含有佐剂的以MUC1为基础的糖脂肽疫苗

摘要

本文提供用于免疫疗法和/或癌症治疗的脂质体糖脂肽疫苗制剂，其包含佐剂和免疫原。

权利要求

1.一种脂质体疫苗制剂，其包含：(a)以下结构的糖脂肽：

H2N-TSAPDT(Tn)RPAPGS(Tn)T(Tn)APPAHGVTSAPDT(Tn)RPAPGS(Tn)T(Tn)APPAHGVS*S*L-OHSEQ ID NO:2

其中

Tn在每次出现时独立地表示共价连接到丝氨酸或苏氨酸残基的α-N-乙酰半乳糖胺(GalNAcα1)；且*在每次出现时独立地表示共价连接到丝氨酸残基的C14脂质；

(b)以下结构的佐剂：

或其药学上可接受的盐；和

(c)载体脂质；

其中(a)与(b)的重量/重量比为10:1至1:10。

2.如权利要求1所述的制剂，其中所述C14脂质为肉豆蔻酰基链。

3.如权利要求1所述的制剂，其中所述佐剂是或其药学上可接受的盐。

4.如权利要求3所述的制剂，其中所述佐剂是药学上可接受的三乙胺盐。

5.如权利要求1所述的制剂，其中所述载体脂质选自DMPG、DPPC或其药学上可接受的盐或其组合。

6.如权利要求1所述的制剂，其进一步包含胆固醇。

7.如权利要求1所述的制剂，其中所述制剂被冻干。

8.如权利要求1所述的制剂，其中所述制剂被冻干并被进一步重建。

说明书

含有佐剂的以MUC1为基础的糖脂肽疫苗

[0001] 交叉参考

[0002] 本申请要求于2011年2月24日提交的美国临时申请第61/446,332号以及于2011年3月31日提交的美国临时申请第61/470,449号的权益，各申请以全文引入本文中作为参考。

[0003] 序列表

[0004] [0001.1]本申请含有经EFS-Web提交的ASCII格式的序列表，该序列表由此以引用方式完整并入。所述ASCII副本创建于2012年2月23日，命名为34395PCT.txt，大小为7,683字节。

背景技术

[0005] 癌症的免疫疗法会指引免疫系统识别肿瘤相关抗原并攻击癌细胞。

发明内容

[0006] 本文提供免疫原性疫苗制剂，其利用免疫系统来治疗恶性肿瘤。在一些实施方案中，本文所述的免疫治疗性制剂会引起抗原特异性B-细胞和/或T-细胞应答。在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含合成抗原，该合成抗原会引起识别肿瘤相关抗原并攻击癌细胞的免疫应答。本文所述的免疫原性疫苗制剂加强了现有癌症治疗方案的效力。

[0007] 本文提供脂质体疫苗制剂，其包含:

[0008] (a)肽，其包含至少两个拷贝的核心串联重复：

[0009] TSAPDTRPAPGSTAPPAHGV，（SEQ ID NO:1）

[0010] 或与SEQ ID NO:1至少85%相同的序列，或其线性排列；

[0011] 其中

[0012] S和T在每次出现时都独立地任选地被癌症相关的糖表位Te取代；

[0013] (b)共价连接到(a)的脂肽，其具有通式:

[0014] H2N-(aa1)*(aa2)*(aa3)-OH

[0015] 其中

[0016] aa1在每次出现时独立地选自S、T、K、R或C；

[0017] aa2在每次出现时独立地选自S、T、K、R或C；

[0018] aa3在每次出现时独立地选自L或G；

[0019] *在每次出现时独立地表示共价连接到氨基酸残基的脂质；

[0020] (c)式I的佐剂或其药学上可接受的盐：

[0021]

[0022] 其中R1、R2、R3、R5、R6和R7中的至少一个为选自下组的强亲脂性基团：

[0023]

[0024] 其中X、X1、X2和X3独立地为-CO-或-CH2-；

[0025] Z为-NH-或-O；

[0026] k、m和r独立地为0至30的整数（包含0和30），

[0027] n和q独立地为0至6的整数（包含0和6）；

[0028] 其中Y4为选自-O-、-S-和-NH-的间隔基，其中Y1R1、Y2R2、Y3R3、Y5R5、Y6R6和Y7R7中的至少一个为单价磷酸等效物（MPE），

[0029] 其中每个单价磷酸等效物独立地为

[0030] (a)-R′-C(O)OH，其中R′是取代或未取代的1-4个碳的烷基，或

[0031] (b) 独 立 地 选 自 -OB(OH)OR、-OP(O)(OH)OR、-OS(O)(O)(OH)OR 和 -OP(=O)(OH)-O-P(=O)(OH)OR，

[0032] 其中R是氢或取代或未取代的1-4个碳的烷基，并且如

[0033] 果R是取代的烷基，则该取代基是-OH或-NH2，

[0034] 其中R8选自H、OH、OR9、与Y8组合形成如先前所定义的单价磷酸等效物的部分，及如上所定义的基团(i)-(viii)；其中R9为1至10个碳长度的烷基或酰基；且

[0035] 其中该糖苷键是α或β；

[0036] 或者

[0037] 式II的佐剂或其药学上的盐：

[0038]

[0039] 其中R1、R2、R3、R11、R12和R13中的至少一个为选自上述(i)-(viii)的强亲脂性基团；

[0040] 其中Y4为选自-O-、-S-和-NH-的间隔基，并且

[0041] 其中Y1R1、Y2R2、Y3R3、Y11R11、Y12R12和Y13R13中的至少一个独立地为如先前所定义的单价磷酸等效物；

[0042] 其中下列限制适用于上述的(I)以及(II)：

[0043] Y1、Y2、Y3、Y5、Y6、Y7、Y11、Y12和Y13为独立地选自-O-、-S-和-NH-的间隔基；

[0044] R1、R2、R3、R5、R6、R7、R11、R12和R13独立地为氢、与共同编号的Y基团形成如先前所定义的单价磷酸等效物的部分，或

[0045] 选自上述(i)-(viii)的强亲脂性基团；

[0046] 所述化合物的强亲脂性基团共同提供至少两个主要碳链，且

[0047] 所述强亲脂性基团的主要碳链共同提供至少30个碳原子；和

[0048] (d)一种或多种载体脂质。

[0049] 在一些实施方案中，该制剂为冻干的粉剂、干燥的薄膜或干燥的粉剂。在一些实施方案中，该制剂为冻干的粉剂。在一些实施方案中，该疫苗制剂为水中的悬浮液、乳液或油中的悬浮液。在一些实施方案中，该制剂为水中的悬浮液。在一些实施方案中，该制剂进一步包含叔丁醇。

[0050] 在一些实施方案中，该核心串联重复序列与(a)中的序列具有至少90%的同源性。在一些实施方案中，该核心串联重复序列与(a)中的序列具有至少95%的同源性。

[0051] 在一些实施方案中，该载体脂质选自双肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）、双棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、磷脂酰胆碱（PC；卵磷脂）、磷脂酸（PA）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）。其他适合的磷脂进一步包括双硬脂酰基磷脂酰胆碱（DSPC）、双肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、双棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）、双硬脂酰基磷脂酰甘油（DSPG）、双棕榈酰磷脂酸（DPPA）、双肉豆蔻酰磷脂酸（DMPA）、双硬脂酰基磷脂酸（DSPA）、双棕榈酰磷脂酰丝氨酸（DPPS）、双肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（DMPS）、双硬脂酰基磷脂酰丝氨酸（DSPS）、双棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、双肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE）、双硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE）或其药学上可接受的盐或其组合。

[0052] 在一些实施方案中，该载体脂质选自双肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）、双棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）或其药学上可接受的盐或其组合。

[0053] 在一些实施方案中，该制剂还包含胆固醇。

[0054] 在一些实施方案中，该共价连接到氨基酸残基的脂质在每次出现时独立地选自肉豆蔻酰基、棕榈酰基、月桂基、硬脂酰基、癸酰基和辛酰基链或其组合。在一些实施方案中，共价连接到氨基酸残基的脂质在每次出现时独立地为肉豆蔻酰基链。

[0055] 在一些实施方案中，(b)连接到(a)的羧基末端。在一些实施方案中，(b)连接到(a)的氨基末端。

[0056] 在一些实施方案中，(a)+(b)和(c)的重量(a)+(b):重量(c)比例为约1:10至约10:1。在一些实施方案中，(a)+(b)和(c)的重量(a)+(b):重量(c)比例为约1:5至
约5:1。在一些实施方案中，(a)+(b)和(c)的重量(a)+(b):重量(c)比例为约1:2至约
2:1。

[0057] 在一些实施方案中，Te在每次出现时独立地选自

[0058]

[0059] 和T-半抗原。

[0060] 在一些实施方案中，Te在每次出现时独立地选自

[0061]

[0062] 和T-半抗原。

[0063] 在一些实施方案中，肽被至少一个癌症相关的糖Te所取代。在一些实施方案中，该肽被至少两个Te所取代。在一些实施方案中，该肽被至少三个Te所取代。在一些实施方案中，该肽被至少四个Te所取代。在一些实施方案中，该肽被至少五个Te所取代。在一些实施方案中，该肽被至少五个Te所取代。在一些实施方案中，该肽被至少六个Te所取代。在一些实施方案中，该肽被至少七个Te所取代。在一些实施方案中，该肽被至少八个Te所取代。在一些实施方案中，该肽被至少九个Te所取代。在一些实施方案中，该肽被至少十个Te所取代。

[0064] 在一些实施方案中，佐剂为式I化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该佐剂为式II化合物或其药学上可接受的盐。

[0065] 在一些实施方案中，Y4是-S-。在一些实施方案中，Y4是-NH-。在一些实施方案中，Y4是-O-。

[0066] 在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(i)，并且对于至少一个这样的基团，k为4-30的整数。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(ii)，并且对于至少一个这样的基团，2k+3n为4-30的整数。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(iii)，并且对于至少一个这样的基团，m+n+l是4-30。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(iv)，并且对于至少一个这样的基团，m+n+1是4-30。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(v)，并且对于至少一个这样的基团，m+n+k+1是4-30。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(vi)，并且对于至少一个这样的基团，k+m+2是4-30。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(vii)，并且对于至少一个这样的基团，k+q+m+n是4-30。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(viii)，并且对于至少一个这样的基团，r+k+q+m+n是5-30。

[0067] 在一些实施方案中，Yl、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y11、Y12和Y13独立地为-O-或-NH-。在一些实施方案中，Yl、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6和Y7独立地为-O-或-NH-。在一些实施方案中，Yl、Y2、Y3、Y4、Y11、Y12、Y13独立地为-O-或-NH-。

[0068] 在一些实施方案中，Y4是-O-。在一些实施方案中，每个单磷酸等效物是-OP(O)(OH)(OH)。

[0069] 在一些实施方案中，式I的佐剂为一种化合物,其中

[0070] Y4为-O-；

[0071] Y1、Y2和Y7为-O-；

[0072] Y3、Y5和Y6独立地为-O-或-NH-；

[0073] R1、R3、R5和R6独立地为氢或选自(i)-(viii)的强亲脂性基团；

[0074] R1、R3、R5和R6中的至少一个不是氢；

[0075] R2和R7独立地选自H、-P(O)(OH)2、-SO3H、-P(O)(OH)(OCH2CH2NH2)和-CH2COOH；且[0076] R8选自H、OH、OSO3H和OR9，其中R9是1至10个碳长度的烷基或酰基。

[0077] 在一些实施方案中，式I的佐剂为一种化合物，其中

[0078] Y4为-O-；

[0079] Y2和Y12为-O-p；

[0080] Y1、Y3、Y11和Y13独立地选自-O-、-NH-和-S-；

[0081] R1、R3、R11和R13独立地为氢或选自(i)-(viii)的强亲脂性基团；

[0082] R1、R3、R5和R6中的至少一个不是氢；且

[0083] R2和R12独立地选自H、-P(O)(OH)2、-P(O)(OH)(OCH2CH2NH2)和-CH2COOH。

[0084] 在一些实施方案中，R1、R3、R5和R6独立地为氢或选自(i)-(viii)的强亲脂性基团，R1、R3、R5和R6中的至少一个不是氢，且R2和R7独立地选自H、-P(O)(OH)2、-SO3H、-P(O)(OH)(OCH2CH2NH2)和-CH2COOH；且R8选自H、OH、OSO3H和OR9，其中R9是1至10个碳长度的烷基或酰基。

[0085] 在一些实施方案中，R1、R3、R11和R13独立地为氢或选自(i)-(viii)的强亲脂性基团；R1、R3、R5和R6中的至少一个不是氢；且R2和R12独立地选自H、-P(O)(OH)2、-P(O)(OH)(OCH2CH2NH2)和-CH2COOH。

[0086] 在一些式I的实施方案中，每个单磷酸等效物为

[0087] -OP(O)(OH)(OH)。在一些式II的实施方案中，每个单磷酸等效物为-OP(O)(OH)(OH)。

[0088] 在一些实施方案中，所述化合物的强亲脂性基团共同提供至少三个主要碳链，且其中所述强亲脂性基团的主要碳链共同提供至少40个碳原子，所述佐剂具有免疫刺激活性。在一些实施方案中，所述化合物的强亲脂性基团共同提供至少四个主要碳链，且其中该主要碳链共同提供至少50个碳原子，所述佐剂具有免疫刺激活性。在一些实施方案中，该强亲脂性基团共同提供六个主要碳链。在一些实施方案中，每个主要碳链的特征在于所述链中有10、12、14、16、18或20个碳原子。

[0089] 在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团为以下所列结构中的一种：

[0090]

[0091] 在一些实施方案中，该至少一个强亲脂性基团包含R对映异构体。在一些实施方案中，该至少一个强亲脂性基团包含S对映异构体。在一些实施方案中，该至少一个强亲脂性基团是外消旋物。在一些实施方案中，该至少一个强亲脂性基团包含RR、RS、SR或SS非对映异构体。所有外消旋物、对映异构体或非对映异构体均被涵盖在本文所提出的实施方案的范围内。在一些实施方案中，该至少一个强亲脂性基团为以下所列结构中的一种：

[0092]

[0093] 在一些实施方案中，该至少一个强亲脂性基团为以下所列结构中的一种：

[0094]

[0095] 在一些实施方案中，式I的佐剂是PET脂质A的类似物。在一些实施方案中，式I的佐剂具有以下结构：

[0096]

[0097] 其中R1、R3、R5和R6独立地为氢或选自下组的亲脂性基团：

[0098]

[0099] 其中X、X1、X2和X3独立地为-CO-或-CH2-；

[0100] Z为-NH-或-O-；

[0101] k、m和r独立地为0至30的整数（包含0和30），

[0102] n和q独立地为0至6的整数（包含0和6）；

[0103] R1、R3、R5和R6中的至少一个不是氢；

[0104] R2和R7独立地选自H、-P(O)(OH)2、-SO3H、-P(O)(OH)(OCH2CH2NH2)和-CH2COOH；且[0105] R9是H或1至10个碳长度的烷基或酰基。

[0106] 在一些实施方案中，R1和R9为氢；R2为氢或膦酰基-P(O)(OH)2；R7是膦酰基-P(O)(OH)2；且R3、R5和R6为相同或不同的具有下列结构的酰基

[0107]

[0108] 其中m和n独立地选自6至10之间的整数（包含6和10）。

[0109] 在一些实施方案中，R3、R5和R6是相同的。

[0110] 在一些实施方案中，佐剂具有以下所列结构中的一种：

[0111]

[0112] 在一些实施方案中，佐剂具有下列结构

[0113]

[0114] 在一些实施方案中，佐剂具有以下所列结构中的一种：

[0115]

[0116] 在一些实施方案中，佐剂具有下列结构

[0117]

[0118] 在一些实施方案中，佐剂具有下列结构：

[0119]

[0120] 其中R3、R5和R6为相同或不同的具有下列结构的取代基

[0121]

[0122] 其中m和n独立地选自6至10之间的整数（包含6和10）。

[0123] 在一些上述的实施方案中，佐剂是三乙胺盐、三乙醇胺盐或铵盐。在一些上述的实施方案中，佐剂是三乙胺盐。在一些上述的实施方案中，佐剂是PET脂质A类似物的三乙胺盐。

[0124] 在一些上述的实施方案中，a包含

[0125] H2N-TSAPDT(Tn)RPAPGS(Tn)T(Tn)APPAHGVTSAPDT(Tn)RPAPGS(Tn)T(Tn)APPAHGVS*S*L-OH（SEQ ID NO:2），其中Tn表示GalNAcα1。

[0126] 在一些上述的实施方案中，脂质体疫苗制剂包含：

[0127] (a)肽，其包含至少两个拷贝的核心串联重复：

[0128] T(Te)S(Te)APDT(Te)RPAPGS(Te)T(Te)APPAHGV，SEQ ID NO:18或与SEQ ID NO:18至少85%相同的序列，或其线性排列；

[0129] 其中

[0130] Te表示癌症相关的糖表位；

[0131] (b)共价连接到(a)的脂肽，其具有通式：

[0132] H2N-S*S*L-OH

[0133] 其中

[0134] *在每次出现时独立地表示共价连接到丝氨酸残基的脂质。

[0135] 在一些上述的实施方案中，疫苗制剂包含:

[0136] (a)肽，其包含至少两个拷贝的核心串联重复：

[0137] TSAPDT(Te)RPAPGS(Te)T(Te)APPAHGV，SEQ ID NO:19或与SEQ ID NO:19至少85%相同的序列，或其线性排列；

