基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒及其检测方法，涉及microRNA。试剂盒设有盒体、隔板、miRNA提取试剂瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶。在200μL血浆充分裂解后加入所述试剂盒中提供的工作浓度为5n mol的血浆miRNA外源性参照，立即进行漩涡震荡15s，其余步骤同常规方法；应用所述试剂盒提供的茎环逆转录试剂将miRNA逆转录为cDNA；应用所述试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时荧光定量PCR扩增；综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，进行分析。其特异性和敏感性高，可快速准确检测样本中miRNA的含量。
1.检测三种血浆miRNA的特异引物，其特征在于所述三种血浆miRNA分别是指hsa-miR-504、hsa-miR-133b、cel-miR-39；其中hsa-miR-504与hsa-miR-133b为人源性miRNA，cel-miR-39为线虫来源的miRNA，作为一种外源性参照miRNA，从血浆提取开始加入血浆中，作用在于能够从提取miRNA开始监测整个实时荧光定量PCR的全过程；
所述检测三种血浆miRNA的特异引物包括三种血浆miRNA特异性逆转录引物、三种血浆miRNA特异性正向引物和三种血浆miRNA通用反向引物；
所述三种血浆miRNA特异性逆转录引物由hsa-miR-504的特异性逆转录引物、hsa-miR-133b的特异性逆转录引物和cel-miR-39的特异性逆转录引物组成；
所述hsa-miR-504的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1 5＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGATAGAGT-3＇；
所述hsa-miR-133b的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2 5＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTAGCTGGT-3＇；
所述cel-miR-39的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3 5＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAAGCTGA-3＇；
所述三种血浆miRNA特异性正向引物由hsa-miR-504的特异性正向引物、
hsa-miR-133b的特异性正向引物和cel-miR-39的特异性正向引物组成；
所 述hsa-miR-504 的 特 异 性 正 向 引 物 的 核 苷 酸 序 列 为 SEQ ID NO.4
5＇-GCTGGTTAAGACCCTGGT-3＇；
所 述 hsa-miR-133b的 特 异 性 正 向 引 物 的 核 苷 酸 序 列 为 SEQ ID NO.5
5＇-TAGCGTCTTTGGTCCCCT-3＇；
所 述 cel-miR-39的 特 异 性 正 向 引 物 的 核 苷 酸 序 列 为 SEQ ID NO.6
5＇-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3＇
所述三种血浆 miRNA通用反向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO.10
5＇-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3＇。
2.三种血浆miRNA特异性AllGlo探针，其特征在于所述三种血浆miRNA分别是指hsa-miR-504、hsa-miR-133b、cel-miR-39；其中hsa-miR-504与hsa-miR-133b为人源性miRNA，cel-miR-39为线虫来源的miRNA，作为一种外源性参照miRNA，从血浆提取开始加入血浆中，作用在于能够从提取miRNA开始监测整个实时荧光定量PCR的全过程；
所述三种血浆miRNA特异性AllGlo探针由hsa-miR-504的特异性AllGlo探针、hsa-miR-133b的特异性AllGlo探针和cel-miR-39的特异性AllGlo探针组成；
所述hsa-miR-504的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.7MAR-CTGGATACGACGATAGAGTGC-MAR；
所述hsa-miR-133b的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.8JUP-CTGGATACGACTAGCTGGTTGA-JUP；
所述cel-miR-39的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.9NEP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-NEP。
3.基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒，其特征在于设有盒体、隔板、miRNA提取试剂瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶；隔板设在盒体内，miRNA提取试剂瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上，miRNA提取试剂瓶内装有miRNA提取试剂，茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂；
