞或者吸附在供体细胞膜表面上，在之后的核移植时，供体细胞作为运输载体将转入供体细胞内或者吸附在供体细胞膜表面上的重编程因子重组载体转入了去除细胞核的卵细胞中，提高了克隆胚胎中重编程因子的水平，且该转入方法步骤少、操作简单易行。

[0015] 优选地，本发明提供的制备方法步骤2混合所得的混合液中重编程因子重组载体的浓度为20ng/μL～80ng/μL。

[0016] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2混合所得的混合液中重编程因子重组载体的浓度为50ng/μL。

[0017] 优选地，本发明提供的制备方法步骤2孵育的时间为5min。

[0018] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2转入供体细胞之后，还包括，将所得重编程因子与供体细胞的孵育液加入到3倍体积的37℃～39℃的胚胎操作液中，得核供体细胞。所得核供体细胞所处于37℃～39℃的环境中，更有利于移植后所得克隆胚胎的成活和发育。

[0019] 优选地，本发明提供的制备方法步骤2中移植具体为：

[0020] 取步骤1所得供体细胞，用显微注射针注入去除细胞核的卵细胞。

[0021] 优选地，本发明提供的制备方法步骤2中去除细胞核的卵细胞的制备方法为用显微注射针取出卵母细胞第一极体和纺锤体，即得。

[0022] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中去除细胞核的卵细胞的制备方法具体为用显微注射针取出卵母细胞第一极体和第一极体附近的体积百分比为15％-20％的细胞质，即得。

[0023] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中步骤2中移植具体为：在取出卵母细胞第一极体和纺锤体的同一位置，向所得去除细胞核的卵细胞中注入所述核供体细胞。

[0024] 优选地，本发明提供的制备方法步骤1中供体细胞包括猪胎儿成纤维细胞、成体猪耳缘成纤维细胞或颗粒细胞。本发明提供的制备方法步骤1中的供体细胞优选为猪胎儿成纤维细胞、成体猪耳缘成纤维细胞或颗粒细胞，但不限于以上供体细胞，本领域技术人员明显可以根据需求而获得其他供体细胞，包括经过基因修饰的供体细胞。

[0025] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤1中供体细胞为猪胎儿成纤维细胞。

[0026] 优选地，本发明提供的制备方法步骤2中重编程因子包括Oct4、Klf4、c-Myc、Sox2、Lin28或Nanog中的一种或者两者以上混合物。

[0027] 更为优选地，本发明提供的制备方法步骤2中重编程因子为Oct4或Nanog中的一种或者两者的混合物。

[0028] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中重编程因子为Oct4。

[0029] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中重编程因子为hOct4。

[0030] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中重编程因子重组载体具体为pLv-CMV-ZsGreen-hOct4质粒。

[0031] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法包括以下步骤：

[0032] 步骤1：获得供体细胞；

[0033] 步骤2：取重编程因子重组载体，与步骤1所得供体细胞混合，于-4℃～4℃条件下孵育5min～10min之后，加入到3倍体积的37℃～39℃的胚胎操作液中，得核供体细胞；将所得核供体细胞，用显微注射针注入去除细胞核的卵细胞，融合和激活，即得。

[0034] 在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法具体为：

[0035] 获得猪胎儿成纤维细胞；

[0036] 取pLv-CMV-ZsGreen-hOct4质粒与所得猪胎儿成纤维细胞混合，使所得混合液中pLv-CMV-ZsGreen-hOct4质粒的终浓度为50ng/μL；

[0037] 将所得混合液于-4℃～4℃条件下孵育5min之后，加入到38.5℃预热的3倍体积的胚胎操作液中，得核供体细胞；

[0038] 在38.5℃条件下，将所得核供体细胞，用显微注射针注入去除细胞核的卵细胞中，融合和激活，即得。

[0039] 本发明提供了一种猪克隆胚胎的制备方法。该制备方法包括以下步骤：获得供体细胞；取重编程因子重组载体，转入所得供体细胞，得核供体细胞；将所得核供体细胞移植到去除细胞核的卵细胞中，融合和激活，即得。本发明提供的制备方法在获得核供体细胞之后直接移植到去除细胞核的卵细胞中，缩减了利用重编程因子制备猪克隆胚胎的步骤，操作简单易行，缩短了工作周期，且有效提高了猪克隆胚胎发育效率。实验结果证实，本发明提供的猪克隆胚胎的制备方法制备得猪克隆胚胎的囊胚率显著提高，且不影响克隆胚胎的分裂率，说明本发明提供的制备方法有效提高了猪克隆胚胎发育效率，更有利于克隆猪的推广和应用。