[0138] 其中

[0139] Te表示癌症相关的糖表位；

[0140] (b)共价连接到(a)的脂肽，其具有通式:

[0141] H2N-S*S*L-OH

[0142] 其中

[0143] *在每次出现时独立地表示共价连接到丝氨酸残基的脂质。

[0144] 在一些实施方案中，该制剂包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的核心串联重复序列的2-10个串联重复。在一些实施方案中，该制剂包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的核心串联重复序列的2-5个串联重复。在一些实施方案中，该制剂包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的核心串联重复序列的2个串联重复。

[0145] 在一些这样的实施方案中，该制剂是冻干的粉剂、干燥的薄膜或干燥的粉剂。在一些这样的实施方案中，该制剂是冻干的粉剂。在一些这样的实施方案中，该疫苗制剂是水中的悬浮液、乳液或油中的悬浮液。在一些实施方案中，该制剂是水中的悬浮液。在一些这样的实施方案中，该制剂进一步包含叔丁醇。

[0146] 在一些这样的实施方案中，核心串联重复序列与如上述或本文的任何实施方案中所述的(a)中序列有至少90%的同源性。在一些这样的实施方案中，核心串联重复序列与如上述或本文的任何实施方案中所述的(a)中序列有至少95%的同源性。

[0147] 在一些这样的实施方案中，载体脂质选自双肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）、双棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、磷脂酰胆碱（PC；卵磷脂）、磷脂酸（PA）、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）。其他适合的磷脂进一步包括双硬脂酰基磷脂酰胆碱（DSPC）、双肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、双棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）、双硬脂酰基磷脂酰甘油（DSPG）、双棕榈酰磷脂酸（DPPA）、双肉豆蔻酰磷脂酸（DMPA）、双硬脂酰基磷脂酸（DSPA）、双棕榈酰磷脂酰丝氨酸（DPPS）、双肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（DMPS）、双硬脂酰基磷脂酰丝氨酸（DSPS）、双棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、双肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE）、双硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE），或其药学上可接受的盐，或其组合。

[0148] 在一些这样的实施方案中，载体脂质选自双肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）、双棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）或其药学上可接受的盐或其组合。

[0149] 在一些这样的实施方案中，共价连接到氨基酸残基的脂质在每次出现时独立地选自肉豆蔻酰基、棕榈酰基、月桂基、硬脂酰基、癸酰基和辛酰基链或其组合。

[0150] 在一些这样的实施方案中，该制剂进一步包含胆固醇。

[0151] 在一些这样的实施方案中，共价连接到丝氨酸残基的脂质在每次出现时独立地为肉豆蔻酰基链。

[0152] 在一些这样的实施方案中，(b)连接到(a)的羧基末端。在一些这样的实施方案中，(b)连接到(a)的氨基末端。

[0153] 在一些这样的实施方案中，(a)+(b)和(c)的重量(a)+(b):重量(c)比例为约1:10至约10:1。在一些这样的实施方案中，(a)+(b)和(c)的重量(a)+(b):重量(c)比例为约1:5至约5:1。在一些这样的实施方案中，(a)+(b)和(c)的重量(a)+(b):重量(c)
比例为约1:2至约2:1。

[0154] 在一些实施方案中，Te是Tn，其中Tn表示GalNAcα1。

[0155] 在一些实施方案中，本文提供脂质体疫苗制剂，其包含:

[0156] (a)以下结构的糖脂肽：

[0157] H2N-TSAPDT(Tn)RPAPGS(Tn)T(Tn)APPAHGVTSAPDT(Tn)RPAPGS(Tn)T(Tn)APPAHGVS*S*L-OH

[0158] SEQ ID NO:2

[0159] 其中

[0160] Tn表示GalNAcα1；且

[0161] *在每次出现时独立地表示共价连接到丝氨酸残基的C14脂质；

[0162] (b)以下结构的佐剂：

[0163]

[0164]

[0165] 或其药学上可接受的盐；和

[0166] (c)载体脂质。

[0167] 在一些实施方案中，C14脂质是肉豆蔻酰基链。

[0168] 在一些实施方案中，佐剂为

[0169] 或其药学上可接受的盐。

[0170] 在一些实施方案中，药学上可接受的盐为三乙胺盐。

[0171] 在一些实施方案中，载体脂质选自DMPG、DPPC或其药学上可接受的盐或其组合。在一些实施方案中，脂质体疫苗制剂进一步包含胆固醇。

[0172] 在任何上述的实施方案中，该制剂包含一个或多个MUC1表位。在任何上述的实施方案中，脂质体具有90%（d90）≤约0.25μm的直径总体分布（diameter population distribution）。在任何上述的实施方案中，脂质体具有90%（d90）≤约0.22μm的直径总体分布。在任何上述的实施方案中，脂质体具有90%（d90）≤约0.20μm的直径总体分布。

[0173] 在另一方面，本文提供脂质体疫苗制剂，其包含:

[0174] (a)肽，其包含至少两个拷贝的核心串联重复：

[0175] TSAPDTRPAPGSTAPPAHGV，（SEQ ID NO:1）

[0176] 或与SEQ ID NO:1至少85%相同的序列，或其线性排列；

[0177] 其中

[0178] S和T在每次出现时独立地任选地被癌症相关的糖表位Te取代；

[0179] (b)共价连接到(a)的脂肽，其具有通式:

[0180] H2N-(aa1)*(aa2)*(aa3)-OH

[0181] 其中

[0182] aa1在每次出现时独立地选自S、T、K、R或C；

[0183] aa2在每次出现时独立地选自S、T、K、R或C；

[0184] aa3在每次出现时独立地选自L或G；

[0185] *在每次出现时独立地表示共价连接到氨基酸残基的脂质；

[0186] (c)佐剂；和

[0187] (d)一种或多种载体脂质。

[0188] 在一些实施方案中，佐剂选自CpG寡脱氧核苷酸（ODN）、皂苷、TLR-9激动剂或脂质A类似物或其药学上可接受的盐或其组合。

[0189] 在一些实施方案中，脂质A类似物是式I的佐剂或其药学上可接受的盐：

[0190]

[0191] 其中R1、R2、R3、R5、R6和R7中的至少一个为选自下组的强亲脂性基团

[0192]

[0193] 其中X、X1、X2和X3独立地为-CO-或-CH2-；

[0194] Z为-NH-或-O；

[0195] k、m和r独立地为0至30的整数（包含0和30），

[0196] n和q独立地为0至6的整数（包含0和6）；

[0197] 其中Y4是选自-O-、-S-和-NH-的间隔基，

[0198] 其中Y1R1、Y2R2、Y3R3、Y5R5、Y6R6和Y7R7中的至少一个为单价磷酸等效物（MPE），[0199] 其中每个单价磷酸等效物独立地为

[0200] (a)-R′-C(O)OH，其中R′是取代或未取代的1-4个碳的烷基，或

[0201] (b) 独 立 地 选 自 -OB(OH)OR、-OP(O)(OH)OR、-OS(O)(O)(OH)OR 和 -OP(=O)(OH)-O-P(=O)(OH)OR，

[0202] 其中R是氢或是取代或未取代的1-4个碳的烷基，并且如果R是取代的烷基，则该取代基是-OH或-NH2，

[0203] 其中R8选自H、OH、OR9、与Y8组合形成如先前所定义的单价磷酸等效物的部分，以及如上所定义的基团(i)-(viii)；其中R9为1至10个碳长度的烷基或酰基；且

[0204] 其中该糖苷键是α或β；

[0205] 或者

[0206] 式II的佐剂或其药学上的盐：

[0207]

[0208] 其中R1、R2、R3、R11、R12和R13中的至少一个为选自以上(i)-(viii)的强亲脂性基团；

[0209] 其中Y4为选自-O-、-S-和-NH-的间隔基，并且

[0210] 其中Y1R1、Y2R2、Y3R3、Y11R11、Y12R12和Y13R13中的至少一个独立地为如先前所定义的单价磷酸等效物；

[0211] 其中下列限制适用于上述的(I)以及(II)：

[0212] Y1、Y2、Y3、Y5、Y6、Y7、Y11、Y12和Y13为独立地选自-O-、-S-和-NH-的间隔基；

[0213] R1、R2、R3、R5、R6、R7、R11、R12和R13独立地为氢，

[0214] 与共同编号的Y基团形成如先前所定义的单价磷酸等效物的部分，或

[0215] 选自上述(i)-(viii)的强亲脂性基团；

[0216] 所述化合物的强亲脂性基团共同提供至少两个主要碳链，并且

[0217] 所述强亲脂性基团的主要碳链共同提供至少30个碳原子。

[0218] 在一些这样的实施方案中，该制剂是冻干的粉剂、干燥的薄膜或干燥的粉剂。在一些实施方案中，该制剂是冻干的粉剂。在一些这样的实施方案中，该疫苗制剂是水中的悬浮液、乳液或油中的悬浮液。在一些实施方案中，该制剂是水中的悬浮液。在一些这样的实施方案中，该制剂进一步包含叔丁醇。

[0219] 在一些这样的实施方案中，核心串联重复序列与如上述或本文的任何实施方案中所述的(a)中序列有至少90%的同源性。在一些这样的实施方案中，核心串联重复序列与如上述或本文的任何实施方案中所述的(a)中序列有至少95%的同源性。

[0220] 在一些这样的实施方案中，载体脂质选自双肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）、双棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、磷脂酰胆碱(PC；卵磷脂)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）。其他适合的磷脂进一步包括双硬脂酰基磷脂酰胆碱（DSPC）、双肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、双棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）、双硬脂酰基磷脂酰甘油（DSPG）、双棕榈酰磷脂酸（DPPA）、双肉豆蔻酰磷脂酸（DMPA）、双硬脂酰基磷脂酸（DSPA）、双棕榈酰磷脂酰丝氨酸（DPPS）、双肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（DMPS）、双硬脂酰基磷脂酰丝氨酸（DSPS）、双棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、双肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE）、双硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE），或其药学上可接受的盐或其组合。

[0221] 在一些这样的实施方案中，载体脂质选自双肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）、双棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）或其药学上可接受的盐或其组合。

[0222] 在一些这样的实施方案中，该制剂进一步包含胆固醇。

[0223] 在一些这样的实施方案中，共价连接到氨基酸残基的脂质在每次出现时独立地选自肉豆蔻酰基、棕榈酰基、月桂基、硬脂酰基、癸酰基和辛酰基链或其组合。在一些这样的实施方案中，共价连接到氨基酸残基的脂质在每次出现时独立地为肉豆蔻酰基链。

[0224] 在一些这样的实施方案中，(b)连接到(a)的羧基末端。在一些这样的实施方案中，(b)连接到(a)的氨基末端。

[0225] 在一些这样的实施方案中，(a)+(b)和(c)的重量(a)+(b):重量(c)比例为约1:10至约10:1。在一些这样的实施方案中，(a)+(b)和(c)的重量(a)+(b):重量(c)比例为约1:5至约5:1。在一些这样的实施方案中，(a)+(b)和(c)的重量(a)+(b):重量(c)
比例为约1:2至约2:1。

[0226] 在一些这样的实施方案中，Te在每次出现时独立地选自

[0227]

[0228] 和T-半抗原。

[0229] 在一些这样的实施方案中，Te是Tn。在一些这样的实施方案中，Te是Tn’。在一些这样的实施方案中，Te是STn。在一些这样的实施方案中，Te是STn’。在一些这样的实施方案中，Te是TF。在一些这样的实施方案中，Te是TF’。在一些这样的实施方案中，Te是STF。在一些这样的实施方案中，Te是STF’。在一些这样的实施方案中，Te是F1α。在一些这样的实施方案中，Te是F1α’。在一些这样的实施方案中，Te是T-半抗原。在一些这样的实施方案中，Te是T-半抗原’。在一些这样的实施方案中，Te在每次出现时独立地选自Tn、Tn’、STn和STn’。在一些这样的实施方案中，Te在每次出现时独立地选自Tn和STn。

[0230] 在一些这样的实施方案中，佐剂选自式I化合物、皂苷、CpGODN和TLR-9激动剂或其药学上可接受的盐或其组合。

[0231] 在一些这样的实施方案中，佐剂选自

[0232]

[0233] 皂 苷、CpG ODN和TLR-9激动剂或其药学上可接受的盐或其组合。

[0234] 在一些这样的实施方案中，疫苗制剂包含

[0235] (a)肽，其包含至少两个拷贝的核心串联重复：

[0236] T(Te)S(Te)APDT(Te)RPAPGS(Te)T(Te)APPAHGV，SEQ ID NO:18或与SEQ ID NO:18至少85%相同的序列，或其线性排列；

[0237] 其中

[0238] Te表示癌症相关的糖表位；

[0239] (b)共价连接到(a)的脂肽，其具有通式:

[0240] H2N-S*S*L-OH

[0241] 其中

[0242] *在每次出现时独立地表示共价连接到丝氨酸残基的脂质。

[0243] 在一些这样的实施方案中，疫苗制剂包含:

[0244] (a)肽，其包含至少两个拷贝的核心串联重复:

[0245] TSAPDT(Te)RPAPGS(Te)T(Te)APPAHGV，SEQ ID NO:19或与SEQ ID NO:19至少85%相同的序列，或其线性排列；

[0246] 其中

[0247] Te表示癌症相关的糖表位；

[0248] (b)共价连接到(a)的脂肽，其具有通式：

[0249] H2N-S*S*L-OH

[0250] 其中

[0251] *在每次出现时独立地表示共价连接到丝氨酸残基的脂质。

[0252] 在一些这样的实施方案中，脂质体疫苗制剂包含:

[0253] (a)以下结构的糖脂肽:

[0254] H2N-TSAPDT(Tn)RPAPGS(Tn)T(Tn)APPAHGVTSAPDT(Tn)RPAPGS(Tn)T(Tn)APPAHGVS*S*L-OH

[0255] SEQ ID NO:2

[0256] 其中

[0257] Tn表示GalNAcα1；且

[0258] *在每次出现时独立地表示共价连接到丝氨酸残基的C14脂质。

[0259] 本文提供用于治疗罹患或疑似罹患表达MUC1肿瘤相关抗原的癌症的个体的方法，其包括向所需个体施用如上所述的脂质体疫苗制剂一段时间。

[0260] 在一些实施方案中，该癌症为乳腺癌、腮腺癌、胃癌、食道癌、头颈癌、胆囊癌、肝细胞癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、急性/慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、弥漫型大B细胞淋巴瘤、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、肺腺癌、鳞状细胞肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肾癌、膀胱癌或泌尿道癌。

[0261] 在一些实施方案中，上述方法进一步包括测定该个体中的免疫应答。在一些实施方案中，测定该治疗个体中的免疫应答括测定该个体中的T细胞增殖。

[0262] 在一些实施方案中，该一段时间选自至少约5天、至少约1周、至少约2周、至少约4周、至少约8周、至少约16周、至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约60周、至少约68周、至少约72周、至少约80周、至少约88周、至少约96周和至少约104周。

[0263] 在一些实施方案中，经由肌肉内、静脉内、皮下、节内、肿瘤内、腹腔内或真皮内注射来施用疫苗组合物。在一些实施方案中，经由皮下注射来施用疫苗组合物。在一些实施方案中，经由泵施用疫苗组合物。在一些实施方案中，经由植入泵（例如经由Alzet 渗透泵）施用疫苗组合物。

[0264] 在一些实施方案中，在用上述疫苗制剂治疗之前用环磷酰胺、达克珠单抗（daclizumab）或伊马替尼（imatinib）治疗该个体。

[0265] 本文还提供用于诱发和/或维持个体中的细胞和体液免疫应答的方法，其包括向个体施用上述的脂质体疫苗制剂一段时间。在一些实施方案中，上述方法还包括测定个体中的T细胞增殖。在其他实施方案中，上述方法包括测定个体中的抗体产生。

[0266] 本文还提供治疗个体中与低糖基化（hypoglycosylated）MUC1有关的疾病、病症或病况的方法，其包括向具有低糖基化MUC1的个体施用上述的脂质体疫苗制剂一段时间。在一些实施方案中，个体中的低糖基化MUC1与癌症有关。在其他实施方案中，上述的脂质体疫苗制剂诱发和/或维持个体中对于低糖基化MUC1特异性的免疫应答。在一些情况下，该免疫应答是细胞免疫应答。在其他情况下，该免疫应答是体液免疫应答。

[0267] 援引并入

[0268] 在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均在此引入本文中作为参考，该引入参考的程度就如同特定和个别地将各个单独的出版物、专利或专利申请引入作为参考一般。

附图说明

[0269] 本发明的新颖特征在随附的权利要求中详细阐明。通过参考以下对在其中利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：

[0270] 图1说明合成脂质体疫苗制剂的过程。

[0271] 图2说明通过透射电子显微镜检查获得的玻璃化、配制的脂质体的图像（图2A），和通过光学显微镜检查获得的重建（reconstituted）的脂质体疫苗的图像（图2B），以及对本文所述的脂质体疫苗制剂的冷冻断裂电子显微镜检查（图2C）。

[0272] 图3说明在用本文所述疫苗制剂免疫的C57BL/6J小鼠的CD8+（图3A）和CD4+（图3B）T淋巴细胞中IFNγ的离体诱导。

[0273] 图4说明IgG与来自用本文所述疫苗制剂免疫的小鼠血清的MUC1抗原相结合的剂量反应。

[0274] 图5说明本文所述的包含SEQ ID NO:2的脂质体疫苗制剂与疫苗制剂BLP25（疫苗A或Vac A）在IgG与糖基化MUC1抗原（上部）和非糖基化MUC1抗原（下部）相结合方面的比较。

