生防菌株BS102在防治农作物黄曲霉毒素污染中的应用转让专利
申请号 : CN201310755130.1
文献号 : CN103783084B
文献日 : 2016-03-09
发明人 : 尹燕妮 , 陈云 , 马忠华
申请人 : 浙江大学
摘要 :
本发明公开了一种生防菌株BS102在防治农作物黄曲霉毒素污染中的应用，所述的生防菌株BS102为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS102，保藏编号为CGMCC No.7728。所述的应用包括：制备含所述生防菌株BS102的生防菌剂；将所述的生防菌剂施在所述的农作物上。本发明的生防菌株对黄曲霉的拮抗作用强烈，可用于黄曲霉毒素污染的防治。且本发明提供了黄曲霉毒素污染的生物防治方法，不使用化学农药，具有无毒、不易产生抗药性、环境和生物安全等优点，具有广阔的应用前景。
权利要求 :
1.生防菌株BS102在防治农作物黄曲霉毒素污染中的应用，其特征在于，所述生防菌株BS102为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS102，保藏编号为CGMCC No.7728；所述的农作物为鲁花9号花生；
所述的应用包括：(1)制备含所述生防菌株BS102的生防菌剂；(2)将所述的生防菌剂
8 10
施在所述的农作物上；生防菌剂中，所述生防菌株BS102的浓度为1×10～10 CFU/mL；
所述生防菌剂通过如下方法进行制备：(A)将所述生防菌株BS102于培养基中培养至OD600为0.5～0.8，获得种子液；(B)将接种量为1～2％的种子液接种于发酵培养液中扩
8 10
大培养，调节发酵液中生防菌株BS102的浓度至1×10～10 CFU/mL，获得所述生防菌剂；
以每升计，所述发酵培养液的配方为：葡萄糖，18～22g；L-谷氨酸，2.4～2.6g；L-天门冬酰胺，2.4～2.6g；KH2PO4，0.8～1.2g；MgSO4·7H2O，0.4～0.6g；KCl，0.4～0.6g；酵母-3 -3粉，0.8～1.2g；L-苯丙氨酸，2～3×10 g；MnSO4·H2O，5～6×10 g；CuSO4·5H2O，0.16～-3 -3
0.18×10 g；FeSO4·7H2O，0.15～0.17×10 g。
说明书 :
生防菌株BS102在防治农作物黄曲霉毒素污染中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于作物病害防控技术领域，尤其涉及一种生防菌株BS102在防治农作物黄曲霉毒素污染中的应用。
背景技术
[0002] 据世界粮农组织估计，目前世界范围内有25％的农作物产品受真菌毒素的污染，其中主要就是黄曲霉毒素（Aflatoxin，以下简写成AFT）。黄曲霉毒素中，毒性最强、危害最大的为B1毒素，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍，被列入严管的特剧毒物质。2006年，国家疾病预防控制中心营养与食品安全所对我国部分食品（包括玉米、花生）中黄曲霉毒素污染情况调查发现，从江苏、上海、浙江等九省市采集市售玉米中AFT的检出率为70.27％，平均含量为36.51ug／kg，最高为1098.36ug／kg，并有14.86％的玉米样品中B1毒素含量超出国家限量标准。花生中黄曲霉毒素的检出率为24.24％，平均含量为80.27ug／kg，最高为437.09ug／kg，且有3.03％的花生样品中黄曲霉毒素含量超出国家食品法典限量标准。由此可见，黄曲霉毒素污染严重威胁我国花生和玉米等作物的安全生产，而且严重影响着食品安全和农产品出口竞争力。
[0003] 由于AFT污染所带来的巨大经济损失和严重的食品安全问题，人们一直在努力寻求有效控制AFT污染的策略和措施，包括良好的田间管理、虫害控制、抗性育种等，但这些都没能从根本上解决问题。近来美国研究发现，利用不产毒素的黄曲霉菌株能有效控制农产品AFT的污染问题。
