I型胶原/透明质酸改性的钛涂层及其制备方法

摘要

一种I型胶原/透明质酸改性的钛涂层及其制备方法，所述I型胶原/透明质酸改性的钛涂层采用生物化学改性方法，将层-层技术和共价键固定方法相结合，在钛涂层表面以共价键固定有I型胶原/透明质酸复合层。与物理吸附的胶原/透明质酸复合层相比，本发明采用层-层技术构建了I型胶原/透明质酸复合层的同时，通过共价键固定方法赋予了复合层更稳定的结构，使制备的改性钛涂层具有更良好、更有效的生物学性能。本发明的制备方法工艺简单、效率高、可重复性好，为医用生物涂层技术提供新的方法。

权利要求

1.一种I型胶原/透明质酸改性的钛涂层，其特征在于，采用生物化学改性方法，将层-层技术和共价键固定方法相结合，在钛涂层表面以共价键固定有I型胶原/透明质酸复合层，所述生物化学改性方法包括碱处理、硅烷化处理、共价键固定I型胶原以及共价键固定透明质酸，其中，所述共价键固定I型胶原和共价键固定透明质酸交替循环进行，所述硅烷化处理采用5～10%的氨丙基三乙氧基硅烷为硅烷化剂，所述硅烷化处理采用甲苯为溶剂，加热回流反应6～12h。

2.一种权利要求1所述的钛涂层的制备方法，其特征在于，包括碱处理、硅烷化处理、共价键固定I型胶原以及共价键固定透明质酸，其中，所述共价键固定I型胶原和共价键固定透明质酸交替循环进行，所述硅烷化处理采用5～10%的氨丙基三乙氧基硅烷为硅烷化剂，所述硅烷化处理采用甲苯为溶剂，加热回流反应6～12h。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述共价键固定I型胶原包括将经硅烷化处理的钛涂层浸泡在I型胶原/乙酸溶液中并采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺为羧基活化剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺以使其在反应体系中的浓度分别为2~3.5mg/mL和

0.25~0.875mg/mL，所述共价键固定I型胶原的反应时间为0.25～1h。

5.根据权利要求2～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述共价键固定透明质酸包括将经硅烷化处理的钛涂层浸泡在透明质酸/乙酸溶液中并采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺为羧基活化剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺以使其在反应体系中的浓度分别为2~3.5mg/mL和

0.25~0.875mg/mL，所述共价键固定透明质酸的反应时间为0.25～1h。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，每次循环时间为0.5～2小时，循环次数为3～10次。

8.根据权利要求2～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述碱处理包括：将钛涂层浸入浓度为5~10M的NaOH溶液中在60~80℃下保温6~12h。

9.根据权利要求2～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，在所述硅烷化处理之前还包括去离子水陈化处理。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述去离子水陈化包括：将经碱处理的钛涂层在去离子水中40～80℃下保温3～7天。

说明书

I型胶原/透明质酸改性的钛涂层及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种I型胶原/透明质酸改性的钛涂层及其制备方法，具体涉及一种采用生物化学改性方法，将层-层技术和共价键固定方法相结合，在钛涂层表面以共价键固定有I型胶原/透明质酸复合层的改性钛涂层及其制备方法，属于医用生物涂层技术领域。

背景技术

[0002] 生物化学改性是近年来发展起来的一种生物材料表面改性方法，其方式是将生物活性分子（如细胞外基质成分、酶、多肽等）固定在生物材料表面，赋予材料良好的生物学性能。与传统的表面改性方法相比，经生物化学改性的骨植入材料，通过固定在其表面的生物活性分子与细胞直接作用，能发挥更好的生物功能。胶原、透明质酸及其它细胞外基质成分可应用于钛基骨替代材料的生物化学表面改性。