[0275] 图6说明在用本文所述疫苗制剂免疫的人类MUC1转基因小鼠中脾细胞的IFNγ的离体诱导（图6A）和IgG抗体的诱导（图6B和6C）。

[0276] 图7说明用来自接种了本文所述疫苗制剂的小鼠的血清对B16-MUC1和B16细胞（图7A）或乳房上皮和乳腺癌细胞（图7B）的FACS分析。

具体实施方式

[0277] 目前存在很多临床上有用的治疗癌症的疗法。在一些情况下，常规癌症治疗的缺点在于该治疗是非特异性的，会同时影响健康细胞以及癌细胞，从而造成毒性副作用。

[0278] MUC1黏蛋白是一种在正常细胞以及癌细胞中表达的高分子量糖蛋白。然而，与肿瘤相关的黏蛋白通常携带改变的糖基化模式。在很多癌症中，MUC1为过度表达和/或低糖基化或异常糖基化。癌组织中的MUC1的异常糖基化会导致核心肽表位暴露在免疫系统下。这些特性使得与肿瘤相关的黏蛋白在抗原性上不同于正常细胞的对应黏蛋白。因此，本文提供免疫原性疫苗制剂，其可诱发靶向在肿瘤和/或癌组织中表达的MUC1抗原的细胞和/或体液免疫应答。

[0279] 在一些实施方案中，本文所述的免疫原性制剂引起抗原特异性的B细胞和/或T细胞应答，该应答可识别肿瘤相关抗原并攻击癌细胞。在一些这样的实施方案中，选择性地攻击癌细胞，从而减少了毒性副作用的可能性。在其他实施方案中，本文所述的免疫原性制剂诱导B细胞产生抗癌抗原的抗体。因此，一种包含使用本文所述的脂质体疫苗制剂的免疫治疗方法具有加强现有癌症疗法的效力的可能性。在一些实施方案中，施用本文提供的脂质体疫苗制剂可延长正在接受本文所述的疫苗治疗的个体的寿命和/或改善其生活质量。

[0280] MUC1黏蛋白

[0281] 黏蛋白是特征为高分子量(>1,000,000道尔顿)及广泛糖基化(经常超过80%)的糖蛋白。人类MUC1的基因产物在很多人类癌细胞上强烈表达，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌和某些卵巢癌细胞。虽然在各种癌症上表达的由MUC1编码的黏蛋白含有相同的串联重复核心肽序列，但仍存在糖基化作用差异。由于在癌细胞中低糖基化，癌细胞上的MUC1分子会表达在正常上皮细胞上不会表达的表位。MUC1黏蛋白由具有细胞外、跨膜和细胞质结构域的膜内在蛋白质构成。MUC1的抗原成分存在于MUC1的胞外域中，其包含由如下所述SEQ ID NO:1的20-mer氨基酸单元的串联重复所构成的糖蛋白。

[0282] 人类MUC1的氨基酸序列可从SWISS-PROT数据库中以P15941获得。重复的数目是高度多态性的。在北欧人群中为21到125不等。最常见的等位基因含有41和85个重
复。关于小鼠MUC1，请参见SWISS-PROT Q02496。

[0283] MUC1为多态性抗原，其特征在于数量可变的下列20-mer核心序列的完全和不完全重复：

[0284] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

[0285] T S A P D T R P A P G S T A P P A H G V

[0286] （SEQ ID NO:1）

[0287] 串联重复的二十肽（icosapeptide）在三个位置发生多态性，如方括号所显示：TSAP[D/E][T/S]RPAPGSTAP[P/A/Q/T]AHGV（SEQ ID NO:3）。常见的多态性为搭配的双突变DT->ES和单一置换P->A、P->Q和P->T。最常见的置换DT>ES发生在至多50%的重复中。

[0288] 包含糖脂肽的疫苗涵盖在本文所示的实施方案的范围中，该糖脂肽包含至少一个MUC1的天然B和/或T细胞表位，或至少一个基本上与这一天然表位相同的突变表位。在一些实施方案中，糖肽任选地包含不是表位一部分的额外MUC1序列。

[0289] 在一些实施方案中，适用于本文所述的脂质体疫苗制剂的糖肽包含MUC1的B细胞表位或T细胞表位（在每一情况下该表位可为天然的表位或其允许的突变体）或其组合。在一些实施方案中，这些表位是相同的、重叠的或不同的。在一些实施方案中，抗原的T和B细胞表位重叠。例如在MUC1的情况下，SAPDTRP，SEQ ID NO:4(即SEQ ID NO:1的氨基酸2-8)是T细胞表位，而PDTRP，SEQ ID NO:5(即SEQ ID NO:1的氨基酸4-8)是B细胞表位。

[0290] 在本文所述疫苗制剂中存在的免疫原上的糖基化位点任选地为以下一个或多个：(1)在MUC1衍生的肿瘤糖蛋白中实际糖基化的位点，(2)可糖基化但实际不在该肿瘤糖蛋白中糖基化的位点，和/或(3)与肿瘤糖蛋白无关的位点。在本文提供的疫苗制剂中存在的免疫原中，没有、有一个、有一些或所有在MUC1衍生的肿瘤糖蛋白中会正常糖基化的糖基化位点是糖基化的。

[0291] 适用于本文所述的疫苗制剂的免疫原包含两个或多个拷贝的前述完整重复序列或其线性排列。

[0292] 每个所述的MUC1表位任选地对应于可变串联重复区域的一个或多个表位，或是对应于该区域外的表位。串联重复区域中的表位包括，例如RPAPGS，SEQ ID NO:6(即SEQ ID NO:1的氨基酸7-12)，PPAHGVT，SEQ ID NO:7(即SEQ ID NO:1的氨基酸15-20和1)，和PDTRP，SEQ ID NO:8(即SEQ ID NO:1的氨基酸4-8)。序列PDTRPAPGS，SEQ ID NO:9(即SEQ ID NO:1的氨基酸4-12)包括两个重叠的表位。PDTRP序列SEQ ID NO:10形成凸出球形物的顶端，其暴露于溶剂中，并形成稳定的II型β-转角（β-turn）。

[0293] 糖脂肽也涵盖在本文所示的实施方案的范围中，该糖脂肽包含至少一个20个氨基酸的序列（核心串联重复），该序列与MUC1的串联重复的不同之处仅仅在于一个或多个保守性取代和/或单一非保守性取代，并包含MUC1的各种可变串联重复区域的表位（完全相同或是可被允许的突变体）。

[0294] 在这些实施方案的一个子集中，糖脂肽包含数个非重叠的核心串联重复，比如两个(总共40个氨基酸)、三个(总共60个氨基酸)、四个、五个、六个、七个或八个。这些核心串联重复可以是（但不必是）彼此相同的。相比之下，天然的人类MUC1黏蛋白的重复数目一般为21-125。

[0295] 疫苗制剂也涵盖在本文所示的实施方案的范围中，其中糖脂肽的肽部分任选地包含额外的氨基酸子序列。此子序列包含额外的表位，包括MUC1可变串联重复区域的表位（比核心串联重复短）、该区域外的MUC1表位或其他癌抗原的表位。

[0296] 据此，本文提供包含MUC1糖脂肽的疫苗制剂。在一些实施方案中，这样的合成MUC1糖脂肽包含一个或多个拷贝的SEQ ID NO:1的核心串联重复肽，该肽模拟存在于癌细胞上的MUC1肽表位。在一些实施方案中，本文提供包含肽的MUC1糖脂肽，该肽包含至少两个拷贝的核心串联重复：

[0297] TSAPDTRPAPGSTAPPAHGV（SEQ ID NO:1）

[0298] 或与SEQ ID NO:1基本上相同的序列，或其线性排列；

[0299] 其中

[0300] S和T在每次出现时独立地任选地被癌症相关的糖表位Te所取代。

[0301] 由于存在该序列的多个重复，所显示的起始点是任意的，且该串联重复的“线性排列”不同。例如在一个实施方案中，串联重复单元从SEQ ID NO:1的氨基酸19开始，并顺着整个SEQ ID NO:1的肽序列循环，以提供序列GVTSAPDTRPAPGSTAPPAH（SEQ ID NO:11）的核心串联重复。在另一示例性实施方案中，串联重复单元仅从SEQID NO:1的氨基酸6开始，并顺着整个SEQ ID NO:1的肽序列循环，以提供序列TRPAPGSTAPPAHGVTSAPD（SEQ ID NO:12）的核心串联重复。其他类似的“线性排列”也被涵盖在本文所示的实施方案的范围中。

[0302] 在一些实施方案中，本文所述的脂质体制剂包含1至30个拷贝的SEQ ID NO:1的核心串联重复，或与SEQ ID NO:1基本上相同的序列或其线性排列。在一些实施方案中，本文所述的脂质体制剂包含1至20个拷贝的SEQ ID NO:1的核心串联重复、与SEQ ID NO:1基本上相同的序列或其线性排列。在一些实施方案中，本文所述的脂质体制剂包含1至10个拷贝的SEQ ID NO1的核心串联重复、与SEQ ID NO:1基本上相同的序列或其线性排列。在一些实施方案中，本文所述的脂质体制剂包含1至5个拷贝的SEQ ID NO:1的核心串联重复、与SEQ ID NO:1基本上相同的序列或其线性排列。在一些实施方案中，本文所述的脂质体制剂包含2个拷贝的SEQ ID NO:1的核心串联重复、与SEQ ID NO:1基本上相同的序列或其线性排列。在一些实施方案中，本文所述的脂质体制剂包含3个拷贝的SEQ ID NO:1的核心串联重复、与SEQ ID NO:1基本上相同的序列或其线性排列。在一些实施方案中，本文所述的脂质体制剂包含4个拷贝的SEQ ID NO:1的核心串联重复、与SEQ ID NO:1基本上相同的序列或其线性排列。在一些实施方案中，本文所述的脂质体制剂包含5个拷贝的SEQ ID NO:1的核心串联重复、与SEQ ID NO:1基本上相同的序列或其线性排列。在一些实施方案中，本文所述的脂质体制剂包含6个拷贝的SEQ ID NO:1的核心串联重复、与SEQ ID NO:1基本上相同的序列或其线性排列。在一些实施方案中，本文所述的脂质体制剂包含7个拷贝的SEQ ID NO:1的核心串联重复、与SEQ ID NO:1基本上相同的序列或其线性排列。
在一些实施方案中，本文所述的脂质体制剂包含8个拷贝的SEQ ID NO:1的核心串联重复、与SEQ ID NO:1基本上相同的序列或其线性排列。在一些实施方案中，本文所述的脂质体制剂包含9个拷贝的SEQ ID NO:1的核心串联重复、与SEQ ID NO:1基本上相同的序列或其线性排列。在一些实施方案中，本文所述的脂质体制剂包含10个拷贝的SEQ ID NO:1的核心串联重复、与SEQ ID NO:1基本上相同的序列或其线性排列。在上述的任何实施方案中，该一个或多个拷贝的SEQ ID NO:1的核心串联重复如本文所述糖基化。

[0303] 如本文所用的“与SEQ ID NO:1基本上相同的序列”指，在一个实施方案中，序列与SEQ ID NO:1至少80%相同。在其他实施方案中，“与SEQ ID NO:1基本上相同的序列”指序列与SEQ ID NO:1至少85%相同。在其他实施方案中，“与SEQ ID NO:1基本上相同的序列”指序列与SEQ ID NO:1至少90%相同。在其他实施方案中，“与SEQ ID NO:1基本上相同的序列”指序列与SEQ ID NO:1至少95%相同。

[0304] MUC1核心重复变异体

[0305] 在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂中纳入MUC1核心重复的免疫活性同系物或变异体（例如SEQ ID NO:1的变异体）。因此，本文所示的实施方案涵盖MUC1核心重复肽的使用，该肽具有与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列相似但不相同的序列。因此，本文提供的实施方案的范围中也涵盖MUC1核心重复的使用，其与SEQ ID NO.1序列相比具有99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%或
80%的序列同一性，且具有免疫活性。

[0306] 在一些实施方案中，MUC1核心重复蛋白任选地被修饰以含有保守性变异，以便改变非关键的残基或位于非关键区域的残基。可利用本领域中已知的方法辨
别非关键的氨基酸，比如定点诱变（site-directed mutagenesis）、结晶化、核磁共振、光亲和标记（photoaffinity labeling）或丙氨酸扫描诱变（alanine-scanning mutagenesis）(Cunningham等 人,Science,244:1081-1085(1989)；Smith 等 人 ,J.Mol.Biol.,224:899-904(1992)；de Vos等人,Science,255:306-312(1992))。经由比如蛋白酶结合底物、裂解（cleavage）、体外活性或体内活性等方法来检测经修饰的蛋白质的活性或诱导免疫应答的能力。

[0307] 在一些实施方案中，MUC1核心重复变异体中纳入1、2、3、4或5个氨基酸取代，这些取代可改善MUC1核心重复的稳定性，或是带有可改善MUC1核心重复抗氧化的稳定性的不同疏水性氨基酸，或是带有可改善MUC1核心重复抗蛋白酶的稳定性的不同氨基酸。因此，“变异”MUC1核心重复多肽在氨基酸序列上与SEQ ID NO:1所示序列的不同在于一个或多个取代、删除、插入、倒位、截短、修饰或其组合。此变异体任选地含有以另一相似特性的氨基酸取代特定氨基酸的氨基酸取代。保守性取代包括，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等脂肪族氨基酸间的互换；羟基残基丝氨酸和苏氨酸间的互换，酸性残基天冬氨酸和谷氨酸的交换，酰胺残基天冬酰胺和谷氨酰胺间的取代，碱性残基赖氨酸和精氨酸的交换，以及芳香族残基苯丙氨酸和酪氨酸间的置换。参见Bowie等人,Science,247:1306-1310(1990)。

[0308] 如下文所详述，核心串联重复区域任选地以使其变异体仍保留T细胞活化特性的方式被修饰。

[0309] 在一些实施方案中，MUC1变异体是MUC1蛋白质的片段。在一些实施方案中，MUC1变异体包括抗蛋白水解切割的MUC1片段或含有一个或多个非天然氨基酸如D-氨基酸的MUC1片段。此类衍生物具有循环半衰期延长的优点，同时保留有利的T-细胞特异性。

[0310] 在另一实施方案中，MUC1变异体包括MUC1细胞外串联重复区域的一部分，该部分具有氨基酸序列DTR，SEQ ID NO:13，（Asp-Thr-Arg）；DTRP，SEQ ID NO:14，（Asp-Thr-Arg-Pro）；SAPDTRP，SEQ ID NO:15，（Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro） 或TSAPDTRPA，SEQ ID NO:16。其他MUC1衍生物基本上由MUC1黏蛋白的一个截短肽核心重复（例如GVTSAPDTRPAPGSTA，SEQ ID NO:17）所组成。当然，这个截短的核心序列可被重新排列和/或如上文所述以其他方式予以改变。

[0311] MUC1核心重复的修饰

[0312] MUC1核心重复变异体涵盖衍生物或类似物，其中(i)氨基酸被不是由遗传密码所编码的氨基酸残基所取代，(ii)成熟的多肽与另一化合物（比如聚乙二醇）融合，或(iii)将额外氨基酸融合到MUC1多肽，比如前导或分泌性序列或用于纯化多肽的序列。

[0313] 典型的修饰包括（但不限于）乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧基化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒砜化（selenoylation）、硫化、转运RNA介导的蛋白质的氨基酸添加，比如精氨酸化和泛素化（ubiquitination）。

[0314] 可以在MUC1核心重复多肽中的任何位置进行修饰，包括肽的主干、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。某些常用于修饰MUC1核心重复的肽修饰包括糖基化、脂质连接、硫化、谷氨酸残基的γ羧基化、羟基化、利用共价修饰阻断多肽的氨基或羧基或以上两者，以及ADP-核糖基化。

[0315] 此外，以保守方式改变核心序列的一个或多个氨基酸，以便维持必需的活化T细胞的活性。典型的取代在下列氨基酸群组之间进行：(a)G、A、V、L和I；(b)G和P；(c)S、C、T、M；(d)F、Y和W；(e)H、K和R；以及(f)D、E、N和Q。其他的取代包括下列群组：(i)S和T；(ii)P和G；以及(iii)A、V、L和I。

[0316] 本文提供的实施方案的范围中也涵盖核心重复多肽的修饰，其中多肽与另一在正常情况下与之没有关联的多肽接合（例如谷胱甘肽S-转移酶(GST)-融合蛋白、β-半乳糖苷酶融合物、酵母双杂合GAL融合物、聚-His融合物、Ig融合物等等）。因此，MUC1核心重复肽在其N末端或C末端任选地可操作地连接至异源性多肽，该异源性多肽具有与该MUC1核心重复并非基本上同源的氨基酸序列。″可操作地连接″表示MUC1核心重复肽和异源性多肽符合读框（in-frame）。此融合蛋白改变（例如增强、抑制）MUC1核心重复或其功能性变异体诱发宿主系统的免疫反应的能力。