附图说明

[0040] 图1示本发明提供的猪克隆胚胎制备方法流程图；

[0041] 图2示荧光显微镜下检测实施例1制得的核供体细胞获得的结果；其中，核供体细胞代表实施例1制得的核供体细胞；

[0042] 图3示不同组别胚胎发育效率，同组数据中不同的字母a、b代表差异显著；

[0043] 图4示不同组别制得的猪克隆胚胎发育到第7天的囊胚数目检测结果(4x)和囊胚细胞数目检测结果(100x)；A代表不同组别克隆胚胎在体式显微镜下的情况；B为不同组别DAPI染色后观察得到的单个囊胚中的囊胚细胞数(100x)，其中白色代表蓝色，该蓝色为DAPI染色后观察到细胞核的颜色；

[0044] 图5示不同组别囊胚中细胞凋亡情况；其中PC代表凋亡阳性对照，胚胎经过DNA酶处理；DAPI代表采用DAPI染色法统计不同组别胚囊中细胞情况(细胞染色为蓝色)，反映了每个组别囊胚中平均细胞数；TUNEL代表采用TUNEL法检测细胞凋亡情况(细胞染色为绿色)；Merge代表将DAPI染色法统计到的细胞情况与采用TUNEL法检测细胞凋亡情况组合到一张图片上所对应的结果；

[0045] 图6示囊胚期不同组别的克隆胚胎平均细胞凋亡数统计图；

[0046] 图7示实验组胚胎在荧光显微镜下检测结果；

[0047] 图8示不同组别制得的克隆胚胎一细胞期和囊胚期外源性Oct4基因的相对表达量检测结果；

[0048] 图9示不同组别制得的克隆胚胎一细胞期和囊胚期内源性Oct4基因的相对表达量检测结果。

具体实施方式

[0049] 本发明公开了一种猪克隆胚胎的制备方法。本领域技术人员可以参考本文内容，实施该制备方法，获得猪克隆胚胎，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0050] 本发明提供的一种猪克隆胚胎中所用到的试剂和原料均可由市场购得。

[0051] 材料和试剂的配置：

[0052] 细胞培养基：DMEM高糖培养基，胎牛血清(FBS)，购自GIBCO公司。

[0053] 胰酶：0.25％Trypsin-EDTA，购自GIBCO公司。

[0054] DPBS缓冲液：2.68mmol/L KCl，2.00mmol/L KH2PO4，136.89mmol/L NaCl，10mmol/L Na2HPO4，0.06g/L青霉素，0.05g/L链霉素。

[0055] 孵育液：质量体积百分比2.8％柠檬酸钠，溶剂为100mmol/L EDTA，pH7.4。

[0056] 质粒pLv-CMV-ZsGreen-hOct4：购自百恩维生物科技有限公司，携带有人Oct4基因序列，Genbank：NM_002701.4，由中山大学生命科学学院动物遗传工程实验室保藏。

[0057] TL-HEPES-PVA(洗卵液)：114mmol/L NaCl，3.2mmol/L KCl，0.34mmol/L NaH2PO4，10mmol/L乳酸钠，0.5mmol/L MgCl2-6H2O，10mmol/L HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，
0.2mmol/L丙酮酸钠，12mmol/L山梨醇，2mmol/L NaHCO3，2mmol/L CaCl2-2H2O，25μg/mL庆大霉素，65μg/mL青霉素，0.1％PVA(w/v)，配制TL-HEPES-PVA所用试剂均购自Sigma公司。

[0058] 卵母细胞成熟培养基：

[0059] 基本培养基：TCM-199培养基，26.19mmol/L NaHCO3，3.05mmol/L D-葡萄糖，0.91mmol/L丙酮酸钠，75μg/mL青霉素钠盐，50μg/mL链霉素硫酸盐和0.1％PVA(w/v)，以上试剂均购自Sigma公司。