[0004] 我国在AFT生物防治方面研究还刚刚起步。已有研究发现，一株不产黄曲毒素的黄曲霉菌株A051可用来控制农产品黄曲霉毒素的污染（ZL200810120929.2），由乳酪杆菌、枯草芽孢杆菌和异常汉逊酵母复合培养液在抑制黄曲霉生长和降解毒素方面有一定作用（CN201110190287.5）。公开号为CN102816725A的中国专利文献还公开了一种枯草芽孢杆菌T-500，该菌株虽然对多种病原菌具有拮抗作用，但是对黄曲霉菌的抑制率仅为35.7%，效果较差。我国微生物资源丰富，挖掘其它控制黄曲霉毒素污染的潜在生防菌，对有效控制我国黄曲霉毒素污染意义重大。
发明内容
[0005] 本发明提供了一种生防菌株BS102在防治农作物黄曲霉毒素污染中的应用。
[0006] 所述生防菌株BS102的分类命名枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），完整命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS102，已于2013年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.7728。
[0007] 该菌株BS102在LB培养基上菌落表面粗糙、不透明，呈现皱缩、白色，能够形成芽孢，能移动，需氧型。
[0008] 实验发现，本发明的生防菌株BS102对黄曲霉菌菌丝生长、孢子萌发有较好的抑制作用，对储存过程中花生黄曲霉毒素污染具有较好的防治效果，因此，可将该生防菌株BS102用于防治农作物的黄曲霉毒素污染。
[0009] 所述的农作物具体可以为花生，其中，所述花生的品种具体可以为鲁花9号。
[0010] 所述应用具体包括：
[0011] （1）制备含所述生防菌株BS102的生防菌剂；
[0012] （2）将所述的生防菌剂喷施在所述的农作物上。
[0013] 喷施生防菌剂时，选择农作物易被黄曲霉毒素污染的时期进行喷施,喷施至农作物表面水珠流动即可。如对花生黄曲霉毒素污染进行防治时，可在储藏期将所述的生防菌剂喷施在花生果实上，喷施至花生果实表面水珠流动即可，喷施结束后可将花生置于常温储存。
[0014] 为达到较好的防治效果，所述的生防菌剂中，所述生防菌株BS102的浓度优选为8 10 8
1×10～10 CFU/mL，更优选为1×10CFU/mL。
1×10～10 CFU/mL，更优选为1×10CFU/mL。
[0015] 所述生防菌剂可通过如下方法进行制备：
[0016] （1）将所述生防菌株BS102于培养基中培养至OD600为0.5～0.8，获得种子液；
[0017] （2）将种子液接种于发酵培养液中扩大培养，调节发酵液中生防菌株BS102的浓8 10
度至1×10～10 CFU/mL，获得所述生防菌剂。
度至1×10～10 CFU/mL，获得所述生防菌剂。
[0018] 所述的培养基可选用LB液体培养基。
[0019] 其中，所述种子液的接种量优选为1～2%（v/v），优选为1%（v/v）。
[0020] 以每升计，所述发酵培养液的配方为：葡萄糖，18～22g；L-谷氨酸，2.4～2.6g；L-天门冬酰胺，2.4～2.6g；KH2PO4，0.8～1.2g；MgSO4·7H2O，0.4～0.6g；KCl，0.4～0.6g；
-3 -3
酵母粉，0.8～1.2g；L-苯丙氨酸，2～3×10 g；MnSO4·H2O，5～6×10 g；CuSO4·5H2O，-3 -3
0.16～0.18×10 g；FeSO4·7H2O，0.15～0.17×10 g；调节pH值为7.0。
-3 -3
酵母粉，0.8～1.2g；L-苯丙氨酸，2～3×10 g；MnSO4·H2O，5～6×10 g；CuSO4·5H2O，-3 -3
0.16～0.18×10 g；FeSO4·7H2O，0.15～0.17×10 g；调节pH值为7.0。