[0317] 糖表位

[0318] 人类癌症呈现数种糖表位。这些包括乳糖系列（lacto series）1型和2型链、与癌症有关的神经节链（ganglio chains）和中性糖鞘脂（glycosphingolipids）。乳糖系列1型和2型链的实例包括（但不限于）：路易斯a（Lewis a）、路易斯a二聚体、路易斯b、路易斯b/路易斯a、路易斯x、路易斯y、路易斯a/路易斯x、路易斯x二聚体、路易斯y/路易斯x、路易斯y三岩藻糖、路易斯b三岩藻糖、路易斯x唾液酸、路易斯y唾液酸、路易斯x唾液酸二聚体、Tn、唾液酸Tn、唾液酸TF、TF等等。癌症相关的神经节链的实例包括（但不限于）GM3、GD3、GM2、GM4、GD2、GM1、GD-1a、GD-1b等等。中性鞘脂包括红细胞三糖（globotriose）、红细胞四糖（globotetraose）、红细胞戊糖（globopentaose）、异红细胞三糖（isoglobotriose）、异红细胞四糖（isoglobotetraose）、粘三糖（mucotriose）、粘四糖（mucotetraose）、乳三糖（lactotriose）、乳四糖（lactotetraose）、新乳四糖（neolactotetraose）、神经节三糖（gangliotriose）、神经节四糖（gangliotetraose）、半乳二糖（galabiose）、9-O-乙酰基-GD3等等。

[0319] 此抗原的另一群组包含与肿瘤有关的糖基化黏蛋白。黏蛋白通常是发现于唾液、胃液等中的糖蛋白，其形成黏性溶液且在身体的外表面和内表面上作为润滑剂或保护剂。癌组织会产生异常黏蛋白，它们比其正常的对应物有相对较少的糖基化和/或过度表达。
由于癌细胞中蛋白质的糖基化机制发生功能性改变，与肿瘤有关的黏蛋白一般含有短的、不完整的聚糖。因此，举例来说，与人奶脂肪球相关的正常黏蛋白主要由四糖聚糖galβ1-4 glcNAcp1-6(galβ1-3)gal NAc-α和其唾液酸化（sialylated）的类似物所组成。但是，与肿瘤有关的Tn半抗原仅由单糖残基α-2-乙酰氨基-3-脱氧-D-吡喃半乳糖基所组成，而T-半抗原仅由双糖β-D-吡喃半乳糖基-(1-3)-α-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃半乳糖基所组成。其他与肿瘤有关的黏蛋白的半抗原（比如唾液酸-Tn（sialyl-Tn）和唾液酸-(2-6)T半抗原）包括末端唾液酸残基连接到短Tn和T聚糖上而形成的半抗原。

[0320] 在大部分原发性癌细胞和它们的转移（所有人类癌的>90%）的外表面细胞膜上可发现呈免疫活性形式的T和Tn抗原。作为癌症标志物，T和Tn使得早期免疫组织化学检测和某些癌症侵袭性的预知成为可能。T和Tn的表达程度通常与癌症（包括某些癌）的分化程度有关联。

[0321] 多种糖类适合被纳入本文所述脂质体疫苗制剂中存在的合成糖脂肽免疫原中。Wong（美国专利第6,013,779号）中描述了各种糖表位，该专利的公开内容引入本文中作为参考。Tn、T、TF、唾液酸Tn和唾液酸(2-->6)T半抗原为与肿瘤有关的糖表位的实例，其在常见的人类癌症中高度表达；使用适合的方法将这类糖表位偶联到胺化的化合物和/或氨基酸上。

[0322] 在一些实施方案中，适用于SEQ ID NO:1核心串联重复的糖基化的糖表位包括（且不限于）：

[0323]

[0324] T半抗原等。

[0325] 在天然的人类20-mer MUC1黏蛋白中，每个重复有五个典型的O-连接的糖基化位点。在正常的MUC1中，这5个位点中平均有2.65个被占据。本文所示的实施方案的范围内涵盖包含MUC1糖蛋白的疫苗制剂，其中每个重复的糖基化氨基酸的平均数目少于、等于或大于″天然″值。在一些这样的实施方案中，SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的一个或多个是O-糖基化的。

[0326] 如本文所用，糖基化氨基酸或肽是其侧链包含至少一个糖单体单元的氨基酸或肽。任选地，糖基化氨基酸或肽中可纳入脂族和/或芳族部分。简单地糖基化的氨基酸或肽是其侧链由选自-O-、-S-和-NH-的连接体和一个或多个糖单元所组成的氨基酸或肽。糖基化氨基酸或肽包含选自半乳糖、甘露糖、葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖、木糖等的单体单元。糖单元的数目从约1至20；或1至10或1至5或1-3或1-2不等。如果寡糖链（即两个或两个以上糖单元的链）连接，则该链为直链或支链。

[0327] 在一个实施方案中，糖基化氨基酸或肽包含-O-糖基化的和-N-糖基化的残基。O-糖基化是例如含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸的O-糖基化。酪氨酸、羟基赖氨酸和羟基脯氨酸也任选地被O-糖基化。在其他实施方案中，糖基化的氨基酸或肽包含N-糖基化的残基。N-糖基化是例如含有酰胺的氨基酸侧链如Asn或蛋白质的氨基末端的N-糖基化。在N-糖基化连接中，氮任选地不被取代（-NH-）或被取代（-NZ-）。在其他实施方案中，糖基化的氨基酸或肽包含S-糖基化的残基。S-糖基化是例如半胱氨酸的硫醇基的S-糖基化。

[0328] 因此，在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含免疫原，其中SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的一个被糖基化。在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含免疫原，其中SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的两个被糖基化。在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含免疫原，其中SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的三个被糖基化。在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含免疫原，其中SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的四个被糖基化。在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含免疫原，其中SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的五个被糖基化。

[0329] 在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含两个或更多拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复序列。在一些这样的实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含具有两个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复序列的免疫原，其中SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的一个被糖基化。在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含具有两个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复序列的免疫原，其中SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的两个被糖基化。在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含具有两个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复序列的免疫原，其中SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的三个被糖基化。在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含具有两个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复序列的免疫原，其中SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的四个被糖基化。在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含具有两个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复序列的免疫原，其中SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的五个被糖基化。在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含具有两个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复序列的免疫原，其中SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的六个被糖基化。在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含具有两个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复序列的免疫原，其中SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的七个被糖基化。在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含具有两个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复序列的免疫原，其中SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的八个被糖基化。在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含具有两个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复序列的免疫原，其中SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的九个被糖基化。在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含具有两个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复序列的免疫原，其中SEQ ID NO:1的丝氨酸或苏氨酸残基中的十个被糖基化。取决于SEQ ID NO:1核心串联重复序列的拷贝数，额外的丝氨酸或苏氨酸残基任选地被糖基化，且被涵盖在本文所示的实施方案的范围内。

[0330] 在具有两个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复序列的免疫原的一些实施方案中，就每个残基而言，特定的SEQ ID NO:1核心串联重复序列中的糖基化模式与另一核心串联重复中的糖基化模式相同。例如在具有两个苏氨酸残基和一个丝氨酸残基上有糖基化的核心串联重复的免疫原中，另一个核心串联重复会在相对应的残基即两个苏氨酸残基和一个丝氨酸残基上有相同的糖基化。

[0331] 在具有两个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复序列的免疫原的一些实施方案中，就每个残基而言，SEQ ID NO:1核心串联重复序列的糖基化模式与其他核心串联重复中的糖基化模式不同。换言之，在一些实施方案中，核心串联重复与其他核心串联重复不同地被糖基化。预期这些不同包括出现不同的糖基化（例如在第一核心串联重复上4个糖基化而在第二核心串联重复上2个糖基化）、不同的用于糖基化的氨基酸残基，和核心串联重复之间不同的糖基。

[0332] 在任何上述的实施方案中，存在于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的核心串联重复序列或任何其他本文所述的肽序列上的每个糖基残基在每次出现时独立地进行选择。因此，本文所述的疫苗制剂中的糖基化肽包含一个或多个糖表位（例如本文所述的糖基残基，比如癌症相关的Te糖表位），所述糖表位为全部相同或不同的或各种糖基残基（例如Te残基）的任何组合。

[0333] 在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含具有两个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复序列的免疫原，其中每个核心串联重复的苏氨酸-6、丝氨酸-12和苏氨酸-13被糖基化。在一些实施方案中，本文所述的疫苗制剂包含具有两个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复序列的免疫原，其在第一核心串联重复上丝氨酸-12和苏氨酸-13未被糖基化，而在第二或额外的核心串联重复上苏氨酸-6被糖基化。

[0334] 脂质

[0335] 在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的核心串联重复共价连接到一个或多个脂化的氨基酸上。如本文所用，″脂质″是棕榈酰基、月桂基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基或癸酰基，或者更常见地，任何连接到具有氧、氮或硫官能团的氨基酸上的C2-C30饱和、单不饱和或多不饱和、支链或直链的脂肪酰基。此类氨基酸包括（但不限于）苏氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸。

[0336] “单脂肽（monolipopeptide）”是仅有一个脂质连接于其上的肽。相似地，“双脂肽（dilipopeptide）”是有两个脂质连接到一个或两个氨基酸上的肽。如果两个脂质连接到两个氨基酸残基上，则这些残基被任何数目的氨基酸分隔开。在多于一个脂质被连接的情况中，脂质为相同的脂质或不同的脂质。相似地，如果多于两个脂质被连接，两个或多个脂质为相同的，或是所有的脂质为不同的。

[0337] 因此，由于肽的脂质部分会自发地整合到脂质体的脂双层中，本文提供的脂化肽被纳入到脂质体中。因此，在一个实施方案中，脂肽呈现在脂质体的“表面”。在替代的实施方案中，肽被包封在脂质体中。

[0338] 糖脂肽包含一个或多个糖基化氨基酸，其中至少一个糖基化氨基酸包含与疾病有关的糖表位，比如与肿瘤有关的糖表位，和一个或多个脂化氨基酸。

[0339] 在一些实施方案中，本文所述的脂质体疫苗制剂中存在的糖脂肽是糖基化双脂肽。在一些这样的实施方案中，连接到SEQ ID NO:1的糖基化核心串联重复的双脂肽包含序列

[0340] H2N-(aa1)*(aa2)*(aa3)-OH

[0341] 其中

[0342] aa1在每次出现时独立地选自S、T、K、R或C；

[0343] aa2在每次出现时独立地选自S、T、K、R或C；

[0344] aa3在每次出现时独立地选自L或G；

[0345] *在每次出现时独立地表示共价连接到氨基酸残基的脂质。

[0346] 如本文所用，以“*”表示的脂质共价连接到在“*”之前的氨基酸上。因此，K*C*L表示双脂化序列，其中K和C残基共价连接到脂质。双脂化序列的实例包括（且不限于）S*S*L、S*S*G、S*K*L、T*S*L、R*S*L、C*T*G等。其他的类似排列也被涵盖在本文所示实施方案的范围中。

[0347] 在一些这样的实施方案中，双脂化序列连接到SEQ ID NO:1核心串联重复的N末端。在一些其他的此类实施方案中，双脂化序列连接到SEQ ID NO:1核心串联重复的C末端。

[0348] 在一些实施方案中，本文所述的脂质体疫苗制剂中存在的糖脂肽，在其C末端区域包含序列SSL，其中两个丝氨酸均被脂化。

[0349] 因此，本文提供包含MUC1糖脂肽的疫苗制剂。在一些实施方案中，此类合成的MUC1糖脂肽包含一个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复肽，该肽模拟存在于癌细胞上的MUC1肽表位。

[0350] 在一些实施方案中，本文提供包含肽的MUC1糖脂肽，该肽包含至少两个拷贝的核心串联重复：

[0351] TSAPDTRPAPGSTAPPAHGV（SEQ ID NO:1）

[0352] 或与SEQ ID NO:1至少85%相同的序列，或其线性排列；

[0353] 其中

[0354] S和T在每次出现时独立地任选地被癌症相关的糖表位Te所取代；和

[0355] 共价连接到(a)的脂肽，其具有通式：

[0356] H2N-(aa1)*(aa2)*(aa3)-OH

[0357] 其中

[0358] aa1在每次出现时独立地选自S、T、K、R或C；

[0359] aa2在每次出现时独立地选自S、T、K、R或C；

[0360] aa3在每次出现时独立地选自L或G；

[0361] *在每次出现时独立地表示共价连接到氨基酸残基的脂质。

[0362] 在一些实施方案中，本文提供MUC1糖脂肽，其包含：

[0363] (a)肽，其包含至少两个拷贝的核心串联重复：

[0364] T(Te)S(Te)APDT(Te)RPAPGS(Te)T(Te)APPAHGV，SEQ ID NO:18或与SEQ ID NO:18至少85%相同的序列，或其线性排列；

[0365] 其中

[0366] Te表示癌症相关的糖表位；

[0367] (b)共价连接到(a)的脂肽，其具有通式:

[0368] H2N-S*S*L-OH

[0369] 其中

[0370] *在每次出现时独立地表示共价连接到丝氨酸残基的脂质。

[0371] 在一些实施方案中，本文提供包含肽的MUC1糖脂肽，该肽包含至少两个拷贝的核心串联重复：

[0372] TSAPDT(Te)RPAPGS(Te)T(Te)APPAHGV（SEQ ID NO:19）或与SEQ ID NO:19至少85%相同的序列，或其线性排列；

[0373] 其中

[0374] Te是癌症相关的糖表位；和

[0375] 共价连接到(a)的脂肽，其具有通式:

[0376] H2N-(aa1)*(aa2)*(aa3)-OH

[0377] 其中

[0378] aa1在每次出现时独立地选自S、T、K、R或C；

[0379] aa2在每次出现时独立地选自S、T、K、R或C；

[0380] aa3在每次出现时独立地选自L或G；

[0381] *在每次出现时独立地表示共价连接到氨基酸残基的脂质；

[0382] 在特定的实施方案中，本文所述的脂质体疫苗制剂是含有43个氨基酸的合成糖脂肽，其具有两个拷贝的SEQ ID NO:1，以及连接到C末端的双脂化的三肽序列，如下所示：

[0383] TSAPDT(Tn)RPAPGS(Tn)T(Tn)APPAHGVTSAPDT(Tn)RPAPGS(Tn)T(Tn)APPAHGVS*S*L-OH（SEQ ID NO:2）

[0384] 其中

[0385] Tn是GalNAcα1。

[0386] 有六个用(Tn)名称所表示的α-糖基化的丝氨酸和苏氨酸部分。Tn是经由α糖苷键连接的(GalNAcα1)N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的缩写。存在两个被指定为S*的C末端肉豆蔻基丝氨酸残基，其用来将该肽锚定在药物产品的脂质体中，并增强免疫识别。所有的氨基酸为天然的L异构体，且O-连接的、GalNAc修饰的丝氨酸和苏氨酸均由α糖苷键连接。在序列中不存在半胱氨酸，因此在该肽中不可能有二硫键三级结构或在肽之间的交联。

[0387] 在一些实施方案中，本文提供的疫苗制剂包含SEQ ID NO:2的盐。此类盐的实例包括（且不限于）乙酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、顺丁烯二酸盐、反丁烯二酸盐、草酸盐、三氟甲磺酸盐、三乙胺盐、二异丙基乙胺盐等。此类盐的进一步实例包括（且不限于）盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等。在其他实施方案中，SEQ ID NO:2的盐是三氟乙酸盐。在特定实施方案中，SEQ ID NO:2的盐是具有下式的乙酸盐：C248H407N59O90·XC2H3O2。

[0388] 佐剂

[0389] 包含SEQ ID NO:1核心串联重复的糖脂肽任选地连同佐剂一起施用，以增强对于抗原的特定应答。在一个实施方案中，以脂质为基础的佐剂（比如脂质A及其衍生物）适用于本文所述的糖脂肽疫苗制剂。例如单磷酰脂质A（MPLA）是一种可引起脂质体抗原对特定T淋巴细胞的呈递增加的佐剂。在另一实施方案中，胞壁酰二肽（MDP）也是适合与本文所述的疫苗制剂共同使用的佐剂。

[0390] 在进一步的实施方案中，适合与本文提供的脂质体疫苗制剂一起使用的佐剂包括刺激性细胞因子，比如白细胞介素-2（IL-2）。在一些实施方案中，IL-2有益地与脂质体一起配制。在一些实施方案中，佐剂是toll样受体（toll-like receptor）的调节物。toll样受体调节物的实例包括TLR-9激动剂，且不限于toll样受体的小分子调节物，比如咪喹莫特（Imiquimod）。与式I或式II的佐剂组合使用的佐剂的其他实例包括（且不限于）皂苷、CpG ODN等。

[0391] 脂质A的合成模拟物也被期望与本文所述的疫苗制剂一起使用。在一些这样的实施方案中，佐剂是式I的化合物：

[0392]

[0393] 其中R1、R2、R3、R5、R6和R7中的至少一个为选自下组的强亲脂性基团：

[0394]

[0395] 其中X、X1、X2和X3独立地为-CO-或-CH2-；

[0396] Z为-NH-或-O；

[0397] k、m和r独立地为0至30的整数（包含0和30），n和q独立地为0至6的整数（包含0和6）；

[0398] 其中Y4为选自-O-、-S-和-NH-的间隔基，其中Y1R1、Y2R2、Y3R3、Y5R5、Y6R6和Y7R7中的至少一个为单价磷酸等效物（MPE），

[0399] 其中每个单价磷酸等效物独立地为(a)-R′-C(O)OH，其中R′是取代或未取代的1-4个碳的烷基，或(b)独立地选自-OB(OH)OR、-OP(O)(OH)OR、-OS(O)(O)(OH)OR
和-OP(=O)(OH)-O-P(=O)(OH)OR，其中R是氢或取代或未取代的1-4个碳的烷基，并且如果R是取代的烷基，则该取代基是-OH或-NH2，

[0400] 其中R8选自H、OH、OR9、与Y8组合形成如先前所定义的单价磷酸等效物的部分，和如上所定义的基团(i)-(viii)；其中R9为1至10个碳长度的烷基或酰基；且