[0060] 0-22小时培养基：在基本培养基中加入0.5μg/mL黄体化激素(Luteinizing hormone，LH)，0.5μg/mL卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)，10ng/mL表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)，体积百分比10％猪卵泡液(porcine follicular fluid，PFF)和0.57mmol/L半胱氨酸。以上试剂除PFF外均购自Sigma公司，PFF从猪卵泡液中分离，分离方法为：抽取卵泡液加入离心管中，离心取上清即为PFF。0-22小时培养基要提前一天配，配完后放在CO2培养箱中平衡过夜。

[0061] 22-44小时培养基：不含FSH，LH和半胱氨酸，其它成分与0-22小时培养基相同。22-44小时培养基要提前配好后放在CO2培养箱中平衡过夜。

[0062] 胚胎操作液：TCM-199，0.60mM NaHCO3，0.1％HEPES，30mM NaCl，0.3％牛血清白蛋白(BSA)，60μg/mL链霉素，50μg/mL青霉素，以上试剂均购自Sigma公司。

[0063] 7.5μg/mL的细胞松弛素B(CCB)购买自Sigma公司。

[0064] 卵丘细胞消化液：0.1％透明质酸酶。

[0065] 融合/激活液：0.3mol/L甘露醇，1.0mmol/L CaCl2·2H2O，0.1mmol/L MgCl2·6H2O，0.5mmol/L HEPES，调PH值至7.4，以上试剂均购自Sigma公司。

[0066] PZM-5(Porcine zygote medium5)胚胎培养液：108mmol/L NaCl，10mmol/L KCl，0.35mmol/L KH2PO4，0.40mmol/L MgSO4·7H2O，25mmol/L NaHCO3，2mmol/L L-谷氨酰胺，
4.99mmol/L亚牛磺酸(Hypotaurine)，50μg/mL庆大霉素，0.20mmol/L丙酮酸钠，0.06g/10
0mL(CH3CHOHCOO)2Ca·5H2O(乳酸钙)，2％BME氨基酸，1％MEM非必需氨基酸，0.3％BSA，以上试剂均购自Sigma公司。

[0067] 2％甲醛：用PBS配，购自Sigma公司。

[0068] 0.1％Tritonx-100：用PBS配，购自Sigma公司。

[0069] 2.5μg/mL DAPI：购自Molecular Probes公司。

[0070] TUNEL洗液：0.1％PVA，用PBS配，购自Sigma公司。

[0071] TUNEL固定液：4％多聚甲醛，PBS配制。

[0072] Dnase I：DNA酶I，购自宝生物工程(大连)有限公司。

[0073] 为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0074] 实施例1 核供体细胞的制备

[0075] 本实施例采用猪胎儿成纤维细胞作为供体细胞，该供体细胞的制备方法如下：

[0076] 猪胎儿成纤维细胞系(PEF细胞)的建立

[0077] 从妊娠32天的母猪的子宫中取出胎儿，用10mL含双抗的DPBS缓冲液冲洗3遍；在超净工作台中用灭菌的眼科剪去除胎儿的头、四肢和内脏，DPBS缓冲液冲洗后转移到一个新的培养皿中；用另外一把灭菌的眼科剪将剩余部分剪碎后，将组织碎片转移到50mL离心管中。往上述离心管中加入5mL0.25％胰酶，用1mL枪吹混匀，37℃消化4h。消化后，将液体部分转移到15mL离心管中，2000rpm离心15分钟；弃上清，向离心管中加入5mL DPBS，吹打均匀，1600rpm离心5分钟，重复两次；弃上清，向离心管中加入5mL DMEM高糖培养基，吹打均匀，以1mL/皿均匀地加入到100mm培养皿中，放入37℃培养箱中培养。

[0078] 猪胎儿成纤维细胞传代培养：

[0079] 当细胞生长到80％汇合时，弃去原来的培养液，加入3rnL DPBS缓冲液洗两遍，每个细胞培养板中加入1mL0.25％胰酶消化液，37℃消化3分钟，待细胞开始脱落或变圆时用手拍打培养皿使细胞完全脱落。加入2mL(一传三)含10％FBS的DMEM高糖培养基终止消化，并用辅助移液器吹打细胞使其分散均匀。将分散的细胞悬液以1mL/皿均匀地接种到新的细胞培养皿中，并补加2mL含10％FBS的DMEM高糖培养基，放在37℃，5％CO2培养箱中培养。