[0003] 细胞外基质成分较多，对细胞行为的影响是各种成分协同作用的结果。在骨植入材料表面制备两种甚至多种细胞外基质成分组成的复合层，可以获得更好的生物学性能。文献中报道最多的制备复合层的方法是层-层技术。Chen等（J.L.Chen,et al.Applied Surface Science.2009(255):6894-6900.）利用层-层技术在钛表面固定了胶原/肝素复合层，取得良好的效果。但该复合层是通过物理吸附方法制备的，稳定性较差。Huang等（Ying Huang,et al.Acta Biomateriatia.2012(8):866-877.）在此基础上，构建了具有半互穿网络结构的胶原/透明质酸/RGD复合层，在一定程度上提高了复合层的稳定性，但复合层仍是通过物理吸附固定在基材表面，在较短时间内会缓慢溶解。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种I型胶原/透明质酸改性的钛涂层及其制备方法。鉴于利用共价键固定方法能够在钛表面固定稳定的生物分子层，本发明在层-层技术的基础上，引入共价键固定方法，在钛涂层表面构建I型胶原/透明质酸类细胞外基质，以获得结构稳定、生物学性能优良的改性钛涂层。

[0005] 在此，本发明提供一种I型胶原/透明质酸改性的钛涂层，即采用生物化学改性方法，将层-层技术和共价键固定方法相结合，在钛涂层表面以共价键固定有I型胶原/透明质酸复合层的I型胶原/透明质酸改性的钛涂层。

[0006] 与物理吸附的胶原/透明质酸复合层相比，本发明采用层-层技术构建了I型胶原/透明质酸复合层的同时，通过共价键固定方法赋予了复合层更稳定的结构，使制备的改性钛涂层具有更良好、更有效的生物学性能。

[0007] 另一方面，本发明还提供所述钛涂层的制备方法，包括碱处理、硅烷化处理和共价键固定I型胶原以及共价键固定透明质酸。

[0008] 较佳地，所述碱处理包括：将钛涂层浸入浓度为5～10M的NaOH溶液中在60～80℃下保温6～12h。

[0009] 较佳地，所述硅烷化处理采用5～10%的氨丙基三乙氧基硅烷为硅烷化剂。

[0010] 所述硅烷化处理可以采用甲苯为溶剂，加热回流反应6～12h。

[0011] 较佳地，所述共价键固定I型胶原包括将经硅烷化处理的钛涂层浸泡在I型胶原/乙酸溶液中并采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺为羧基活化剂。

[0012] 更佳地，所述共价键固定I型胶原可以是在浓度为1mg/mL I型胶原/5mM乙酸溶液中，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺以使其在反应体系中的浓度分别为2～3.5mg/mL和0.25～0.875mg/mL。所述共价键固定I型胶原的反应时间优选为0.25～1h。

[0013] 又，较佳地，所述共价键固定透明质酸包括将经硅烷化处理的钛涂层浸泡在透明质酸/乙酸溶液中并采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺为羧基活化剂。

[0014] 更佳地，所述共价键固定透明质酸可以是在浓度为1mg/mL透明质酸/5mM乙酸溶液中，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺以使其在反应体系中的浓度分别为2～3.5mg/mL和0.25～0.875mg/mL。所述共价键固定透明质酸的反应时间优选为0.25～1h。

[0015] 优选地，所述共价键固定I型胶原和共价键固定透明质酸交替循环进行。

[0016] 所述交替循环过程优选为每次循环时间为0.5～2小时，循环次数为3～10次。

[0017] 较佳地，在所述硅烷化处理之前还包括去离子水陈化处理。

[0018] 所述去离子水陈化可以是将经碱处理的钛涂层在去离子水中40～80℃下保温3～7天。

[0019] 本发明工艺简单、效率高、可重复性好。本发明所提供的I型胶原/透明质酸改性的钛涂层，具有良好的稳定性和生物学性能，解决了现有技术中所存在的问题，可改善钛涂层的临床效果，为医用生物涂层技术提供新的方法。

附图说明

[0020] 图1是改性钛涂层的表面形貌：(a)碱处理的钛涂层(TC-A)；(b)利用简单层-层技术在其表面构建I型胶原/透明质酸（C/H）层的钛涂层(TC-A(C/H)6)；(c)结合层-层技术和共价键固定方法在其表面构建C/H层的钛涂层(TC-AA(C/H)6)；放大1000倍；