[0401] 其中糖苷键是α或β；

[0402] 或为式II化合物的化合物

[0403]

[0404] 其中R1、R2、R3、R11、R12和R13中的至少一个为选自上述(i)-(viii)的强亲脂性基团；

[0405] 其中Y4为选自-O-、-S-和-NH-的间隔基，且

[0406] 其中Y1R1、Y2R2、Y3R3、Y11R11、Y12R12和Y13R13中的至少一个独立地为如先前所定义的单价磷酸等效物；

[0407] 其中下列限制适用于上述的(I)以及(II)：

[0408] Y1、Y2、Y3、Y5、Y6、Y7、Y11、Y12和Y13为独立地选自-O-、-S-和-NH-的间隔基；

[0409] R1、R2、R3、R5、R6、R7、R11、R12和R13独立地为氢，

[0410] 与共同编号的Y基团形成如先前所定义的单价磷酸等效物的部分，或

[0411] 选自上述(i)-(viii)的强亲脂性基团。

[0412] 所述化合物的强亲脂性基团共同提供至少两个主要碳链，且

[0413] 所述强亲脂性基团的主要碳链共同提供至少30个碳原子；

[0414] 或该化合物为I或II的药学上可接受的盐。

[0415] 在一些实施方案中，适合本文所述的脂质体疫苗制剂的佐剂为式I的化合物或其药学上可接受的盐。

[0416] 在一些实施方案中，适合本文所述的脂质体疫苗制剂的佐剂是式II的化合物或其药学上可接受的盐。

[0417] 在一些实施方案中，Y4是-O-。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(i)，且对于至少一个这样的基团，k是4-30的整数。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(ii)，且对于至少一个这样的基团，2k+3n是4-30的整数。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(iii)，且对于至少一个这样的基团，m+n+l是4-30。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(iv)，并且对于至少一个这样的基团，m+n+1是4-30。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(v)，并且对于至少一个这样的基团，m+n+k+1是4-30。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(vi)，并且对于至少一个这样的基团，k+m+2是4-30。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(vii)，并且对于至少一个这样的基团，k+q+m+n是4-30。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团符合(viii)，并且对于至少一个这样的基团，r+k+q+m+n是5-30。

[0418] 在一些实施方案中，Yl、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y11、Y12和Y13独立地为-O-或-NH-。在一些实施方案中，Yl、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6和Y7独立地由-O-或-NH-所组成。在一些实施方案中，Yl、Y2、Y3、Y4、Y11、Y12、Y13独立地为-O-或-NH-。

[0419] 在一些实施方案中，每个单磷酸等效物是-OP(O)(OH)(OH)。

[0420] 在一些实施方案中，式I的佐剂是一种化合物，其中

[0421] Y4是-O-；

[0422] Y1、Y2和Y7是-O-；

[0423] Y3、Y5和Y6独立地为-O-或-NH-；

[0424] R1、R3、R5和R6独立地为氢或选自(i)-(viii)的强亲脂性基团；

[0425] R1、R3、R5和R6中的至少一个不是氢；

[0426] R2和R7独立地选自H、-P(O)(OH)2、-SO3H、-P(O)(OH)(OCH2CH2NH2)和-CH2COOH；且[0427] R8选自H、OH、OSO3H和OR9，其中R9是1至10个碳长度的烷基或酰基。

[0428] 在一些式I的实施方案中，

[0429] Y4是-O-；

[0430] Y2和Y12是-O-；

[0431] Y1、Y3、Y11和Y13独立地选自-O-、-NH-和-S-；

[0432] R1、R3、R11和R13独立地为氢或选自(i)-(viii)的强亲脂性基团；

[0433] R1、R3、R5和R6中的至少一个不是氢；且

[0434] R2和R12独立地选自H、-P(O)(OH)2、-P(O)(OH)(OCH2CH2NH2)和-CH2COOH。

[0435] 在一些实施方案中，R1、R3、R5和R6独立地为氢或选自(i)-(viii)的强亲脂性基团，R1、R3、R5和R6中的至少一个不是氢，且R2和R7独立地选自H、-P(O)(OH)2、-SO3H、-P(O)(OH)(OCH2CH2NH2)和-CH2COOH；且R8选自H、OH、OSO3H和OR9，其中R9是1至10个碳长度的烷基或酰基。

[0436] 在一些实施方案中，R1、R3、R11和R13独立地为氢或选自(i)-(viii)的强亲脂性基团；R1、R3、R5和R6中的至少一个不是氢；且R2和R12独立地选自H、-P(O)(OH)2、-P(O)(OH)(OCH2CH2NH2)和-CH2COOH。

[0437] 在一些实施方案中，每个单磷酸等效物是-OP(O)(OH)(OH)。

[0438] 在一些实施方案中，上述化合物的强亲脂性基团共同提供至少三个主要碳链，且其中所述强亲脂性基团的主要碳链共同提供至少40个碳原子，所述化合物具有免疫刺激活性。在一些实施方案中，上述化合物的强亲脂性基团共同提供至少四个主要碳链，且其中该主要碳链共同提供至少50个碳原子,所述化合物具有免疫刺激活性。

[0439] 在一些实施方案中，该强亲脂性基团共同提供六个主要碳链。在一些实施方案中，每个主要碳链的特征在于所述链中有10、12、14、16、18或20个碳原子。

[0440] 在一些实施方案中，Y3和Y5是-NH-，且Y6是-O-。在一些实施方案中，R3、R5和R6是根据(v)的强亲脂性基团，且k、X1、m、n和X2为独立选择值。在一些实施方案中、R3、R5和R6的k和m独立地为8-18。在一些实施方案中，X1是-CO-、X2是-CO-且n=1。在一些实施方案中，k和m独立地为8、10、12、14、16或18。在一些实施方案中，k和m为12。在一些实施方案中，R8是OH。在一些实施方案中，Y7是-O-且R7是-P(=O)(OH)(OH)。在一些实施方案中，Y2是-O-且R2是H。在一些实施方案中，Y2是-O-且R2是-P(=O)(OH)(OH)。
在一些实施方案中，R1-R3是氢。在一些实施方案中，Y1-Y3是-O-且R1-R3是氢。在一些实施方案中，R1-R3是氢，且Y1-Y3中的两个是-O-且另一个是-NH-。在一些实施方案中，R1-R3中的两个是氢。在一些实施方案中，-Y1R1、-Y2R2和-Y3R3中的两个是-OH。在一些实施方案中，-Y1R1、-Y2R2和Y3R3中的一个是-OH且-Y1R1、-Y2R2和Y3R3中的一个是-NH2。

[0441] 在一些实施方案中，R1-R4中的一个是氢。在一些实施方案中、R1-R3中没有一个是氢。在一些实施方案中，R1-R3中的一个是强亲脂性基团。在一些实施方案中，R1-R3中的至少两个包含强亲脂性基团。在一些实施方案中，R1-R3中的两个是强亲脂性基团。在一些实施方案中，R1-R4中的三个是强亲脂性基团。

[0442] 在一些实施方案中，间隔基Yl-Y4和Y11-Y13中的每一个是-O-。在一些实施方案中，间隔基Yl-Y4中的三个是-O-且剩余的间隔基是-NH-。

[0443] 在一些实施方案中，式I或式II化合物提供一个磷酸等效物。在一些实施方案中，式I或式II化合物提供两个磷酸等效物。

[0444] 在一些实施方案中，(b)适用且R为羟基。在一些实施方案中，(b)适用，且所述磷酸等效物包含-OP(=O)(OH)O-。在一些实施方案中，(b)适用且R是取代或未取代的1-4个碳的烷基。

[0445] 在一些实施方案中，R是CH2CH2NH2。在一些实施方案中，(a)适用。在一些实施方案中，R’是-CH2-。在一些实施方案中，糖是氨基糖。在一些实施方案中，糖是葡糖胺。

[0446] 在一些实施方案中，至少一个磷酸等效物是Y5R5、Y6R6、Y7R7或Y8R8。在一些实施方案中，至少一个磷酸等效物连接到所述糖单元。在一些实施方案中，至少一个磷酸等效物是Y1R1、Y2R2或Y3R3。在一些实施方案中，R5-R8中的至少一个包含强亲脂性基团。在一些实施方案中，R5-R7中的两个或多个包含强亲脂性基团。

[0447] 在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团只包含一个主要碳链。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团只包含两个主要碳链。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团只包含三个主要碳链。在一些实施方案中，强亲脂性基团共同提供三个主要碳链。在一些实施方案中，强亲脂性基团共同提供四个主要碳链。在一些实施方案中，强亲脂性基团共同提供五个主要碳链。在一些实施方案中，强亲脂性基团共同提供六个主要碳链。在一些实施方案中，强亲脂性基团共同提供七个主要碳链。在一些实施方案中，强亲脂性基团共同提供八个主要碳链。

[0448] 在一些实施方案中，每个主要碳链为10-20个碳。在一些实施方案中，每个主要碳链为12-16个碳。在一些实施方案中，强亲脂性基团的主要碳链共同提供至少40个碳原子。在一些实施方案中，强亲脂性基团的主要碳链共同提供至少50个碳原子。在一些实施方案中，强亲脂性基团的主要碳链共同提供至少60个碳原子。在一些实施方案中，强亲脂性基团的主要碳链共同提供至少70个碳原子。在一些实施方案中，强亲脂性基团的主要碳链共同提供至少80个碳原子。在一些实施方案中，强亲脂性基团的主要碳链共同提供至少90个碳原子。在一些实施方案中，强亲脂性基团的主要碳链共同提供不超过90个碳原子。
在一些实施方案中，强亲脂性基团的主要碳链共同提供不超过80个碳原子。在一些实施方案中，强亲脂性基团的主要碳链共同提供不超过70个碳原子。在一些实施方案中，强亲脂性基团的主要碳链共同提供不超过60个碳原子。

[0449] 在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团选自：

[0450]

[0451] 其中X是–CO-或-CH2-，k是4-30的整数；

[0452]

[0453] 其中n是0-6的整数，k是0-30的整数，且2k+3n是4-30的整数；

[0454]

[0455] 其中m和n是整数（n为0-6，而m为0-30），且m+n+1是4-30；

[0456]

[0457] 其中m+n+1是4-30；

[0458]

[0459] 其中X1和X2独立地为-CO-或-CH2-，且m+n+k+1是4-30；

[0460]

[0461] 其中Z是-NH-或-O-，且k+m+2是4-30；

[0462]

[0463] 其中q是0-6的整数，且k+q+m+n是4-30；及

[0464]

[0465] 其中X1、X2和X3独立地为-CO-或-CH2-CO2-，r是0-6的整数，且r+k+q+m+n是5-30。

[0466] 在一些实施方案中，所有的强亲脂性基团选自结构(i)-(viii)。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团是结构(i)。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团是结构(ii)。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团是结构(iii)。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团是结构(iv)。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团是结构(v)。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团是结构(vi)。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团是结构(vii)。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团是结构(viii)。

[0467] 在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团为以下所列结构中的一种：

[0468]

[0469] 在一些实施方案中，该至少一个强亲脂性基团包含R对映异构体。在一些实施方案中，该至少一个强亲脂性基团包含S对映异构体。在一些实施方案中，该至少一个强亲脂性基团是外消旋物。在一些实施方案中，该至少一个强亲脂性基团包含RR、RS和SR或SS非对映异构体。所有外消旋物、对映异构体或非对映异构体均被涵盖在本文所示的实施方案的范围中。在一些实施方案中，至少一个强亲脂性基团为以下所列结构中的一种：

[0470]

[0471] 在一些实施方案中，该至少一个强亲脂性基团为以下所列结构中的一种：

[0472]

[0473] 在一些实施方案中，每个强亲脂性基团独立地为以上所列结构中的一种。

[0474] 在一些实施方案中，佐剂为如下定义的化合物：

[0475]

[0476] 其中R1、R3、R5和R6独立地为氢或选自下组的亲脂性基团：

[0477]

[0478] 其中X、X1、X2和X3独立地为-CO-或-CH2-；

[0479] Z是-NH-或-O-；

[0480] k、m和r独立地为0至30的整数（包含0和30），

[0481] n和q独立地为0至6的整数（包含0和6）；

[0482] R1、R3、R5和R6中的至少一个不是氢；

[0483] R2和R7独立地选自H、-P(O)(OH)2、-SO3H、-P(O)(OH)(OCH2CH2NH2)和-CH2COOH；且[0484] R9是H或1至10个碳长度的烷基或酰基。

[0485] 在一些实施方案中，R1和R9是氢；R2是氢或膦酰基-P(O)(OH)2；R7是膦酰基-P(O)(OH)2；且R3、R5和R6是相同或不同的下列结构的酰基

[0486]

[0487] 其中m和n独立地选自6至10之间的整数（包含6和10）。

[0488] 在一些实施方案中，R3、R5是R6是相同的。

[0489] 在一些实施方案中，佐剂是

[0490]

[0491] 在一些实施方案中，佐剂具有下列结构

[0492] （PET脂质A）

[0493] 在一些实施方案中，佐剂是：

[0494]

[0495] 在一些实施方案中，佐剂具有下列结构

[0496]

[0497] 在一些实施方案中，佐剂是由下列结构所定义的化合物或其药学上可接受的盐：

[0498]

[0499] 其中Y3、Y5和Y6独立地为-O-或-NH-；

[0500] Y10选自-O-、-NH-和-S-；

[0501] R1、R3、R5和R6独立地为氢或选自下组的亲脂性基团

[0502]

[0503] 其中X、X1、X2和X3独立地为CO或CH2；

[0504] Z为NH或O；

[0505] k、m和r独立地为0至30的整数（包含0和30），

[0506] n和q独立地为0至6的整数（包含0和6）；

[0507] 且R1、R3、R5和R6中的至少一个不是氢原子；

[0508] R2选自H、-P(O)(OH)2、-SO3H、-P(O)(OH)(OCH2CH2NH2)和-CH2COOH；且

[0509] R10选自H、-P(O)(OH)2、-SO3H、-P(O)(OH)(OCH2CH2NH2)-CH2COOH和1至10个碳长度的烷基。

[0510] 在一些实施方案中，佐剂具有下列结构

[0511]

[0512] 其中R2和R10独立地为氢或膦酰基(-P(O)(OH)2)，且它们中的至少一个是膦酰基；

[0513] Y3是-O-或-NH-，

[0514] R3、R5和R6独立地为氢或选自下组的亲脂性基团

[0515]

[0516] 其中X、X1、X2和X3独立地为CO或CH2；

[0517] Z是NH或O；

[0518] k、m和r独立地为0至30的整数（包含0和30）,

[0519] n和q独立地为0至6的整数（包含0和6）；

[0520] 且R3、R5和R6中的至少一个不是氢。

[0521] 在一些实施方案中，佐剂具有下列结构

[0522]

[0523] 其中R3、R5和R6为相同或不同的下列结构的取代基

[0524]

[0525] 其中m和n独立地选自6至10之间的整数（包含6和10）。

[0526] 在一些实施方案中，佐剂具有下列结构

[0527]

[0528] 其中Y3和Y13独立地为-O-或-NH-；R3和R13为相同的取代基且为选自下组的强亲脂性基团：

[0529]

[0530] 其中X、X1、X2和X独立地为CO或CH2；Z是NH和O；k、m和r独立地为0至30的整数（包含0和30），n和q独立地为0至6的整数（包含0和6）。

[0531] 在一些实施方案中，佐剂具有下列结构

[0532]

[0533] 在一些实施方案中，佐剂具有下列结构

[0534]

[0535] 在一些实施方案中，所述化合物的强亲脂性基团共同提供至少三个主要碳链，且其中所述强亲脂性基团的主要碳链共同提供至少40个碳原子。在一些实施方案中，所述化合物的强亲脂性基团共同提供至少四个主要碳链，且其中该主要碳链共同提供至少50个碳原子。在一些实施方案中，所述化合物的强亲脂性基团共同提供至少四个主要碳链，且其中该主要碳链共同提供至少50个碳原子。

[0536] 在一些实施方案中，式I或式II化合物包含季戊四醇（PET）单元或PET单元的衍生物。在一些这样的实施方案中，PET单元具有以下结构：

[0537]

[0538] 在一些实施方案中，通过糖单元的开环修饰脂质A，以提供PET基团；任选地修饰该PET基团（例如以产生醚衍生物、酰胺衍生物、酯衍生物等）。

[0539] 在一些式II的实施方案中，至少两个主要碳链在没有任何中间PET单元的情况下连接到第一PET单元，且至少两个主要碳链在没有任何中间PET单元的情况下连接到第二PET单元。在一些实施方案中，至少两个主要碳链在没有任何中间PET单元的情况下连接到糖单元，且至少两个主要碳链在没有任何中间糖单元的情况下连接到该PET单元。在一些实施方案中，强亲脂性基团共同提供六个主要碳链。在一些实施方案中，强亲脂性基团共同提供六个主要碳链。

[0540] 在一些实施方案中，每个主要碳链的特征在于所述链中有10、12、14、16、18或20个碳原子。在一些实施方案中，每个主要碳链的特征在于所述链中有10、12、14、16、18或20个碳原子。在一些实施方案中，每个主要碳链为10、12、14、16、18或20个碳。在一些实施方案中，每个主要碳链为10、12、14、16、18或20个碳。在一些实施方案中，每个主要碳链为10、12、14、16、18或20个碳。