[0080] 重编程因子基因重组载体转入供体细胞：

[0081] 当上述猪胎儿成纤维细胞传代培养所得培养皿中细胞生长到80％汇合时，弃去原来的培养液，加入3mL DPBS洗两遍，每个细胞培养板中加入1mL0.25％胰酶消化液，37℃消化3分钟，待细胞开始脱落或变圆时用手拍打培养皿使细胞完全脱落。细胞脱落后加2mL含10％FBS的DMEM高糖培养基终止消化，吹打均匀后把细胞悬液转移到离心管中，1600rpm离心5min；弃掉上清，加入1mL胚胎操作液，吹打均匀，放在超净工作台上，室温平衡1h后，1600rpm离心5min，离心后倒掉上清，加入1mL4度预冷的孵育液重悬。所得细胞重悬液用
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细胞计数仪测细胞浓度后稀释至1x10/mL，待用。

[0082] 取所得浓度为1x106/mL的细胞重悬液18.6μL与1.4μL浓度为714ng/μL的pLv-CMV-ZsGreen-hOct4质粒混合，使质粒终浓度为50ng/μL；冰上孵育5min，取孵育过的细胞重悬液5μL加入38.5℃预热的15μL的胚胎操作液液滴中，即得核供体细胞。

[0083] 采用荧光检测方法检测所得核供体细胞，以转染eGFP基因的PEF细胞作为对照组，鉴定结果为图2，其中核供体细胞绿色荧光为pLv-CMV-ZsGreen-hOct4质粒中绿色荧光蛋白表达产生的，说明了本实施例制得的核供体细胞内部有重编程因子重组载体表达，即表达绿色荧光蛋白，所得核供体细胞即刻用于核移植。

[0084] 实施例2 猪克隆胚胎的制备

[0085] 卵母细胞的采集和体外成熟培养

[0086] 从屠宰场采集猪的卵巢，放在盛有0.9％生理盐水的保温瓶中(保温瓶温度维持在30～35℃)，2h之内运回实验室；用37℃生理盐水清洗卵巢3～4次以除去血；用11号手术刀片将卵巢表层卵泡划开，使卵泡液流出，并用TL-HEPES-PVA洗卵液冲洗卵巢，收集卵泡液和冲洗液。取4mL的卵泡液在体式显微镜下挑选细胞质均一并有多层卵丘细胞(最少三层)的卵母细胞-卵丘细胞复合体(COCs)；用TL-HEPES-PVA洗所得COCs两次，然后用基本培养基洗三次；之后转移到0-22小时培养基中，在38.5℃，5％CO2条件下培养22小时；转移到22-44小时培养基中继续培养。培养42-44小时后，在含有1mg/mL透明质酸酶的胚胎操作液中反复吹打COCs以除去卵丘细胞，挑选排出第一极体、透明带完整、卵周隙清晰、胞质均匀的M II卵母细胞为受体。

[0087] 核供体细胞核移植

[0088] 实验设置：为了考察本发明提供的制备方法所获得的猪克隆胚胎的质量，实验安排实验组、空白对照组和阳性对照组，实验组为实施例1制备获得的核供体细胞；空白对照组为没有转入重编程因子的核供体细胞，即正常的供体细胞；阳性对照组为孤雌激活组。各个组别所采用的供体细胞见表1。三个组别所选用的卵母细胞均为按照上述M II卵母细胞的制备方法制备获得的M II卵母细胞，核移植过程操作一致。

[0089] 表1 不同组别所对应的核供体细胞

[0090]组别 核供体细胞
实验组 孵育Oct4的PEF细胞(即实施例1制得的核供体细胞)
空白对照组 PEF细胞
阳性对照组 无(卵子孤雌激活)