所述miRNA提取试剂包括血浆miRNA外源性参照，所述血浆miRNA外源性参照是指人工合成的cel-miR-39，人工合成的cel-miR-39作为一种外源性加入的参照，其工作浓度为
5n mol/L，作用在于能够监测从提取microRNA到后面实时荧光定量PCR全过程的反应效率；
所述茎环逆转录试剂包括以下组份：200单位/μL的MMLV酶、10m mol/L dNTP混合液、5×RT缓冲液、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10m mol/L的MgCl2、1μmol/L的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品，浓度为100n mol/L；所述5×RT缓冲液由250mmol/L Tris-HCl，375m mol/L KCl，15m mol/L MgCl2，50m mol/L DTT组成；所述特异的miRNA的逆转录引物为权利要求1所述三种血浆miRNA特异性逆转录引物；
所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液、10m mol/L的MgCl2、5单位/μL的Taq聚合酶、10mM dNTP混合液、100ml无核酶水、10μmol/L特异正向引物、10μmol/L通用反向引物和AllGlo探针；所述10×Taq缓冲液包括100m mol/L Tris-HCl，500m mol/L KCl；所述特异正向引物为权利要求1所述三种血浆miRNA特异性正向引物，所述通用反向引物为权利要求1所述三种血浆miRNA通用反向引物，所述AllGlo探针为权利要求2所述三种血浆miRNA特异性AllGlo探针。
基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂
盒及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及microRNA，具体涉及一种基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
[0002] MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核细胞中的长约22个核苷酸的非编码RNA分子，参与了在生物体中许多生理病理过程,通过调节基因表达,在细胞增殖、凋亡、生长发育、细胞分化、代谢等过程中发挥重要作用。具体表现为miRNA在细胞核内经过形成最初的初级转录本pri-miRNA到pre-miRNA，后转运出细胞核，通过剪切形成成熟miRNA，通过与Ago蛋白等形成RISC（RNA诱导的沉默复合体），部分抑制或降解靶mRNA序列，参与基因表达调控（Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.）。
[0003] 由于miRNA在肿瘤的发生、发展、预后判断以及许多其他疾病状态下扮演着重要角色，精确检测其表达情况对于研究miRNA的作用具有重大意义，目前检测miRNA的方法主要有northern blot技术、实时荧光定量PCR技术、原位杂交技术、微阵列芯片技术等。其中northern blot技术是RNA检测的早期手段之一，但其特异性和敏感性低，如果样本RNA含量低或存在降解，可能检测不到；原位杂交技术用于检测组织和细胞水平miRNA的分布情况，同时对miRNA进行半定量检测，其不足之处在于不能准确检测到低表达的miRNA；微阵列芯片技术是一种高通量的检测技术，能同时检测一种或多种样本的大量的miRNA，但存在芯片制作费时、费力、标记成本高、检测灵敏度与特异性低等问题。
[0004] 实时荧光定量技术（RT-qPCR）是目前最普遍用于基因表达检测的技术之一，具有简便快速、敏感性高和特异性好等特点。目前用于检测miRNA的实时荧光定量PCR方法包括RNA逆转录和下游的荧光定量PCR两部分，其中逆转录根据反转录引物的不同分为两种：同聚物加尾法和茎环逆转录法；荧光定量PCR的检测分为染料法和探针法，其中目前检测miRNA的探针多为Taqman-MGB探针（一种适合于扩增短片段的荧光探针）。由于成熟的miRNA具有片段短小的特点，要特异的检测，探针法更有优势，在敏感性和特异性上优于染料法。基于茎环结构的逆转录引物能特异识别，扩增成熟的miRNA序列，而miRNA的前体并未被扩增，Taqman-MGB探针检测miRNA的缺点在于合成价格贵，不利于推广。
[0005] 目前AllGlo探针已经成功应用于检测疱疹病毒、乙型肝炎病毒基因突变（Feng,Z.L.Yu,X.Y.Lu,Z.M.Geng,D.Y.Zhang,L.Chen,S.J.Rapid detection of the TMhepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo probes[J].Clin Chim Acta,2011，
412(11-12)：1018-1021）、侵袭性曲霉菌病（Wu,D.S.Shen,J.Z.Zhou,X.Q.Shen,S.F.Wu,X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke Za Zhi,2010,49(2):142-145）、K-ras基因突变、强直性脊柱炎等检测。
发明内容
[0006] 针对现有检测血浆miRNA方法中使用的试剂盒和检测方法存在的上述缺陷，本发明的第一个目的在于提供检测三种血浆miRNA的特异引物。
[0007] 本发明的第二个目在于提供基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆miRNA检测试剂盒。
[0008] 本发明的第三个目的在于提供一种基于AllGlo探针荧光定量PCR的三种血浆miRNA检测方法。
[0009] 所述三种血浆miRNA分别是指hsa-miR-504、hsa-miR-133b、cel-miR-39；其中hsa-miR-504与hsa-miR-133b为人源性miRNA，cel-miR-39为线虫来源的miRNA，作为一种外源性参照miRNA，从血浆提取开始加入血浆中，作用在于能够从提取miRNA开始监测整个实时荧光定量PCR的全过程。