[0541] 在一些实施方案中，任何上述的佐剂具有脂质A拮抗剂活性。

[0542] 在一些实施方案中，上述的佐剂在本文提供的脂质体疫苗制剂中以盐的形式存在。此类盐的实例包括（且不限于）三乙胺盐或二异丙基乙胺盐、其他铵盐、三乙醇胺盐、乙酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、顺丁烯二酸盐、反丁烯二酸盐、草酸盐、三氟甲磺酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等。其他的此类盐包括（且不限于）NaOH、KOH、MgOH、CaOH、ZnOH、乙二胺、乙醇胺(2-氨基乙醇)、1H-咪唑、二乙胺、哌嗪、二甲基乙醇胺（deanol）、胆碱盐等。

[0543] 在特定实施方案中，本文所述的脂质体疫苗制剂包含PET脂质A，即磷酸糖脂佐剂季戊四醇-6-链-C14-葡糖胺-单-磷酸盐。在特定实施方案中，本文所述的
脂质体疫苗制剂包含PET脂质A的三乙胺盐。PET脂质A的TEA盐的IUPAC名称是
(2R,3S,4R,5R,6R)-6-(3-羟基-2-(羟基甲基)-2-(((R)-3-(十四酰氧基)十四酰氨基)
甲基)丙氧基)-2-(羟基甲基)-5-((R)-3-(十四酰氧基)十四酰氨基)-4-((R)-3-(十四
酰氧基)十四酰氧基)四氢-2H-吡喃-3-基磷酸氢三乙铵盐。PET脂质A的某些物理特性
如下所示：

[0544]参数 特性
分子量(游离酸) 1686.43g/mol
分子量(TEA盐) 1787.62g/mol
分子式(游离酸) C95H181N2O19P
分子式(TEA盐) C95H180N2O19P·C6H16N

[0545] 脂质体

[0546] 本文所述的疫苗制剂是脂质体疫苗制剂。适合纳入该制剂中的示例性脂质体包括（且不限于）多层囊泡（MLV）、寡层囊泡（OLV）、单层囊泡（UV）、小单层囊泡（SUV）、中单层囊泡（MUV）、大单层囊泡（LUV）、巨大单层囊泡（GUV）、多囊性囊泡（MVV）、由逆相蒸发法制得的单或寡层囊泡（REV）、由逆相蒸发法制得的多层囊泡（MLV-REV）、稳定的多层囊泡（SPLV）、冷冻及解冻的MLV（FATMLV）、由挤出法制成的囊泡（VET）、由弗氏压碎（French press）制成的囊泡（FPV）、由融合法制成的囊泡（FUV）、脱水-再水合囊泡（DRV）和泡沫体（BSV）。用于制备脂质体的技术描述于例如COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS,vol.66(J.Kreuter ed.,Marcel Dekker,Inc.(1994))之中。

[0547] 取决于制备方法，脂质体为单层或多层，且大小不同，直径范围为约0.02μm到大于约10μm。

[0548] 脂质体吸附到很多类型的细胞上，且随后释放所纳入的药剂（例如包含一个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复的糖脂肽）。在一些情况下，脂质体与目标细胞融合，由此使该脂质体的内容物流入该目标细胞中。或者，脂质体被吞噬性细胞内吞。内吞之后是脂质体脂质的溶酶体内降解作用，并释放出所包封的药剂。Scherphof等人,Ann.N.Y Acad.Sci.,446:368(1985)。

[0549] 本文提供的脂质体也包含载体脂质。在一些实施方案中，载体脂质为磷脂。能够形成脂质体的载体脂质包括（但不限于）双棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、磷脂酰胆碱（PC；卵磷脂）、磷脂酸（PA）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）。其他适合的磷脂进一步包括双硬脂酰基磷脂酰胆碱（DSPC）、双肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、双棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）、双硬脂酰基磷脂酰甘油（DSPG）、双肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）、双棕榈酰磷脂酸（DPPA）、双肉豆蔻酰磷脂酸（DMPA）、双硬脂酰基磷脂酸（DSPA）、双棕榈酰磷脂酰丝氨酸（DPPS）、双肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（DMPS）、双硬脂酰基磷脂酰丝氨酸（DSPS）、双棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、双肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、双硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE）等或其组合。在一些实施方案中，该脂质体进一步包含可调节脂质体形成的固醇（例如胆固醇）。在一些实施方案中，该载体脂质为任何已知的非磷酸极性脂质。

[0550] 在一些实施方案中，本文所述的脂质体包含连接到双脂化氨基酸序列上的一个或多个拷贝的SEQ ID NO:1糖基化核心串联重复。在一些其他的实施方案中，本文所述的脂质体包含连接到双脂化氨基酸序列上的一个或多个拷贝的SEQ ID NO:1糖基化核心串联重复以及佐剂。在更进一步的实施方案中，本文所述的脂质体包含连接到双脂化氨基酸序列上的一个或多个拷贝的SEQ ID NO:1糖基化核心串联重复、佐剂以及载体脂质。在任何前述的实施方案中，本文所述的脂质体包含佐剂的混合物（例如式I佐剂和CpG ODN、合成TLR-9激动剂、皂苷等）。

[0551] 在特定实施方案中，使用同时混合步骤来生产本文所述的疫苗制剂，该步骤中有有机相和水相的受控混合。在一些实施方案中，有机相包含有机溶剂。在一些实施方案中，有机相包含有机溶剂和至多约20%v/v的水。在一些实施方案中，有机相包含有机溶剂和至多约15%v/v的水。在一些实施方案中，有机相包含有机溶剂和至多约10%v/v的水。在一些实施方案中，有机相包含有机溶剂和至多约5%v/v的水。在一些实施方案中，有机相包含有机溶剂和少于约5%v/v的水。在一些这样的实施方案中，水在该有机相中的存在允许改善溶质（例如糖脂肽）的溶解作用。在一些这样的实施方案中，有机相包含可与水混溶的有机溶剂。

[0552] 在一些实施方案中，水相任选地包含至多约20%v/v的有机溶剂。在一些实施方案中，水相任选地包含至多约15%v/v的有机溶剂。在一些实施方案中，水相任选地包含至多约10%v/v的有机溶剂。在一些实施方案中，水相任选地包含至多约5%v/v的有机溶剂。

[0553] 举例来说，载体脂质和糖脂肽（例如SEQ ID NO:2的糖脂肽）和佐剂（例如PET脂质A、PET脂质A三乙胺盐）完全溶解于有机相中，该有机相任选地含有至多5%v/v的水（例如含有至多5%v/v水的t-BuOH）。通过使用受控的流速比来同时混合两相，从而控制脂质体的大小。水相与有机相的流速比保持恒定在约3:1，以产生总体分布为约90%（d90）≤0.22μm的脂质体，从而允许通过无菌过滤器过滤。在一些实施方案中，脂质体具有约90%（d90）≤0.4μm的总体分布。在一些实施方案中，脂质体具有约90%（d90）≤0.30μm的总体分布。在一些实施方案中，脂质体具有约90%（d90）≤0.25μm的总体分布。在一些实施方案中，脂质体具有约90%（d90）≤0.20μm的总体分布。

[0554] 在脂质体制备中任选地改变的某些参数包括水相/有机相混合比、温度以及冷却速率，以得到适合纳入本文所述的疫苗制剂中的脂质体。图1说明用于制造本文所述的脂质体疫苗制剂的示例性程序。脂质溶液和水之间的流速比

[0555] 假若水相和有机相流动的开始和停止为同步的，则水与有机溶液的流速比可决定溶剂浓度以及脂质体大小。溶剂浓度愈高，形成的脂质体愈大。因此，在一些实施方案中，水流速与有机溶液流速的比例为至少2:1（产生不高于约331/3%的有机溶剂浓度）、至少3:1（产生不高于约25%的有机溶剂浓度）。在一些实施方案中，水流速与有机溶液流速的比例为至少5.67:1（产生不高于约15%的有机溶剂浓度）。水流速与有机溶液流速的比例一般不高于19:1。在一些实施方案中，水流速与有机溶液流速的比例为约19:1（达到约5%的有机溶剂浓度）至31/3:1（达到有机溶剂浓度约30%）、约9:1（达到约10%的有机溶剂浓度）至5:1（达到约20%的有机溶剂浓度）或约9:1至4:1（达到约25%的有机溶剂浓度）。举例来说，通过使85mL/min的水流到15mL/min的有机相获得于水中15%v/v浓度的叔丁醇，以提供基本上均匀d90的脂质体粒子大小。在任何上述的实施方案中，有机相是本文所述的任何有机相。

[0556] 因此，只要比例保持恒定，对于指定的所需脂质体大小，可根据实际情况调整流速。因此，例如，如果想要产生其中超过约99%的脂质体的大小小于约200nm且有机溶液浓度为约20%的脂质体制剂，则根据实际考虑，比如实际的混合时间和欲使用的溶液体积，调整流速，同时保持水流速与脂质溶液流速的比例为约4：l。

[0557] 液体的温度

[0558] 液体任选地在它们各自的储存器中同时加热，该储存器可用夹套隔热，以减少热损失。将任一液体的温度保持在约40℃-45℃、约45℃-50℃、约50℃-55℃或约55℃-60℃。在一些实施方案中，将任一液体的温度保持在约42℃±2℃、44℃±2℃、
47℃±2℃、50℃±2℃、53℃±2℃、55℃±2℃、57℃±2℃或60℃±2℃。在一些实施方
案中，将任一液体的温度保持在约53℃±2℃。

[0559] 冷却

[0560] 在一些实施方案中，快速冷却（可通过在脂质体形成之后立即使用热交换器来达成）可控制脂质体大小，并且消除批量大小的独立性及脂质体大小的变异性的障碍。为了维持脂质体大小，冷却温度和时间应在5小时内不超过约20℃，例如在不到5小时内从约55℃冷却到约35℃，或是在不到2小时内从约55℃冷却到约30℃，或是在不到30分钟内从约55℃冷却到约30℃。若需要，任选地将混合物冷却到更低的温度；然而使主体溶液保持在冷冻温度之上。

[0561] 一种使用上述程序制造脂质体的装置在美国申请序号第13/140,786号（以美国专利申请第2012/0034294号公开）中描述，该申请的公开内容引入本文中作为参考。

[0562] 在一个实施方案中，将从上述控制混合步骤获得的亲液胶体（即包含脂质体的悬浮液）无菌过滤、转移到小瓶中，并经过冷冻干燥以提供冻干的包含脂质体的块状物或粉剂。在施用至有需要的个体之前将此块状物或粉剂在盐水中（例如0.9%w/v无菌盐水）中重建。在另一实施方案中，将从上述控制混合步骤获得的亲液胶体（即包含脂质体的悬浮液）无菌过滤并直接施用至有需要的个体。在其他的实施方案中，将从上述控制混合步骤获得的亲液胶体（即包含脂质体的悬浮液）无菌过滤、置于小瓶中，并蒸发和/或浓缩（例如在减压之下），以提供干燥的薄膜或粉剂，随后在施用至有需要的个体之前将该薄膜或粉剂重建。

[0563] 在一些实施方案中，用于重建上述脂质体薄膜或粉剂或冻干块状物或固体的液体是盐水（例如0.9%w/v盐水）。在一些实施方案中，用于重建上述脂质体薄膜或粉剂或冻干块状物或固体的液体是任何其他肠胃外可接受的稀释剂（例如D5W、乳酸林格氏液（lactated Ringers solution）、右旋糖溶液等）。在一些实施方案中，用于重建上述脂质体薄膜或粉剂或冻干块状物或固体的液体是油。在一些这样的实施方案中，本文所示的实施方案的范围中涵盖使用药学上可接受的油作为稀释剂以制备持续释放性疫苗制剂。在一些这样的实施方案中，作为油中的悬浮液的疫苗制剂允许在施用后形成持续释放库（sustained release depot）（例如油中悬浮液的皮下或肌内袋），从而允许长期释放。用于配制本文所述包含脂质体的油中悬浮液的此类稀释剂的实例包括（且不限于）大豆油、油酸及其甘油酯衍生物、橄榄油、蓖麻油等。在一些这样的实施方案中，本文提供的脂质体疫苗制剂为乳液。在一些这样的实施方案中，本文提供的脂质体疫苗制剂是油中的悬浮液。

[0564] 在一些实施方案中，本文所述的脂质体疫苗制剂包含的糖双脂化肽（例如SEQ ID NO:2）与佐剂（例如PET脂质A，TEA盐）的重量/重量比为约10:1至约1:10。在一些实施方案中，本文所述的脂质体疫苗制剂包含的糖双脂化肽（例如SEQ ID NO:2）与佐剂（例如PET脂质A，TEA盐）的重量/重量比为约8:1至约1:8。在一些实施方案中，本文所述的脂质体疫苗制剂包含的糖双脂化肽（例如SEQ ID NO:2）与佐剂（例如PET脂质A，TEA盐）的重量/重量比为约5:1至约1:5。在一些实施方案中，本文所述的脂质体疫苗制剂包含的糖双脂化肽（例如SEQ ID NO:2）与佐剂（例如PET脂质A，TEA盐）的重量/重量比为约2:1至约1:2。在一些实施方案中，本文所述的脂质体疫苗制剂包含的糖双脂化肽（例如SEQ ID NO:2）与佐剂（例如PET脂质A，TEA盐）的重量/重量比为1:1。在一些特定的实施方案中，本文所述的脂质体疫苗制剂包含约300μg糖双脂化肽（例如SEQ ID NO:2）和约150μg的佐剂(例如PET脂质A、TEA盐)。在一些实施方案中，本文所述的脂质体疫苗制剂包含约600μg糖双脂化肽（例如SEQ ID NO:2）和约300μg的佐剂(例如PET脂质A，TEA盐)。在一些实
施方案中，本文所述的脂质体疫苗制剂包含约900μg糖双脂化肽（例如SEQ ID NO:2）和约
450μg的佐剂(例如PET脂质A，TEA盐)。在一些实施方案中，本文所述的脂质体疫苗制剂包含约1200μg糖双脂化肽（例如SEQ ID NO:2）和约600μg的佐剂(例如PET脂质A，TEA盐)。在一些这样的实施方案中，脂质体制剂是冻干的固体粉剂或块状物，其在盐水（例如0.9%w/v无菌盐水)中重建以提供该疫苗制剂。

[0565] 本文涵盖以上对于各种变化所述的一个或多个拷贝的糖基化核心串联重复（SEQ ID NO:1）、双脂化氨基酸序列和一种或多种佐剂的任何组合。在整份说明书中，提供了糖脂肽和其组合物及使用方法，并进行选择以对有需要的个体提供合适的治疗。

[0566] 治疗方法

[0567] 在一些实施方案中，本文提供用于刺激有需要的个体的免疫系统的方法，其包括施用本文所述的脂质体疫苗制剂，例如糖脂肽制剂，其包含一个或多个拷贝的SEQ ID NO:1和佐剂（例如PET脂质A）。在一些情况下，施用本文所述的脂质体疫苗制剂诱发和/或维持细胞应答。在其他情况下，施用本文所述的脂质体疫苗制剂诱发和/或维持体液应答。在进一步的情况下，施用本文所述的脂质体疫苗制剂诱发和/或维持体液以及细胞应答。

[0568] 本文还提供了用于治疗有需要的个体的癌症的方法，其包括施用本文所述的脂质体疫苗制剂。在一些这样的实施方案中，该个体正罹患癌症。在其他实施方案中，该个体疑似罹患癌症。在其他实施方案中，该个体容易罹患癌症（例如容易罹患乳腺癌的个体）。在某些实施方案中，癌症选自乳腺癌、肺癌、肺腺癌、鳞状细胞肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、脑癌、腹部癌症、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、咽旁间隙癌、胃肠癌、神经胶质瘤、肝癌、口腔癌、舌癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、泌尿道癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、子宫颈癌、子宫癌、维尔姆斯肿瘤（Wilm′s tumor）、多发性骨髓瘤、皮肤癌、淋巴瘤、白血病、血癌、甲状腺癌、骨癌、腺样囊性肿瘤、软骨肉瘤、胰岛细胞肿瘤、神经内分泌肿瘤、前列腺癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、子宫内膜肿瘤、子宫内膜癌、平滑肌肉瘤、胆囊癌、肝细胞癌、血液癌、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、急性/慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、弥漫型大B细胞淋巴瘤。在某些实施方案中，该癌症是头颈癌、肺癌、结肠癌或前列腺癌。在某些实施方案中，该癌症是非小细胞肺癌。在一些实施方案中，该癌症是血液癌。

[0569] 在一些实施方案中，该癌症与MUC1抗原的表达有关，包括（但不限于）乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，该癌症与实体瘤有关。在某些情况下，实体瘤是晚期的，例如第3期或第4期。在一些情况下，肿瘤为乳腺肿瘤、非小细胞肺肿瘤、卵巢肿瘤、结肠直肠肿瘤、胃肿瘤、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤和肾细胞癌肿瘤。在某些情况下，实体瘤在组织学上与MUC1抗原的表达相关。

[0570] 如本文所用，在一些实施方案中，“治疗”或“正治疗”或“经治疗”指治疗性处理，其中目的是为了减缓（减轻）不希望的生理性病况、病症或疾病，或是为了得到有益或所需的临床结果。就本文所述的目的而言，有益或所需的临床结果包括（但不限于）缓和症状；降低病况、病症或疾病的程度；稳定(即不恶化)病况、病症或疾病的状态；延迟发作或减缓病况、病症或疾病的进展；改善病况、病症或疾病的状态；及无论是可检测到或无法检测到的缓解(无论是部分或完全)，或是改善或改进病况、病症或疾病。治疗包括在没有造成过多副作用之下引发临床上显著的应答。治疗也包括与未接受治疗的情况下预期的存活期相比延长存活期。在其他实施方案中，“治疗”或“正治疗”或“经治疗”指防治性措施，其中目的是要延迟非所需的生理病况、病症或疾病的发作或降低严重性，例如容易罹患疾病的人（例如携带疾病（比如乳腺癌）遗传标记的个体）。