[0021] 图2是改性钛涂层的红外光谱；

[0022] 图3是I型胶原的固定效果分析：(a)固定胶原量测定；(b)胶原的固定稳定性分析；

[0023] 图4是共价键固定I型胶原/透明质酸钛涂层的生物学性能实验：(a)hMSCs的细胞粘附实验；(b)hMSCs的细胞增殖实验；(c)hMSCs细胞分化的碱性磷酸酶活性检测实验。

具体实施方式

[0024] 以下结合附图及下述具体实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式和/或附图仅用于说明本发明，而非限制本发明。

[0025] 本发明采用层-层技术和共价键接枝方法，将I型胶原和透明质酸固定在等离子体喷涂钛涂层表面，从而获得具有良好生物学性能的I型胶原/透明质酸改性的钛涂层。作为示例，其具体工艺如下。

[0026] （1）钛涂层的制备：利用等离子体喷涂技术制备钛涂层。

[0027] （2）碱处理：将所述钛涂层浸入浓度为5～10M的NaOH溶液中在60～80℃下保温6～12h，取出后可用去离子水超声清洗，超声清洗可以持续约5分钟。这里采用5～10M的NaOH作为碱处理的碱液，但应理解其他合适的碱液也是适用的，例如氢氧化钾。

[0028] （3）去离子水陈化：将所述碱处理钛涂层在去离子水中40～80℃下保温3～7天。可以每天换一次水，最后40℃下干燥。

[0029] （4）硅烷化：将干燥钛涂层浸泡在浓度为5～10%的氨丙基三乙氧基硅烷（APS）/甲苯溶液中，溶液加热至沸腾，冷凝回流，反应6～12h，冷却后，分别用酒精、去离子水超声清洗1-2次，真空干燥。这里采用5～10%的氨丙基三乙氧基硅烷（APS）为硅烷化剂，采用甲苯作为溶剂，但应理解其他合适的硅烷化剂、溶剂也是适用。

[0030] （5）共价键固定I型胶原/透明质酸：将所述硅烷化钛涂层浸泡在I型胶原/乙酸溶液（例如浓度为1mg/mL I型胶原/5mM乙酸溶液）中，滴加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）水溶液（例如120mg/mL）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）水溶液（例如30mg/mL），使得EDC最终浓度为2～3.5mg/mL，NHS最终浓度为0.25～0.875mg/mL，反应0.25～1h后取出，去离子水冲洗；然后再浸泡在透明质酸/乙酸溶液（例如浓度为1mg/mL透明质酸/5mM乙酸溶液）中。滴加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）水溶液（例如
120mg/mL）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）水溶液（例如30mg/mL），使得EDC最终浓度为2～
3.5mg/mL，NHS最终浓度为0.25～0.875mg/mL，反应0.25～1h后取出，去离子水冲洗。

[0031] （6）层-层固定：将上述共价键固定I型胶原/透明质酸过程交替循环进行多次，例如3～10次，每次反应时间优选为0.25～1小时，每次循环时间优选为0.5～2小时，最后去离子水清洗并真空干燥。

[0032] 下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的试剂的量和浓度、反应时间和温度也仅是合适范围中的一个示例，即、本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

[0033] 实施例1

[0034] [基于表面构建I型胶原/透明质酸(C/H)类细胞外基质的改性钛涂层的制备][0035] 利用等离子体喷涂技术制备钛涂层(标记为TC)，所制备的钛涂层浸入5M NaOH溶液中，在80℃下保温12h，用去离子水超声清洗后，在去离子水中60℃下陈化7天，每天换一次水，40℃下干燥。碱处理改性钛涂层标记为TC-A。将干燥的样品TC-A浸泡在浓度为10%的APS/甲苯溶液中，溶液加热至沸腾，冷凝回流，反应12h。冷却后用酒精超声清洗1次，去离子水超声清洗2次，每次5分钟，真空干燥。硅烷化的钛涂层标记为TC-AA。将样品TC-AA浸泡在浓度为1mg/mL I型胶原/5mM乙酸溶液中。每38mL胶原溶液中滴入120mg/mL EDC水溶液和30mg/mL NHS水溶液各1mL，使得EDC最终溶度为3mg/mL，NHS最终溶度为0.75mg/mL。反应0.5后取出，去离子水冲洗。然后浸泡在浓度为1mg/mL透明质酸/5mM乙酸溶液中。滴加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）水溶液（120mg/mL）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）水溶液（30mg/mL），使得EDC最终溶度为3mg/mL，NHS最终溶度为
0.75mg/mL。反应0.5h后取出，去离子水冲洗。再浸泡在含有EDC/NHS的I型胶原溶液中，如此循环6次。去离子水清洗后，真空干燥。样品标记为TC-AA(C/H)6。