[0010] 所述检测三种血浆miRNA的特异引物包括三种血浆miRNA特异性逆转录引物和三种血浆miRNA特异性正向引物；
[0011] 所述三种血浆miRNA特异性逆转录引物由hsa-miR-504的特异性逆转录引物、hsa-miR-133b的特异性逆转录引物和cel-miR-39的特异性逆转录引物组成；
[0012] 所述hsa-miR-504的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1 5＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGATAGAGT-3＇；
[0013] 所述hsa-miR-133b的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2 5＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTAGCTGGT-3＇；
[0014] 所述cel-miR-39的特异性逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3 5＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAAGCTGA-3＇。
[0015] 所述三种血浆miRNA特异性正向引物由hsa-miR-504的特异性正向引物、hsa-miR-133b的特异性正向引物和cel-miR-39的特异性正向引物组成；
[0016] 所述hsa-miR-504的特 异性正 向引物 的核苷 酸序列 为SEQ ID NO.45＇-GCTGGTTAAGACCCTGGT-3＇；
[0017] 所 述hsa-miR-133b的 特 异 性 正 向 引 物 核 苷 酸 序 列 为 SEQ ID NO.55＇-TAGCGTCTTTGGTCCCCT-3＇；
[0018] 所述 cel-miR-39的特 异 性 正向 引 物的 核 苷酸 序 列为 SEQ ID NO.65＇-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3＇。
[0019] 所述三种血浆miRNA特异性AllGlo探针由hsa-miR-504的特异性AllGlo探针、hsa-miR-133b的特异性AllGlo探针和cel-miR-39的特异性AllGlo探针组成；
[0020] 所述hsa-miR-504的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.7MAR-CTGGATACGACGATAGAGTGC-MAR；
[0021] 所述hsa-miR-133b的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.8JUP-CTGGATACGACTAGCTGGTTGA-JUP；
[0022] 所述cel-miR-39的特异性AllGlo探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.9NEP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-NEP。
[0023] 所述三种血浆 miRNA的通用引物序列的核苷酸序列为 SEQ IDNO.105＇-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3＇。
[0024] 所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒设有盒体、隔板、miRNA提取试剂瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶；隔板设在盒体内，miRNA提取试剂瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上，miRNA提取试剂瓶内装有miRNA提取试剂，茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂。
[0025] 所述miRNA提取试剂包括血浆miRNA外源性参照，所述血浆miRNA外源性参照是指人工合成的cel-miR-39的模拟物（人工合成的cel-miR-39的模拟物作为一种外源性加入的参照，其工作浓度为5n mol，作用在于能够监测从提取microRNA到后面实时荧光定量PCR全过程的反应效率）。
[0026] 所述茎环逆转录试剂包括以下组份：200单位/μL的MMLV酶、10m mol dNTP混合液、5×RT缓冲液（5×RT缓冲液由250m mol Tris-HCl，375m mol KCl，15m mol MgCl2，50m molDTT组成）、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10m mol的MgCl2、1μmol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品（这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA，浓度为100nmol）。
[0027] 所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液(10×Taq缓冲液包括100mmolTris-HCl，500m mol KCl）、10m mol的MgCl2、5单位/μL的Taq聚合酶、10mMdNTP混合液、100ml无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和AllGlo探针。
[0028] 所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测方法，包括以下步骤：