[0571] 本文所述的治疗方法可治疗各种分期的癌症，包括局部晚期、转移期和/或复发期。在癌症的分期中，局部晚期一般定义为从局部区域扩散到附近组织和/或淋巴结的癌症。在罗马数字分期系统中，局部晚期通常被分类在第II期或第III期。转移性癌症为癌症扩散到整个身体的远端组织和器官的分期（第IV期)。被称作复发性的癌症一般被定义为已经复发的癌症，通常在一段时间之后、在缓解之后或在肿瘤经可见地移除之后。复发可为局部的（即出现在与原来相同的位置）或是远端的（即出现在身体的不同部位）。在某些情形下，可通过本文所述的联合疗法治疗的癌症是无法切除的或是不能够通过手术移除的。

[0572] 在一些这样的实施方案中，本文所述的治疗方法（例如免疫疗法）为对个体所开出的任何其他癌症疗法提供辅助疗法。因此，在一些实施方案中，本文所述的脂质体疫苗制剂与采用任何其他抗癌剂的治疗联合施用，包括（且不限于）氨甲蝶呤（RHEUMATREX 氨甲喋呤）、环磷酰胺 (CYTOXAN )、沙利度胺(THALIDOMID )、吖啶甲酰胺、actimid放线菌素、17-N-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素（17-N-allylamino-17-deme
thoxygeldanamycin）、氨基喋呤、安吖啶（amsacrine）、蒽环霉素（anthracycline）、抗肿瘤药、抗瘤酮（antineoplaston）、5-氮杂胞苷（5-azacytidine）、硫唑嘌呤、BL22、苯达莫司汀（bendamustine）、比立考达（biricodar）、博来霉素（bleomycin）、硼替佐米（bortezomib）、苔藓虫素（bryostatin）、白消安（busulfan）、花萼海绵诱癌素（calyculin）、喜树碱（camptothecin）、卡培他滨（capecitabine）、卡铂（carboplatin）、西妥昔单抗（cetuximab）、苯丁酸氮芥（chlorambucil）、顺铂、克拉屈滨（cladribine）、氯法拉滨（clofarabine）、阿糖胞苷（cytarabine）、达卡巴嗪（dacarbazine）、达沙替尼（dasatinib）、道诺霉素（daunorubicin）、地西他滨（decitabine）、二氯乙酸、圆皮海绵内酯（discodermolide）、多西紫杉醇（docetaxel）、多柔比星（doxorubicin）、表柔比星（epirubicin）、埃博霉素（epothilone）、艾立布林（eribulin）、雌氮芥（estramustine）、依托泊苷（etoposide）、依喜替康（exatecan）、依昔舒林（exisulind）、铁锈醇（ferruginol）、氟尿苷（floxuridine）、氟达拉滨（fludarabine）、氟尿嘧啶、磷雌酚（fosfestrol）、福莫司汀（fotemustine）、更昔洛韦（ganciclovir）、吉西他滨（gemcitabine）、羟基脲、IT-101、伊达比星（idarubicin）、异环磷酰胺（ifosfamide）、咪喹莫特（imiquimod）、伊立替康（irinotecan）、伊洛福芬（irofulven）、伊沙匹隆（ixabepilone）、拉尼喹达（laniquidar）、拉帕替尼（lapatinib）、来那度胺（lenalidomide）、洛莫司汀（lomustine）、勒托替康（lurtotecan）、马磷酰胺（mafosfamide）、马索罗酚（masoprocol）、氮芥、美法仑（melphalan）、硫基嘌呤（mercaptopurine）、丝裂霉素、米托坦（mitotane）、米托蒽醌（mitoxantrone）、奈拉滨（nelarabine）、尼罗替尼（nilotinib）、奥利美生（oblimersen）、奥 沙 利 铂（oxaliplatin）、PAC-1、紫 杉 醇（paclitaxel）、培 美 曲 塞（pemetrexed）、喷司他丁（pentostatin）、哌泊溴烷（pipobroman）、匹克生琼（pixantrone）、普卡霉素（plicamycin）、丙卡巴肼（procarbazine）、蛋白酶体抑制剂 (例如硼替佐米
（bortezomib）)、雷替曲塞（Raltitrexed）、蝴蝶 霉素（Rebeccamycin）、Revlimid鲁比特康（rubitecan）、SN-38、salinosporamide A、沙铂（satraplatin）、链脲霉素（streptozotocin）、苦马豆素（swainsonine）、他立喹达（tariquidar）、紫杉烷、替加氟-尿嘧啶（tegafur-uracil）、替莫唑胺（temozolomide）、睾内酯（testolactone）、噻替派（thioTEPA）、硫鸟嘌呤（tioguanine）、拓扑替康（topotecan）、曲贝替定（trabectedin）、维甲酸（tretinoin）、四硝酸三铂（triplatin tetranitrate）、三(2-氯乙基)胺、曲沙他滨（troxacitabine）、尿嘧啶氮芥（uracil mustard）、戊柔比星（valrubicin）、长春花碱、长春新碱、长春瑞宾（vinorelbine）、伏立诺他（vorinostat）、佐舒喹达（zosuquidar）等。

[0573] 在另外的实施方案中，本文所述的治疗方法（例如免疫疗法），即本文所述的脂质体疫苗制剂，与放射线疗法（例如γ射线、X射线和/或直接将放射性同位素递送到肿瘤细胞、微波、UV辐射等）联合施用。在另外的实施方案中，本文所述的治疗方法（例如免疫疗法），即本文所述的脂质体疫苗制剂，与基因疗法联合施用。治疗性基因包括细胞增殖的诱导物（致癌基因）的反义形式、细胞增殖的抑制剂(肿瘤抑制基因)或程序性细胞死亡的诱导物（促细胞凋亡基因）。在一些实施方案中，本文所述的联合疗法伴随手术（例如切除术）来施用。

[0574] 在另外的实施方案中，本文所述的治疗方法(例如免疫疗法)，即本文所述的脂质体疫苗制剂，与止泻剂、止吐剂、止痛剂、阿片类药物和/或非甾体抗炎药联合施用。

[0575] 在进一步的实施方案中，将本文所述的脂质体疫苗制剂（例如包含SEQ ID NO: 2和PET脂质A TEA盐的制剂）施用至已用环磷酰胺或伊马替尼（imitanib）或达克珠单抗和/或任何其他抗癌剂预先治疗的个体。在其他实施方案中，将本文所述的脂质体疫苗制剂施用至尚未用环磷酰胺和/或任何其他抗癌剂预先治疗的个体。

[0576] 在一些上述的实施方案中，采用本文所述的脂质体疫苗制剂（例如包含SEQ ID NO:2的制剂）的治疗可延长罹患癌症的个体的寿命和/或增高其存活率。在一些上述的实施方案中，采用本文所述的脂质体疫苗制剂（例如包含SEQ ID NO:2的制剂）的治疗可改善罹患癌症的个体的生活质量（例如，当用本文所述的疫苗制剂免疫个体时，该个体需要较低剂量的引起副作用的抗癌药）。

[0577] 在一些上述的实施方案中，采用本文所述的脂质体疫苗制剂（例如包含SEQ ID NO:2的制剂）的治疗可诱发和/或维持个体的免疫应答。免疫应答包括体液应答（即抗体的产生）、细胞应答（即T-淋巴细胞的增殖和刺激）或此两者。细胞应答的活化和持续时间的测定可通过任何已知的方法来进行，包括例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分析。体液应答也通过已知方法来测定，包括对脂质体疫苗（比如IgG或IgM抗体部分）特异性抗体效价的分离和定量。

[0578] 本文还提供用于治疗个体中与异常糖基化MUC1有关的疾病、病症或病况的方法，其包括向具有异常糖基化MUC1的个体施用本文所述的脂质体疫苗制剂。在一些本文所述的方法的实施方案中，所述方法包括处理具有改变的糖基化模式的MUC1，包括相对于正常MUC1对应物的不足或低糖基化。在一些实施方案中，改变的模式来自于相对于正常MUC1对应物不同的糖基单元（即不同的糖类）。在本文所述的方法的其他实施方案中，该方法包括处理由于过度或高糖基化引起的异常糖基化的MUC1。

[0579] 表现出MUC1的低糖基化形式的疾病、病况和病症包括（但不限于）癌症，比如本文所述的癌症、癌前病变和癌症的肿瘤形成，例如前列腺的或上皮的增生；胰腺炎；炎性肠病；在表达MUC1的组织中诱发炎症的事件，例如泌乳和/或乳腺炎、盆腔手术、腮腺炎病毒和吸烟；以及其他发炎组织表型，如肠和结肠中的炎症。MUC1的高糖基化形式见于某些癌症中，包括（但不限于）鳞状细胞癌、鲍文氏病（Bowen′s Disease）和一些乳腺癌。

[0580] 剂量

[0581] 当将本文所述的脂质体疫苗制剂（例如包含糖脂肽的制剂，该糖脂肽具有一个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复肽）给予个体时，本领域技术人员会了解剂量将取决于数个因素，包括（但不限于）该个体的体重、肿瘤大小或肿瘤进展。如本文所用，通常接受本文所述的疫苗制剂（例如包含SEQ ID NO:2和PET脂质A佐剂的制剂）的个体是单一有机体。在某些实施方案中，个体是哺乳动物。特定地，个体是人类，包括男性或女性。在很多实施方案中，该个体是患者或是正等待或正进行医疗照护和治疗的个体。

[0582] 任选地以单一的或累积的应用给予个体剂量为约50μg、约100μg、约200μg、约300μg、约400μg、约500μg、约600μg、约700μg、约800μg、约900μg、约1,000μg、约
1,010μg、约1,020μg、约1,030μg、约1,040μg、约1,050μg、约1,060μg、约1,070μg、约 1,080μg、 约 1,090μg、 约 1,100μg、1,200μg、1,300μg、1,400μg、1,500μg、
1,600μg、1,700μg、1,800μg、1,900μg或约2,000μg的本文所述的以MUC1为基础的糖脂多肽脂质体疫苗制剂（例如包含SEQ ID NO:2和PET脂质A佐剂的制剂）。在特定实施方案中，给予该个体的剂量是每周约1,000μg的疫苗制剂。

[0583] 个体任选地接受本文所述的以MUC1为基础的糖脂多肽脂质体疫苗制剂（例如包含SEQ ID NO:2和PET脂质A佐剂的制剂）剂量，例如每天多次、每天、每隔一天、每周一次或是任何其他合适的给药方案。在一个实施方案中，例行给药包括在一段时间内每周一次施用本文所述的脂质体疫苗的剂量。当然，该给药方案任选地包含MUC1肽递送的其他组合。即，在医生的判断之下，一周一次、两次、三次、四次、五次、六次或更多次施用该疫苗。在一些实施方案中，会在一段时间内给予个体至少5份剂量。在其他实施方案中，会给予个体多于或少于5份剂量。因此，在一个实施方案中，个体每周会接受约1,000μg的MUC1糖脂化多肽的剂量。或者，该个体每周两次接受两份500μg的剂量，或是在五天内接受每天
100μg的剂量。

[0584] 这些剂量的实例并不具限制性，仅用来示范施用约1,000μg的MUC1糖脂化多肽的特定给药方案。例如，若对于指定状况的适当剂量为每周1,000μg，则该剂量任选地被分为任何数目的组合，例如每周注射四次250μg。如果用于特定状况的适当剂量大于或少于1,000μg，也同样适用。

[0585] 施用以MUC1为基础的糖脂多肽脂质体疫苗制剂（例如包含SEQ ID NO:2和PET脂质A佐剂的制剂)至个体的时间长度为任何合适的时间长度，其取决于癌症分期、患者病史及主治医师的判断。此合适的时间段的实例包括（但不限于）至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约13个月、至少约14个月、至少约15个月、至少约16个月、至少约17个月、至少约18个月、至少约19个月、至少约20个月、至少约21个月、至少约22个月、至少约23个月或至少约24个月或更长。如果需要的话，治疗时间任选地持续超过24个月，比如30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月、36个月或超过36个月。

[0586] 在另一实施方案中，任何本文所述的方法的给药时间长度为至少约2周、至少约4周、至少约8周、至少约16周、至少约17周、至少约18周、至少约19周、至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约60周、至少约68周、至少约72周、至少约80周、至少约88周、至少约96周或至少约104周。

[0587] 任选地在不同的治疗阶段施用任何本文所述的脂质体疫苗制剂（例如包含SEQ ID NO:2和PET脂质A佐剂的制剂）。例如在治疗期和维持期施用以MUC1为基础的糖脂多肽脂质体疫苗制剂。在一些实施方案中，治疗期会包含以每周剂量施用脂质体疫苗制剂，而维持期为一段较长的时间，比如约每6周、约每7周、约每8周、约每9周、约每10周、约每11周、约每12周或更长。在一些情况下，在治疗期给予的剂量会大于在维持期所给予的剂量。
然而，治疗和维持期针对特定个体而设计，所以治疗和维持期之间的时间和剂量会随上述的实例而不同。通常，维持期开始于任何被认为适当的时间。例如在一些实施方案中，治疗期为八周，而维持期会持续整个个体的生命期。在其他实施方案中，只会进行治疗期或维持期。

[0588] 在进一步的实施方案中，预防性地给予本文所述的脂质体疫苗（例如包含SEQ ID NO: 2和PET脂质A佐剂的制剂）。在这些实施方案中，施用脂质体疫苗制剂可预防个体（例如遗传上倾向于发展癌症如乳腺癌的个体）中癌症的发作。

[0589] 个体应保持本文所述的疫苗制剂的时间长度由主治医师决定。在一些情况下，在个体余下的生命中施用该疫苗制剂是有利的。在一些这样的实施方案中，在身体的四个四分象限（quadrants）处施用疫苗制剂，例如淋巴结附近（例如在每个腋窝）、在每个臀部（例如皮下）等。在一些这样的实施方案中，经由泵施用疫苗制剂。在一些实施方案中，将泵和/或递送装置植入到个体内，以允许长期给药。可植入泵的实例包括（且不限于）Alzet 渗透泵。

[0590] 药盒（kit）

[0591] 本文提供用于分配本文所述的脂质体疫苗制剂的药盒。此类药盒包含第一药品小瓶，其包含含有一个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复的糖脂肽和佐剂（PET脂质A，三乙胺盐），及第二小瓶，其含有本文所述的用于重建的合适的无菌液体。在一些实施方案中

[0592] 例如，在一个实施方案中，此类药盒包含第一小瓶，即含有300μg的糖脂肽（其包含一个或多个拷贝的SEQ ID NO:1的核心串联重复）和150μg的佐剂（PET脂质A，三乙胺盐）的药品小瓶，其代表120%的装填量。这种过量旨在于使特定剂量的取出和施用更加方便。该药盒进一步包含第二小瓶，其含有至多1mL的0.9%的注射用氯化钠溶液。以0.6mL的注射用氯化钠溶液(0.9%w/v)重建药品后，药品小瓶产生0.5mL，用于递送相当于250μg的包含一个或多个拷贝的SEQ ID NO:1核心串联重复的糖脂肽。举例来说，如果剂量总共是1mg，则每剂量需要4小瓶。

[0593] 某些定义

[0594] 本文所用的“主要碳链”指长度为至少六个碳的碳链。碳链的碳原子可结合3、2、1或0个氢。在主要碳链中，--CH<和>C<碳通常为用以连接到另一碳链的分支点（带有或不带有连接体）。在一些实施方案中，它们可被侧基如氨基或羟基取代。任何主要碳链的碳原子可包括一个或多个羰基或硫代羰基的碳，即--C(=O)--或--C(=S)--。

[0595] “强亲脂性基团”指包含至少五个非氢的原子的亲脂性基团，如由Meylan算法所预测，该亲脂性基团的log P大于3。基团的亲脂性可通过测量STP处非极性溶剂（例如乙醇、二氧杂环己烷、丙酮、苯、正辛醇）和水之间的分子HZ（其中Z是上述的侧链）的分配系数来确定。亲脂性可被定义为这个分配系数的对数（log P）；那么对于倾向于非极性溶剂的分子而言该值是正值。因此，亲脂性基团是log P大于零的基团。

[0596] 分配系数(P)被定义为溶解的物质在由两种基本不混溶的溶剂所组成的两相系统中的平衡浓度比。一种这样的系统是正辛醇：水；辛醇相含有约20%的水，而水相有约0.008%的辛醇。因此，相关分配系数(Pow)是用水饱和的辛醇中溶质摩尔浓度与用辛醇饱和的水中溶质摩尔浓度的比例。正辛醇是生物膜的有用替代物，因为像很多膜组分一样，正辛醇是两亲性的。（除非另外说明，否则此后提到log P时将指log Pow。）

[0597] 更多测定Pow的方法的资料参见Sangster,J.,Octanol-Water PartitionCoefficients:Fundamentals and Physical Chemistry(1997年4月)(ISBN0-471-9739)。
辛醇-水分配系数的列表参见EPA″Chemicals in the Environment:OPPT Chemicals
Fact Sheets″the USDA Pesticide Properties Databases,Sangster,J.,″Octanol-Water Partition Coefficients of Simple Organic Coompounds″,J.Phys.Chem.Ref.Data,18:1111-1230(1989)；Verbruggen,E.M.J. 等 人, ″ Physiochemical Properties of Higher Nonaromatic Hydrocarbons:Literature Study, ″ J.Phys.Chem.Ref.
Data,29:1435-46(2000)。应注意的是，对不同化合物收集的Pow值可能是通过不同的方法测定的。