[0036] 对比例1

[0037] [采用简单层-层技术制备I型胶原/透明质酸复合层]

[0038] 将样品TC-A浸泡在1mg/mL I型胶原/5mM乙酸溶液中，0.5h后取出，去离子冲洗，然后浸泡在浓度为1mg/mL透明质酸/5mM乙酸溶液中，0.5h后取出，再浸泡在胶原溶液中，如此循环6次，真空干燥，样品标记为TC-A(C/H)6。

[0039] 图1为改性钛涂层的表面形貌。从图中可以看出，TC-A(C/H)6和与TC-AA(C/H)6表面都形成了一层生物大分子薄膜。

[0040] 图2为改性钛涂层的红外光谱。图中Si-O-Si和氨基特征峰的变化进一步揭示了钛涂层表面构建了C/H复合层。

[0041] [I型胶原/透明质酸改性钛涂层的胶原固定效果实验]

[0042] 利用天狼猩红染色法，从定量和固定稳定性两方面来考察胶原固定效果：将样品TC-A(C/H)6和TC-AA(C/H)6浸泡在浓度为1mg/mL的天狼猩红-饱和苦味酸溶液中，2小时后取出，去离子水冲洗，真空干燥。用0.1M的NaOH溶液将染料洗脱下来，然后用紫外分光光度计测定染料-NaOH溶液在540nm下的吸光度值，与吸光度值-胶原量标准曲线对照，得出固定胶原的量。将样品TC-A(C/H)6和TC-AA(C/H)6各4个浸泡在tris-HCl溶液中，37度下分别孵育1、3、5、7天。用天狼猩红染色法测量样品表面剩余胶原量。

[0043] 图3所示是I型胶原的固定效果分析。从图3(a)中可以看出：两种方式固定的I2
型胶原量都在600μg/cm以上，并且两者相差不大。在图3(b)中，TC-A(C/H)6的胶原在6天内就脱附殆尽，而TC-AA(C/H)6的胶原10天后仍保留有86%以上，表明TC-AA(C/H)6固定的胶原稳定性更好。

[0044] [I型胶原/透明质酸改性钛涂层的生物学性能实验]

[0045] 用人骨髓间充质干细胞(hMSCs)来考察共价键固定I型胶原钛涂层的生物学性能：用MTT法考察hMSCs在材料表面的粘附和增殖行为；用BCA法对hMSCs的碱性磷酸酶(ALP)的活性进行定量测定。

[0046] 图4为I型胶原/透明质酸改性钛涂层的生物学性能实验。从图中可以看出：与TC相比，表面构建了C/H类细胞外基质的改性钛涂层，能够促进hMSCs的粘附(图4(a))、增殖(图4(b))和碱性磷酸酶的活性表达(图4(c))，具有更好的生物学性能。而与TC-A(C/H)6相比，TC-AA(C/H)6的促进效果更好。结果表明：利用层-层技术和共价键固定方法，在钛涂层表面构建结构稳定的C/H复合层，能够更好地提高钛涂层的生物学性能。

[0047] 产业应用性：本发明通过层-层技术和共价键接枝方式，将I型胶原和透明质酸固定在钛涂层表面，获得一种I型胶原/透明质酸改性的钛涂层，具有良好稳定性和生物学性能，在医学生物涂层技术领域有广阔的应用前景。