[0021] 作为进一步优选，以每升计，所述发酵培养基液的配方为：葡萄糖，20g；L-谷氨酸，2.5g；L-天门冬酰胺，2.5g；KH2PO4，1g；MgSO4·7H2O，0.5g；KCl，0.5g；酵母粉，1g；L-苯-3 -3 -3 -3丙氨酸，2×10 g；MnSO4·H2O，5×10 g；CuSO4·5H2O，0.16×10 g；FeSO4·7H2O，0.15×10 g；
调节pH值为7.0。该发酵培养液由Landy培养基改良而来，更有利于本发明所述枯草芽孢杆菌的增殖。
调节pH值为7.0。该发酵培养液由Landy培养基改良而来，更有利于本发明所述枯草芽孢杆菌的增殖。
[0022] 本发明中，所述扩大培养是发酵罐中进行的，所述扩大培养的温度为28～30℃，优选为30℃，所述扩大培养的时间为20～24h。在该培养条件下，在保证菌活力的同时使其具有较快的增殖速度。
[0023] 扩大培养过程中，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量20%，通气量5-7m3/小时，转速240～260r/min，罐压0.05-0.1KPa。发酵液出罐后梯度稀释涂板检测并调节菌悬液浓度为
8 10
1×10～10 CFU/mL。
8 10
1×10～10 CFU/mL。
[0024] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0025] （1）本发明的生防菌株BS102为枯草芽孢杆菌，生防菌BS102菌体和上清在平板拮抗试验中显示对黄曲霉菌菌丝生长、孢子萌发有较好的抑制作用，可将其应用于农作物黄曲霉毒素污染中的生物防治。
[0026] （2）光照培养箱进行的花生黄曲霉毒素污染防治试验效果显示，本发明的生防菌株BS102能有效抑制病菌在花生表面的生长，防效高达92.04%，在常温贮藏条件下，本发明的生防菌株BS102对花生黄曲霉毒素污染的防效仍可达到71%以上，防治效果好，因此可利用该生防菌株BS102防治花生黄曲霉毒素污染。
[0027] （3）本发明生防菌株BS102应用于农作物黄曲霉毒素污染中的防治，可完全克服因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于农产品的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于提高产品质量。
附图说明
[0028] 图1为生防菌BS102的菌落形态图。
[0029] 图2为生防菌BS102平板拮抗黄曲霉菌菌丝生长。
[0030] 图3为生防菌BS102无菌上清抑制黄曲霉菌菌丝生长。
[0031] 图4为生防菌BS102无菌上清抑制黄曲霉菌孢子萌发。
[0032] 图5为BS102生防菌剂光照培养箱防治花生黄曲霉毒素污染的效果。
具体实施方式
[0033] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。
[0034] 实施例1 BS102生防菌株的采集、分离和鉴定
[0035] BS102菌株分离自浙江省绍兴市花生根围土壤中。取土壤置于无菌水中，振荡1小时后，吸取上清，80℃水浴10分钟后涂布于LB平板上；次日挑取菌落进行纯化培养。
[0036] 菌株BS102在LB培养基上菌落表面粗糙、不透明，呈现皱缩、白色（见图1），能够形成芽孢，能移动，需氧型。
[0037] 提取该菌株的DNA，扩增16S rDNA序列，进行测序，该菌株的16SrDNA如SEQ ID No.1所示，序列在NCBI中的比对结果显示与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的同源性最高。
[0038] 该菌株已保存在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2013年6月18日，保藏编号为：CGMCC No.7728。
[0039] 实施例2 生防菌剂的制备
[0040] 1、生防菌剂的制备