[0029] 1.在200μL血浆充分裂解后加入所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆miRNA检测试剂盒中提供的工作浓度为5n mol的血浆miRNA外源性参照，立即进行漩涡震荡15s，其余步骤同常规方法；
[0030] 2.应用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆miRNA检测试剂盒提供的茎环逆转录试剂将miRNA逆转录为cDNA；
[0031] 3.应用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆miRNA检测试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时荧光定量PCR扩增；
[0032] 4.综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值（Threshold）和基线（Baseline），进行结果分析。
[0033] 所述AllGlo探针可采用美国A1leLogic Biosciences Corporation公司的荧光定量探针，它拥有普通Taqman，Taqman-MGB及分子信标(molecular beacon)探针所有优点，去掉了目前这几种探针的最大弊端，它打破了传统Taqman一端报告基团一端淬灭基团的限制，利用了美国A1leLogic Biosciences Corporation公司研制的几种常见波长的特制荧光染料，标记在寡核苷酸上面互为报告基团和粹灭基团，而且上面含有特殊的可以提高Tm值（退火温度）的化学基团，提高探针特异性，杂交特异性大大提高，在杂交水解之后两端标记的染料又全部变为报告基团，提高荧光增量。
[0034] 所述AllGlo探针具有以下优势：①提高Tm值（可达10℃以上），探针更短可以达到15～16个碱基，可以适用A,T含量比较高的序列设计探针；②加大了多重荧光定量的选择，因为每种染料即是报告基团又是淬灭基团，打破传统Taqman探针因波长原因标记选择困难，不受淬灭基团波长限制；③大大提高信噪比，无背景信号，空间距离近，更好的淬灭效果；④成本较低，价格仅相当于Taqman-MGB探针的一半，具有MGB探针所有优势。
[0035] 本发明采用了AllGlo探针技术，设计了三种特异正向引物和特异探针和通用反向引物，三种探针两端只需分别标记三种特殊荧光基团（MAR、JUP、NEP），能够同时检测三种miRNA,并对该技术反应条件进行优化，建立了一种基于AllGlo探针技术联合实时荧光定量PCR技术同时检测三种血浆miRNA的方法，应用前景广阔。
[0036] 本发明采用了AllGlo探针技术，建立了能检测miRNA的实时荧光定量PCR的方法，与Taqman-MGB探针法相比，线性范围均能达到7个数量级。本发明建立的实时荧光定7
量PCR灵敏度最低可达10拷贝/μL，最高可达10拷贝/μL。
[0037] 本发明的有益效果如下：
[0038] 本发明提供了一种检测miRNA基于AllGlo探针RT-qPCR的检测方法和试剂盒，其特异性和敏感性高，可快速准确检测样本中miRNA的含量，与现有技术相比具有以下优势：
[0039] 1.与northern blot，miRNA芯片相比，AllGlo探针检测的特异性和敏感性均要高，价格比microRNA芯片要便宜；
[0040] 2.与taqman-MGB探针相比，AllGlo探针采用相同的荧光基团，互为报告基团和淬灭基团，一方面释放的荧光信号更强，另一方面本底信号更低；而且合成程序简单，价格仅相当于taqman-MGB的一半。
[0041] 3.本发明建立了基于AllGlo探针的RT-qPCR检测miRNA方法，适合于做为芯片筛选miRNA的的后期临床样本验证，以及研究miRNA在不同领域的差异性表达等，推动了miRNA在相关疾病的深入研究。
附图说明
[0042] 图1为本发明实施例基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒的结构组成示意图。
[0043] 图2为AllGlo探针实时荧光定量PCR检测三种标准品混合液中hsa-miR-133b（人源性miR-133b）的扩增曲线图。
[0044] 图3为AllGlo探针实时荧光定量PCR检测三种标准品混合液中hsa-miR-133b（人源性miR-133b）的标准曲线图。
具体实施方式
[0045] 实施例1
[0046] 参见图1，本发明所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒实施例设有盒体1、隔板2、miRNA提取试剂瓶3、茎环逆转录试剂瓶4、实时荧光定量PCR试剂瓶5；隔板2设在盒体1内，miRNA提取试剂瓶3、茎环逆转录试剂瓶4、实时荧光定量PCR试剂瓶5插在隔板2上，miRNA提取试剂瓶3内装有miRNA提取试剂，茎环逆转录试剂瓶4内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶5内装有实时荧光定量PCR试剂。
[0047] 所述miRNA提取试剂包括血浆miRNA外源性参照，所述血浆miRNA外源性参照是指人工合成的cel-miR-39的模拟物（人工合成的cel-miR-39的模拟物做为一种外源性加入的参照，其工作浓度为5n mol，作用在于能够监测从提取microRNA到后面实时荧光定量PCR全过程的反应效率）。
[0048] 所述茎环逆转录试剂包括以下组份：200单位/μL的MMLV酶、10m mol dNTP混合液、5×RT缓冲液（5×RT缓冲液由250m mol Tris-HCl，375m mol KCl，15m mol MgCl2，50m molDTT组成）、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10m mol的MgCl2、1μmol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品（这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA，浓度为100nmol）。