[0091] 采用显微操作盲吸法去核和电融合法进行核供体细胞核移植，具体操作如下：取所得具有第一极体的M II卵母细胞置于20μL胚胎操作液液滴中，液滴中加有7.5μg/mL的细胞松弛素B(CCB)，所得液滴用矿物油覆盖；用内径为18-20μm的显微注射针取出第一极体及其附近的体积百分比为15％-20％的细胞质。从去核的同一位置(即取出第一极体的位置)向卵母细胞注入实施例1制得的核供体细胞和约10pmol操作液，并使核供体细胞与卵母细胞膜贴在一起。用TCM-199培养基洗重构胚胎一次，然后将胚胎置于TCM-199培养基中，于38.5℃，5％CO2培养箱中平衡2小时；把重构胚胎转移至含有融合/激活液的电极之间，用毛细管拨动胚胎，使其一字排列在两个电极之间，并使体细胞与卵母细胞质的切线与电极平行。用单个1.2kv/cm的支流电脉冲电击30μsec以使卵母细胞与体细胞融合并激活胚胎发育。融合和激活后，把重构胚胎转移到含500μL PZM-5胚胎培养液的四孔板中培养，培养35-55个重构胚胎，在融合和激活后分别在两个时间点在体式显微镜下计数分裂的胚胎数和囊胚数，并计算分裂率和囊胚形成率，这两个时间点分别为第42小时时和第7天时。

[0092] 猪克隆胚胎质量评估：克隆胚胎质量评估主要包括克隆胚胎的分裂率、囊胚率、囊胚细胞数和囊胚细胞凋亡情况。其中，克隆胚胎的分裂率的大小代表制备克隆胚胎的成功分裂效率；囊胚率代表所制备克隆胚胎可发育至囊胚的效率；囊胚率、囊胚细胞数的多少代表所制备胚胎的质量；囊胚细胞凋亡情况中凋亡细胞数低代表囊胚质量好、核移植成功率高。克隆胚胎的分裂率的计算公式为：分裂率=(分裂胚胎数/总胚胎数)×100％；囊胚率的计算公式为：囊胚率= 囊胚数/分裂胚胎数)×100％；囊胚细胞数的统计方法为：DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)染色法；囊胚细胞凋亡情况统计方法为：TUNEL检测。

[0093] DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)染色计算囊胚细胞数，具体操作过程如下：首先，室温下，用4％甲醛固定囊胚40分钟；用PBS洗三次之后，把囊胚置于含0.1％Tritonx-100的PBS中渗透40分钟；之后用2.5μg/mL DAPI染色40分钟。最后在荧光显微镜下对每个囊胚所含的细胞数进行计数。

[0094] 囊胚细胞凋亡的TUNEL检测：将带有透明带的囊胚用PBS洗3遍之后；用TUNEL固定液室温固定40min，然后用PBS洗3遍。所得胚胎室温下用0.1％Tritonx-100渗透40min后，PBS洗3遍；随机取2-3个固定的胚胎，5U/μL Dnase I10μL室温处理10min使细胞DNA链断裂，作为阳性对照(positive control，PC)；将PC、实验组、阳性对照组、空白对照组囊胚分别加入到10μL PBS中，然后向各组中加入1μL TUNEL试剂盒中的酶和9μL标记液，38.5℃，避光，30min；PBS洗3次，DAPI避光染30min。PBS洗3次，每次10min，移液器吹打辅助。压片，荧光拍照，并对凋亡细胞(绿色)进行计数。

[0095] Oct4表达量的检测：采用PCR方法检测各个组别获得的克隆胚胎不同发育时期胚胎内Oct4基因的表达情况，分别采用不同的引物组来检测外源性Oct4基因(即质粒pLv-CMV-ZsGreen-hOct4携带的hOct4基因)的表达量(以mRNA的相对表达量表示)和内源性Oct4基因的表达量(以mRNA的相对表达量表示)。用于检测外源性Oct4基因的上游引物具有如下核苷酸序列：5’-TAGGCGTGTACGGTGGGAGG-3’；其下游引物具有如下核苷酸序列：5’-GAGAAGGCGAAATCCGAAGC-3’；用于检测内源性Oct4基因的上游引物具有如下核苷酸序列：5’-CAAACTGAGGTGCCCTTC-3’；其下游引物具有如下核苷酸序列：5’-ATTGAACTTCACCTTCCCTCCAACC-3’。

[0096] 结果分析：实验数据分析用SAS软件进行。克隆胚胎质量评价各项指标的百分比数据用Duncan分析法进行单因素方差分析。当p＜0.05时，认为差异显著。