[0041] （1）将生防菌株BS102接种到LB培养液中，30℃，180r/min振荡培养，12～16小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，OD测定过程中以未接菌的培养液来调零；
[0042] （2）当振荡培养至菌液的OD值为0.5～0.8之间时即为种子菌液，将种子菌液以体积比为1：100加入装有发酵培养液的200L发酵罐中，30℃250r/min振荡培养20～243
小时，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量为20%，通气量5-7m/小时，罐压为0.05-0.1KPa。发
9
酵液出罐后梯度稀释涂板检测并调节菌悬液浓度约为1×10cfu/ml。
小时，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量为20%，通气量5-7m/小时，罐压为0.05-0.1KPa。发
9
酵液出罐后梯度稀释涂板检测并调节菌悬液浓度约为1×10cfu/ml。
[0043] 发酵培养液的配方（每升）为：葡萄糖，20g；L-谷氨酸，2.5g；L-天门冬酰胺，2.5g；-3
KH2PO4，1g；MgSO4·7H2O，0.5g；KCl，0.5g；酵母粉，1g；L-苯丙氨酸，2×10 g；MnSO4·H2O，-3 -3 -3
5×10 g；CuSO4·5H2O，0.16×10 g；FeSO4·7H2O，0.15×10 g；调节pH值为7.0。
KH2PO4，1g；MgSO4·7H2O，0.5g；KCl，0.5g；酵母粉，1g；L-苯丙氨酸，2×10 g；MnSO4·H2O，-3 -3 -3
5×10 g；CuSO4·5H2O，0.16×10 g；FeSO4·7H2O，0.15×10 g；调节pH值为7.0。
[0044] 实施例3 BS102生防菌株对黄曲霉菌的拮抗活性测定
[0045] 1、BS102对黄曲霉菌平板拮抗活性测定
[0046] （1）试验方法
[0047] 采用对峙培养法，将保存于4℃中的黄曲霉菌HZ17(前期试验鉴定产黄曲霉毒素的菌株，该菌株对嘧霉胺产生抗性)接种到PDA平板上活化，待真菌长满平板后用灭菌的打孔器从菌落外边缘均匀的打成直径为6mm的圆形菌块。将菌丝块接种在WA平板（WA培养基/L：蛋白胨5g，葡萄糖10g，肉汁浸膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，pH=7.0）的中心，在其四周距中心约25mm处分别接种BS102，试验以枯草芽孢杆菌模式菌株PY79、清水和10μg/ml嘧霉胺为对照组。25℃培养，待菌丝接近长满平板时测量抑菌圈的大小（从细菌菌落中心算起）。
[0048] 根据抑菌圈的大小对BS102的拮抗黄曲霉菌活性进行评估：0mm无抑制作用；＜2mm有轻微的抑制作用；2-5mm中等抑制作用；＞5mm较强的抑制作用。
[0049] 抑制率根据以下公式进行计算：
[0050] 抑制率=100(R1-R2)/R1，R1为对照病原菌在清水方向上的菌落半径；R2为病原菌在细菌方向的菌落半径。
[0051] （2）结果分析
[0052] 如图2所示，平板拮抗试验表明：生防菌BS102对黄曲霉菌菌丝生长具有较强的抑制效果，抑制圈半径为12.0mm，菌丝抑制率为61.8%，而阴性对照PY79、清水和嘧霉胺处理组无拮抗效果。
[0053] 2、生防菌BS102无菌上清抑制黄曲霉菌菌丝活性测定
[0054] （1）试验方法
[0055] 取实施例2的生防菌BS102菌株发酵液，10,000r/min，离心10min后取上清。上清经细菌滤器（0.22μm）过滤后待用。
[0056] 向50℃WA培养基中加入黄曲霉菌HZ17的孢子，至孢子终浓度为105个/ml。将含黄曲霉菌HZ17孢子的WA培养基倒入9cm直径的平板中，每平板倒入20mL。待冷却凝固后，用7mm直径的打孔器在平板的对称位置打3个孔，每孔分别加入25μL制备的无菌上清，以培养液和嘧霉胺为对照组。25℃静止培养后观察拮抗圈大小（从孔中心算起）。