[0598] 在Meylan法中，通过将每个片段的加权系数（原始系数乘上该片段的拷贝数）加上常数0.2290，以获得预测的log Pow。涵盖的片段包括脂肪族连接的--CH3(0.5473)、--CH2-(0.4911)、--CH(0.3614)、--OH(-1.4086)、--NH2(-1.4148)、--C(=O)N(-0.5236)、--SH(-0.0001)、--NH--(-1.4962)、N=C(-0.0010)、--O--(-1.2566)、--CHO(-0.9422)、-叔C因而3+C连接的(0.2676)、C无H且非叔(0.9723)、--C(=O)O--(-0.9505)、--C(=O)--(-1.5586)、=CH或C<(0.3836)、#C(0.1334)、--C(=O)N(-0.5236)、--O--CO--C--N--CO(-0.5)、--SO--O(-9)、--O--P(-0.0162)；O=P(-2.4239)、磷酸连接的--OH(0.475)；芳族C(0.2940)、芳族N(5元环)(-0.5262)和芳族连接的--OH(-0.4802)。

[0599] 对于强亲脂性基团，经Meylan算法预测的logP至少为3。在进一步的实施方案中，对于强亲脂性基团，logP为至少4、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10或超过10。

[0600] 强亲脂性基团包含一个或多个碳链，并且在一些实施方案中，包含一个或多个主要碳链。强亲脂性基团包括简单（无分支、无环）的脂质或复杂（分支和/或环状，包括部分芳族）的脂质。

[0601] 在一些实施方案中，强亲脂性基团包含不超过100个非氢原子、不超过80个非氢原子、不超过60个非氢原子或不超过40个非氢原子。

[0602] 如先前提到的，强亲脂性基团必须包含至少五个非氢原子。在一些实施方案中，它包含至少六个，更优选至少8个，更优选至少9个，甚至更优选地，它包含至少11个非氢原子，更优选至少13个非氢原子，更优选至少21个非氢原子。

[0603] 在一些实施方案中，强亲脂性基团具有限于元素碳、硅、氢、氧、氮、硫和磷的元素构成。在一些实施方案中，不含氢的侧链内的大多数键为碳-碳键。

[0604] 因为氧、氮、硫和磷的存在易于降低亲脂性，在一些实施方案中，在强亲脂性基团中超过50%或超过75%的非氢原子为碳原子。

[0605] 基于相同的原因，在一些实施方案中，强亲脂性基团包含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个碳原子。

[0606] 强亲脂性基团的额外参考可在美国专利第7,820,627号中找到，该文献中关于亲脂性和强亲脂性基团的讨论及应用在此引入作为参考。

[0607] 实施例

[0608] 实施例1：脂质体疫苗制剂的合成

[0609] 将SEQ ID NO:2的 糖 脂 肽(159mg)、PET 脂 质 A(96mg)、DPPC(4.36g)、DMPG Na(0.54g)和胆固醇(2.60g)溶解于含有5mL无菌水的117克叔丁醇中，用于灌洗。

[0610] 将加热的叔丁醇溶液和加热的无菌水在设定为所需流速的分离马达下进行泵送，从而使水相与有机相的流速比保持恒定在5.9:1，以产生总体分布为90%（d90）≤0.22μm的脂质体，允许经过至少一个无菌过滤器过滤。使用描述于图1中的程序，准备含有冻干固体的小瓶。将下列批次的制剂用于1L规模的批次，其相当于500个小瓶。

[0611] 将该制剂以所述批量大小分次或多次使用。

[0612]

[0613]

[0614] #未包含在最终制剂中。在冻干过程中移除水和醇。

[0615] 将脂质体混合物无菌过滤并冻干。冻干的药品为无菌粉剂，其在重建后产生不含可见颗粒的乳状悬浮液。该容器封闭系统包含带有13mmFlurotec 塞和13mm铝封的5mL的1型玻璃小瓶。在替代的实施方案中，该容器封闭系统包含3mL的1型玻璃小瓶。

[0616] 以注射用氯化钠溶液（0.9%w/v）重建后，每一小瓶提供拟用

[0617] 于皮下给药的冻干脂质体制剂。

[0618] 也将上述脂质体疫苗制剂按比例放大到9L规模的批次。批次制剂如下：

[0619]#

[0620] 未包含在最终制剂中。在冻干过程中移除水和醇。

[0621] 图2显示从上述过程中所获得的脂质体疫苗的示例性图像。图2A显示从批样本中所获得的玻璃化的、配制的脂质体的透射电子显微镜照片。图2B显示在光学显微镜检查下于盐水中重建的脂质体疫苗的图像。图2C显示在电子显微镜检查下重建的脂质体疫苗的冷冻断裂图像。

[0622] 实施例2：实施例1的脂质体疫苗制剂对CD4+和CD8+T淋巴细胞中IFNγ的诱导

[0623] 将实施例1的脂质体疫苗制剂以5μg/小鼠、25μg/小鼠或100μg/小鼠的浓度注射到C57Bl/6J雌性小鼠中。对照包括50μg/小鼠的盐水处理和单独PET脂质A处理。免疫之后，从C57Bl/6小鼠中分离出脾细胞，并用具有SEQ ID NO:2的MUC1肽、具有序列CTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAS*S*L（SEQ ID NO:20，S*为脂化丝氨酸）的阴性对照肽BP-1-109、盐水载体离体刺激48个小时，或不予处理。

[0624] 图3显示用各种抗原离体刺激的CD4-/CD8+（图3A）或CD4+/CD8-（图3B）T淋巴细胞中的细胞内IFNγ浓度。数据表示为相对于总CD4+或CD8+细胞群的阳性IFNγ细胞的%。以各种浓度的实施例1的脂质体疫苗制剂进行体内处理的小鼠的T细胞，当以MUC1肽离体激发时，相对于盐水处理，具有统计上显著（p<0.05）的IFNγ诱导。

[0625] 实施例3：用于测试实施例1的脂质体疫苗制剂的体液应答的体内动物模型

[0626] 将实施例1的脂质体疫苗制剂以三种不同疫苗浓度（5、25和100μg）注射到C57Bl/6J小鼠。使用50μg剂量的PET脂质A和盐水作为阴性对照。分离取自小鼠的血清，并随后进行连续稀释，且在用具有SEQ ID NO:2的MUC1抗原包被的板上温育。与血清温育之后，洗涤该板，并加入标记的抗小鼠IgG特异性抗体。将该抗体洗掉，并经由ELISA测读仪测量小鼠IgG。图4中的ELISA分析显示在所有的三个剂量组中（即5μg/小鼠、25μg/小鼠、100μg/小鼠）抗体量为相似的。相反地，以盐水和PET脂质A处理的动物显示无抗体应答。

[0627] 在相似的实验中，以实施例1脂质体疫苗制剂或非糖基化MUC1疫苗（疫苗A）注射小鼠。使用未经处理的组（naive group）作为阴性对照组。分离、稀释血清，并将其与具有SEQ ID NO:2的糖基化MUC1肽或非糖基化MUC1肽（STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAKG，SEQ ID NO:21）一起温育。图5显示在以实施例1脂质体疫苗处理的小鼠或以疫苗A处理的小鼠中IgG与糖基化肽的结合（上部）相对于以实施例1脂质体疫苗处理的小鼠或以疫苗A处理的小鼠中IgG与非糖基化肽的结合（下部）的比较。

[0628] 实施例4：转基因人类MUC1动物模型中实施例1的脂质体疫苗制剂对于IFNγ和抗体的诱导

[0629] 表 达 人 类 MUC1 的 转 基 因 (Tg) 小 鼠 系 根 据 Peat 等 人 ,Cancer Res.,52:1954-1960,1992获得。MUC1Tg小鼠以与人类内源性MUC1表达相似的模式或水平来表达人类MUC1转基因。

[0630] 在下列实验中，MUC1 Tg小鼠（N=5/组）以下列方式中的一种进行处理：(1)以环磷酰胺（第-3天）预处理，并每周以5、25或100μg的实施例1脂质体疫苗制剂处理八周，(2)以盐水对照处理，或(3)单独50μg PET脂质A佐剂。在处理期结束时，根据IFNγ诱导评估小鼠的T细胞应答并通过ELISA评估小鼠的抗体应答。

[0631] IFNγ诱导：收集的脾细胞各分离自盐水处理的、PET脂质A处理的和脂质体疫苗制剂处理的MUC1Tg小鼠组，并以具有SEQ ID NO:2的MUC1肽、具有序列CTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAS*S*L（SEQ ID NO:20，S*是脂化丝氨酸）的阴性对照肽BP-1-109或载体离体刺激48个小时。使用Luminex技术测量细胞培养上清液中离体处理后的IFNγ表达或诱导(图6A)。用实施例1脂质体疫苗制剂在所有三种浓度下免疫的转基因动物在以具有SEQ ID NO:2的MUC1肽离体刺激下显示出IFNγ应答。

[0632] 抗体诱导：从上述处理的动物中收集血清，并使用与先前实施例相似的具有SEQ ID NO:2的MUC1肽进行ELISA分析。图6B显示出以5、25或100μg的实施例1脂质体疫苗制剂接种或用50μg的脂质体PET脂质A或盐水处理的小鼠中的总IgG含量。图6C显
示来自以25μg的实施例1脂质体疫苗制剂接种的小鼠的IgG同种型。图6B和6C中的绘
制数据表示从5只个别小鼠中所得的平均血清IgG含量。

[0633] 实施例5：实施例1的脂质体疫苗制剂和对于人类肿瘤MUC1的抗体特异性

[0634] C57Bl/6J小鼠以100μg的实施例1脂质体疫苗制剂进行接种。使用从经处理的小鼠或未经处理的动物（naive animals）取得的血清进行B16或B16-MUC1小鼠黑色素瘤细胞系的FACS分析。使用抗MUC1抗体SM3（SCBT SC-53381）作为低糖基化MUC1的阳性对照。图7A显示来自用实施例1脂质体疫苗制剂免疫的小鼠的IgG会选择性结合到细胞
MUC1。

[0635] 在相似的实验中，使用以100μg的实施例1脂质体疫苗制剂或50μg的PET脂质A接种的人类MUC1转基因小鼠中获得的血清对人类乳腺上皮细胞和T47D乳腺癌细胞进行染色。通过流式细胞术使用荧光偶联的抗小鼠第二抗体检测细胞染色。图7B显示来自用实施例1脂质体疫苗制剂免疫的小鼠的IgG可以区分正常和肿瘤MUC1。再度使用SM3
作为低糖基化MUC1的阳性对照，且使用MUC1单克隆抗体B27.29和Stemcell（StemCell Technologies）作为完全糖基化正常MUC1的阳性对照。

[0636] 实施例6：实施例1的脂质体疫苗制剂对于肿瘤生长的影响

[0637] 从第-42天开始，使用每两周的程序，以盐水载体、50μg脂质体PET脂质A或5μg6 6
的实施例1脂质体疫苗制剂处理C57Bl/6小鼠。在第0天，以2×10B16-MUC1、0.5×10B16
6
或2×10MC38-MUC1肿瘤细胞激发小鼠，随后在第+3天和第+17天进行两次额外的接种。
每周两次记录肿瘤生长。

[0638] 在B16-MUC1模型中，以实施例1疫苗制剂处理的动物在第44天仍没有肿瘤。在研究结束时，在实施例1疫苗制剂组中9/12的动物没有肿瘤。相反地，盐水和PET脂质A3
组显示出相似的肿瘤生长曲线。到第10天时，这两个组的平均肿瘤体积为约200mm。到第
3
24天，盐水和PET脂质A组的平均肿瘤体积为约1200mm。

[0639] 在MC38-MUC1模型中，在研究结束时，在实施例1疫苗制剂组中3/12的动物没有肿瘤。相比于盐水和PET脂质A组，肿瘤生长也减缓。到第32天，相比于PET脂质A组的3 3 3
约1200mm和盐水组的约1700mm ，实施例1疫苗制剂组的平均肿瘤体积为约120mm。

[0640] 在肿瘤不会显示出MUC1的B16模型中，在所有三组中肿瘤生长均相似。

[0641] 实施例7：用于测试脂质体疫苗制剂对非小细胞肺癌的免疫疗法的效果的临床试验

[0642] 这是一个前瞻性的开放标签的、设有对照的、随机化的研究，以测试实施例1脂质体疫苗用于治疗第IIIB期或第IV期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的主动特异性免疫疗法的安全性和效力。为了能够符合资格，进入该试验的患者将需要显示出在一线治疗（单独的化学疗法，或化学疗法和放射疗法）之后疾病稳定或是有临床反应，并且ECOG表现状态（performance status）为0、1或2。经过3周的药物洗脱期（washout period）之后，患者依疾病状态（第IIIB期局部区域性疾病或第IIIB期伴恶性胸腔积液和第IV期）进行分级，并随机分至最佳支持性医护（BSC）加上疫苗免疫疗法或是单独的BSC。

[0643] 在第0、1、2、3、4、5、6和7周进行八次1,000μg的实施例1脂质体疫苗的每周皮下接种。

[0644] 主要结果评价是实施例1脂质体疫苗的安全性谱的文件，以及两个试验小组中患者存活率的比较。次要结果评价是测定实施例1脂质体疫苗引发的免疫应答并评估进行免疫疗法的患者的生活质量。

[0645] 实施例8：用于测试脂质体疫苗制剂在晚期实体瘤患者中的最大耐受剂量和/或推荐剂量的临床试验

[0646] 这是一个开放标签的、第I期剂量递增研究，以评估实施例1脂质体疫苗在先前治疗的第3期或第4期实体瘤患者中重复剂量接种的安全性和免疫原性，其组织学与MUC1抗原的表达有关，该实体瘤包括（但不限于）：乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌和肾细胞癌。

[0647] 第1部分评估每隔一周一次（Q2W）皮下施用实施例1脂质体疫苗历经8周（总共4份剂量）或每周一次(QW)历经8周（总共8份剂量）的递增剂量水平，并使用3+3剂量递增设计，来确定每个给药方案的最大耐受剂量(MTD)和/或推荐剂量(RD)，以供在该研究的第2部分中进一步评价。第2部分评价在各有15位患者的每组中在8周期间以Q2W和QW
MTD/RD施用的实施例1脂质体疫苗的安全性、免疫原性和潜在的抗肿瘤活性。在8周的给药期之后，评价患者的安全性、免疫应答和肿瘤反应至第20周。

[0648] 研究群体包括先前治疗的第3或4期实体瘤（其组织学与MUC1表达相关）患者。

[0649] 入选标准：

[0650] ·在同意时为18-70岁

[0651] ·根据研究者的判断至少6个月的预期寿命

[0652] ·组织学上确定患有乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌或肾细胞癌或其他肿瘤类型

[0653] ·至少一个对于局部晚期或转移性疾病的全身性疗程（包括化学疗法、靶向疗法或免疫疗法）之后，仍证明有持续性、复发性或进行性疾病

[0654] ·临床第3或4期疾病

[0655] ·ECOG为0或1

[0656] ·适当的血液、肾和肝功能参数

[0657] 排除批准：

[0658] ·在4周的研究药物给药内曾接受任何全身性化学疗法、放射或实验药剂的治疗[0659] ·有已知的自身免疫病、动脉炎或血管炎或经诊断的免疫缺陷疾病（例如细胞免疫缺陷、低丙球蛋白血症或异常丙种球蛋白血症）的病史

[0660] ·有任何先前存在的需要长期类固醇或免疫抑制疗法的医疗状况

[0661] ·HIV、乙型肝炎或丙型肝炎阳性

[0662] ·在入选研究之前≤4周曾接受过任何其他的疫苗

[0663] 给药模式：在第-3天所有受试者接受环磷酰胺250mg/m2的初始静脉内注射。按照组别分配，从第1天开始皮下施用实施例1的脂质体疫苗。所有患者在四个单独的注射部位接受作为四次单独注射施用的实施例1脂质体疫苗（在右上臂或大腿、左上臂或大腿及右和左下腹部各进行一次注射）。开始剂量是250μg的脂质体疫苗和125μg的PET脂质A佐剂（2:1的比例)。额外的剂量水平包括2:1比例的500和1000μg脂质体疫苗与佐剂。使用剂量加倍设计（dose-doubling design）来选择剂量水平。当MTD小于1000μg时，考虑中间剂量水平，750μg。

[0664] 在第2部分八周给药的评价和分析中，免疫应答测量包括使用对于实施例1脂质体疫苗特异性的ELISA测定MUC-1特异性抗体的血清效价及对于IFN-γ的MUC-1特异性ELIPSOT分析。免疫应答量度还包括（但不限于）：循环CD4和CD8T细胞的比例、循环骨髓抑制细胞群的比例、T细胞细胞因子的含量、抗实施例1脂质体疫苗的IgG和IgM抗体的相对比例和循环细胞因子的含量。如RECIST1.1所定义的来评估肿瘤反应。

[0665] 虽然本文已经显示并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员很明显的是，这些实施方案仅通过举例而提供。本领域技术人员现在将想到不偏离本发明的各种变化、改变和取代。应了解的是，可使用本文所述发明的实施方案的多种替代方案来实施本发明。以下权利要求旨在限定本发明的范围并由此覆盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等效物。