[0097] 图1为本发明提供的制备方法的操作流程图。

[0098] 图3为各个组别的克隆胚胎的分离率、囊胚率和囊胚数的统计，从图中可以看出实验组分裂率相对于空白对照组并没有提高，说明该实验方法对卵裂率无显著影响。而实验组的囊胚率显著高于空白对照组(差异显著)，该囊胚率几乎达到了阳性对照组的同等水平(差异不显著)，说明实验组克隆胚胎中Oct4的高表达促进了克隆胚胎的发育。从囊胚平均细胞数目上来看，三组的囊胚平均数差异不显著，说明本发明提供的制备方法获得的克隆胚胎在转染和表达Oct4之后，囊胚发育正常。

[0099] 图4中A为不同组别克隆胚胎在体式显微镜下的情况，可明显看出，阳性对照组和实验组中囊胚数要明显多于空白对照组。B为不同组别DAPI染色后观察得到的单个囊胚中的囊胚细胞数，由图中可知，不同组别获得的囊胚细胞数基本相同，差异不显著。说明了本发明提供的猪克隆胚胎的制备方法在提高囊胚数的同时，保证了所得囊胚的质量。

[0100] 图5为不同组别囊胚中细胞凋亡情况；其中DAPI代表采用DAPI染色法统计不同组别胚囊中细胞数目情况(细胞染色为蓝色)，反应了每个组别囊胚中平均细胞数；其中，TUNEL代表采用TUNEL法检测细胞凋亡情况(实细胞染色为绿色)；Merge代表将DAPI染色法统计到的细胞情况与采用TUNEL法检测细胞凋亡情况组合到一张图片上所对应的情况。

[0101] 图6为囊胚期不同组别的克隆胚胎平均细胞凋亡数统计图，从图中明显看出，实验组和阳性对照组胚胎细胞凋亡数要低于空白对照组；实验组与阳性对照组胚胎细胞凋亡数相当，差异不显著。由此可得，实验组囊胚中平均细胞凋亡数显著低于空白对照组(差异显著)，与阳性对照组胚胎细胞数基本在同等水平(差异不显著)，说明本发明提供的制备方法制得的囊胚质量得到改善。

[0102] 图7为实验组胚胎在荧光显微镜下检测结果，实验结果显示在荧光显微镜下能够观测到绿色荧光，说明pLv-CMV-ZsGreen-hOct4质粒可以成功表达。

[0103] 图8为不同组别胚胎中外源性Oct4基因表达情况，由图可知，外源性Oct4基因mRNA在一细胞期时大量表达；空白对照组、阳性对照组没有表达，(空白对照组和阳性对照组中微量的外源性Oct4mRNA检测结果为下游引物结合在内源性Oct4基因片段而扩增产生的)；而囊胚期时，各个组别各组之间无显著差异，各个组别的微量的外源性Oct4mRNA检测结果均为下游引物结合在内源性Oct4基因片段而扩增产生的。说明本发明提供的制备方法获得的克隆胚胎中外源性Oct4基因仅在早期胚胎中高表达，而在胚胎发育后期基本不表达。图9为不同组别胚胎中内源性Oct4基因表达情况，由图可知，在一细胞期，实验组中的克隆胚胎内源性Oct4基因表达量都要大幅高于阳性对照组和空白对照组，说明內源性Oct4基因受到外源性Oct4基因的诱导而提高了表达量；在囊胚期，实验组中的克隆胚胎內源性Oct4基因表达量依然高于空白对照组，且达到阳性对照同等水平，说明经外源性Oct4基因诱导內源性Oct4基因的高表达可以持续到囊胚时期。由此可见，本发明提供的制备方法中携带有外源性Oct4基因的质粒仅在克隆胚胎发育早期大量表达，促进克隆胚胎的发育；同时，克隆胚胎发育早期外源性Oct4基因的大量表达促进了内源性Oct4基因的表达，即满足了克隆胚胎发育的需求，也避免了大量的外源重编程因子持续表达而干扰胚胎的正常发育的发生，说明本发明提供的制备方法能够有效提高了猪克隆胚胎发育效率，更有利于克隆猪的推广和应用。

[0104] 以上实验结果说明了本发明提供的猪克隆胚胎的制备方法所获得的克隆胚胎发育早期外源性Oct4大量表达，促进了克隆胚胎发育效率，且避免了大量的外源重编程因子持续表达而干扰胚胎的正常发育的发生，所得猪克隆胚胎质量好，发育效率高，且本发明提供的制备方法步骤少，操作简单，更有利于克隆猪的推广和应用。

[0105] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。