[0057] （2）结果分析
[0058] 生防菌BS102无菌上清能抑制菌丝生长，抑制圈半径为4.0mm，3倍浓缩无菌上清的抑菌圈半径为6.0mm，见图3。
[0059] 3、生防菌BS102无菌上清抑制黄曲霉菌孢子萌发活性测定
[0060] （1）试验方法
[0061] 取实施例2的生防菌BS102菌株发酵液，10,000r/min，离心10min后取上清。上清经细菌滤器（0.22μm）过滤后待用。
[0062] 在上述无菌上清中加入果糖，使果糖终浓度至10mM，加入黄曲霉菌HZ17的孢子。对照组为含1%果糖的培养液。取置于果糖溶液中的孢子悬浮液10μl置于载玻片上，每处理5次重复。玻片置于保湿盒中，25℃静止培养，每隔1小时观察各处理组孢子萌发情况，计算萌发率。
[0063] （2）结果分析
[0064] 生防菌BS102无菌上清能推迟黄曲霉菌孢子的萌发（图4）。诱导萌发后，6和9小时分别统计各处理组的萌发率，结果显示当阴性对照组萌发率为100%时，BS102处理组孢子有67%萌发率。统计结果见表1。
[0065] 表1各处理组黄曲霉菌孢子萌发率
[0066]
[0067] 实施例4 生防菌光照培养箱防治花生黄曲霉毒素污染效果评价
[0068] （1）试验方法
[0069] 称70g花生于250ml三角瓶中，121℃，灭菌20分钟后，冷却，加入104CFU/ml的黄8
曲霉孢子，1ml；同时加入利用上述方法制备生防菌剂，生防菌10CFU/ml，2ml。25℃培养2周后，取10g花生米加入80%甲醇，15ml。振荡过夜，离心取上清。按照ELISA定量检测黄曲霉毒素B1试剂盒（北京百林康源生物技术有限责任公司）使用说明检测黄曲霉毒素。无拮抗作用的枯草芽孢杆菌PY79作为对照。每个处理测定3瓶花生。试验供试花生品种为鲁花9号。
曲霉孢子，1ml；同时加入利用上述方法制备生防菌剂，生防菌10CFU/ml，2ml。25℃培养2周后，取10g花生米加入80%甲醇，15ml。振荡过夜，离心取上清。按照ELISA定量检测黄曲霉毒素B1试剂盒（北京百林康源生物技术有限责任公司）使用说明检测黄曲霉毒素。无拮抗作用的枯草芽孢杆菌PY79作为对照。每个处理测定3瓶花生。试验供试花生品种为鲁花9号。
[0070] （2）结果分析
[0071] 表2各处理组光照培养箱防治花生黄曲霉毒素污染效果
[0072]
[0073] 在光照培养箱中进行BS102防治花生黄曲霉毒素污染试验结果表明，生防菌BS102能够显著抑制黄曲霉菌HZ17在花生上的生长和产毒（图5）。在鲁花9号上的防治效果为92.04%，而对照PY79仅为4.41%（表2）。
[0074] 实施例5 常温储存条件下生防菌防治花生黄曲霉毒素污染效果评价
[0075] （1）试验方法
[0076] 从黄曲霉发病严重的花生田采取样品，将样品混匀后平均分为9份（3斤），设8
BS102，PY79和清水3个处理，每个处理3份样品。利用上述方法制备生防菌剂，将10CFU/ml生防菌喷施在花生表面，水珠流动即可，过夜风干后，置于25℃存放2个月后，利用ELISA定量检测黄曲霉毒素B1试剂盒进行毒素含量测定。
BS102，PY79和清水3个处理，每个处理3份样品。利用上述方法制备生防菌剂，将10CFU/ml生防菌喷施在花生表面，水珠流动即可，过夜风干后，置于25℃存放2个月后，利用ELISA定量检测黄曲霉毒素B1试剂盒进行毒素含量测定。
[0077] （2）结果分析
[0078] 表3 BS102贮藏条件下防治花生黄曲霉毒素污染效果
[0079]
[0080] 如表3所示，在常温贮藏条件下，通过喷施生防菌BS102，可显著抑制黄曲霉在花生上的生长和毒素产生，对花生黄曲霉毒素污染平均防效可达71.97%左右，而对照PY79仅为7.32%。
[0081] 综上，本发明的菌株对黄曲霉菌丝生长、孢子萌发具有显著的抑制作用，且通过生物竞争来抑制黄曲霉的生长数量，进而控制黄曲霉毒素的污染。