[0049] 所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液(10×Taq缓冲液包括100mmolTris-HCl，500m mol KCl）、10m mol的MgCl2、5单位/μL的Taq聚合酶、10mMdNTP混合液、100ml无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和AllGlo探针。
[0050] 实施例2
[0051] 本发明的具体操作步骤及反应体系如下：
[0052] 1.提取miRNA
[0053] 采用天根生物科技有限公司的生产的miRNA提取试剂盒,按照操作说明书进行样本（血浆）microRNA提取，其中200μL血浆在加入等体积裂解液静置5min后加入外源性参照cel-mir395μL(工作浓度为5n mol)，后按照说明书操作进行，最后用30μL的去核酶水溶解RNA，于核酸分光光度仪器Nano Drop2000上分别测定浓度和纯度，取2～20ng的已提取的miRNA用于下游的逆转录，其余的miRNA均于-80℃冻存。
[0054] 2.miRNA的逆转录：
[0055] 2.1将逆转录所需成分于室温下溶解，震荡混匀后置于冰上；
[0056] 2.2配制逆转录反应混合液，按表1进行配制：
[0057] 表1
[0058]组分 体积/管（μL）
MMLV逆转录酶(200单位/μL）（promega公司） 0.2
MMLV5倍逆转录酶缓冲液（promega公司） 4
脱氧核苷混合液（10m mol） 0.8
RNA酶抑制剂（40单位/μL） 0.2
特异性茎环逆转录引物（1μmol) 1.2
无核酶水 11.6
总体积 18
[0059] 2.3在0.2μL的独立PCR管中每管分装
[0060] 将配好的18μL混合液分装于无RNA酶的PCR管中，后加入2μL已提取富集的miRNA溶液，用无RNA酶枪头充分混匀（此操作尽量避免气泡的产生），短暂离心甩至管底后置于普通PCR仪（Biorad公司生产）上，逆转录反应条件如表2。
[0061] 表2
[0062]步骤 条件
1 25℃5min
2 42℃60min
3 70℃15min
[0063] 反应结束后置于4℃。
[0064] 3.miRNA的荧光定量PCR检测
[0065] 3.1将荧光定量PCR的各组分置于室温溶解，混匀后置于冰上。
[0066] 3.2配制PCR反应混合液如表3。
[0067] 表3
[0068]组分 每管体积（μL)
dNTP混合液（10m mol) 2
MgCl2(25m mol) 2
10×Taq缓冲液(无Mg2+) 2
rTaq(5单位/μL)(takara公司) 0.2
正向引物（10μmol) 0.4
反向引物(10μmol) 0.4
探针(10μmol) 0.2
去核酶水 10.8
总体积 18
[0069] 3.3于8联管中分装配制好PCR反应混合液，每管加入2μL的cDNA，充分混匀，整个过程在冰上进行，避免气泡的产生。
[0070] 3.4荧光定量PCR反应反应条件如表4。
[0071] 表4
[0072]
[0073] 检测在实时荧光定量PCR仪器上进行，可使用ABI7300，7500（美国Applied Biosystems公司）等多种仪器。
[0074] 4.数据分析与标准化处理：应用SPSS13.0以及Excel2007进行数据分析，用上述方法可测的样本血浆中目标miRNA和外源性参照cel-mir-39的CT值，根据外源性参照的CT值水平求得目的miRNA在血浆中的相对含量，以qPCR中相对定量的2-ΔCt方式表示血浆中目的miRNA的水平（ΔCt为目的microRNA与外源性参照的Ct值之差)。
[0075] 实施例3
[0076] 3种miRNA混合的荧光定量PCR反应体系及标准曲线的建立如表5。
[0077] 表5
[0078]成分 体积/每管（μL）
dNTP混合液（10m mol) 4
MgCl2(25m mol) 4
10×Taq缓冲液(无Mg2+) 4
rTaq(5单位/μL)(takara公司) 0.4
3对正，反向引物混合液（10μmol） 4.8
3种探针混合液（10μmol) 1.2
去核酶水 19.6
总体积 38
[0079] 预先将3种microRNA标准品稀释至5×107拷贝/μL的miRNA起始浓度，进行混合后，进行连续10倍稀释，后进行RT-qPCR检测，以hsa-miR-133b为例，其扩增曲线和标准曲线如图2和3。
[0080] 实施例4
[0081] 临床样本检测：
[0082] 选取患者血浆样本各5例，应用AllGlo探针法检测hsa-miR-133b，与美国的life technologies公司的检测hsa-miR-133b的microRNA Taqman MGB的方法进行比较，分别做2个复孔。
[0083] 三种方法分别检测5例结直肠癌组织样本中hsa-miR-133b的结果比较如表6。
[0084] 表6
[0085]Hsa-miR-133b/CT值比较 单重AllGlo探针法 Taqman-MGB法 三重AllGlo探针法样本1 30.703±0.61 33.107±0.27 30.729±0.738
样本2 30.487±0.49 33.053±0.13 28.946±0.537
样本3 31.073±0.403 32.43±0.51 30.4±0.129
样本4 30.183±0.084 34.085±0.106 32.431±0.134
样本5 31.862±0.234 32.81±0.27 29.88±0.455
[0086] 说明：检测同一个样本，CT值越低说明敏感性越高，从上表的数据显示：与Taqman-MGB探针法检测5个不同的样本相比，单重AllGlo探针法和三重AllGlo探针法在检测血浆样本has-miR-133b的CT值要低于Taqman-MGB探针法，说明两者的敏感性要明显高于Taqman-MGB探针法。
