一种倍半萜类化合物及其制备方法和用途转让专利
申请号 : CN201410030059.5
文献号 : CN103788109B
文献日 : 2015-12-30
发明人 : 李占林 , 华会明 , 王文静 , 李丹毅
申请人 : 沈阳药科大学
摘要 :
本发明属于医药技术领域，涉及从一株刺囊壳属真菌（Ascotricha sp.）中分离得到的两个具有抗肿瘤活性的石竹烯型倍半萜类化合物及其制备方法，其结构如下。本发明所涉及的化合物结构新颖，具有显著的体外抗肿瘤活性，并且能够通过液体发酵和简便的提取分离方法很容易地大量获取，可以成为开发新型抗白血病药物的活性先导化合物。 其中R为H或CH3。
权利要求 :
1.具有如下结构的倍半萜类化合物：
I
其中R为H或CH3。
2.一种制备如权利要求1所述倍半萜类化合物的方法，其特征在于，挑取刺囊壳属真菌Ascotricha sp. ZJ-M-5的孢子，直接接种到液体培养基中摇床培养4~10天，其中培养基由蒸馏水配制，包含蔗糖 2~4%，NaNO3 0.2~0.4%，KCl 0.03~0.07%，FeSO4·7H2O
0.0005~0.0015%，K2HPO4 0.05~0.15%，培养温度为25~37 °C，摇床转速160~200转/分钟，发酵液经过滤除去菌丝体后，滤液采用等体积正丁醇萃取3次，将正丁醇萃取物经1~20倍量200~300目硅胶柱色谱分离，以体积配比为5：1-1：1的石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱，其中体积配比为3：1的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱部分，经重结晶得到R为CH3的式I化合物，体积配比为1：1的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱部分，经重结晶得到R为H的式I化合物，所述刺囊壳属真菌的保藏号为CGMCC No. 8278。
3.一种药物组合物，包含权利要求1所述的化合物。
4.权利要求1所述的化合物或权利要求3所述的组合物在制备抗白血病药物中的应用。
说明书 :
一种倍半萜类化合物及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及从一株刺囊壳属（Ascotricha sp.ZJ-M-5）真菌发酵产物中分离得到的具有抗肿瘤作用的石竹烯型新倍半萜类化合物及其制备方法。
背景技术
[0002] 微生物能够产生结构新颖并具有抗肿瘤、抗感染等多样生物活性的次级代谢产物，因此从微生物中寻找药物先导化合物一直是创新药物研究的热点。传统的微生物培养采用提供丰富营养物质促进其生产的方式，然而在此条件下，大多数微生物的合成次级代谢产物的基因处于沉默状态，导致产生的次级代谢产物数量较少，含量较低，并且往往产生很多诸如脂肪酸、环二肽等非活性物质干扰提取分离。有鉴于此，Axel Zeeck等人提出OSMAC（one strain many compounds，单菌多物）策略（ChemBioChem，2002，3：619-627），即通过改变培养基成分、培养条件及添加酶抑制剂等方法，激活在传统培养条件下微生物次级代谢的“沉默途径”，从而获取结构更为新颖、活性更为多样和产量更为丰富的微生物来源活性天然产物。
[0003] 刺囊壳属真菌（Ascotricha sp.ZJ-M-5）是通过化学和生物活性筛选，从浙江奉化市莼湖镇桐照村黄滩涂地的海泥样品中分离得到的一株能够产生抗肿瘤化合物的微生物。发明人前期工作中，从该菌株含有丰富营养物质的培养基发酵产物中获得了环橙花二醇类衍生物（Natural Product Research，2013，27：847-850）和一个C3，4位裂环的羊毛脂烷型三萜类化合物（药学学报，2013，48：89-93）。然而，采用OSMAC策略，通过改变培养基组成，发现该菌株在寡营养条件下的次级代谢与在含有丰富营养物质培养基条件下的次级代谢存在显著的差异。从其中得到了两个存在五元环状半缩醛结构的新的石竹烯型倍半萜类化合物。
[0004] 含有式I骨架的天然倍半萜类化合物目前仅有从太平洋红豆杉内生真菌Pestalotiopsis sp.中 分 离 得 到 的（+）-pestalotiopsin A（Journal of Organic Chemistry，1996，61：2122-2124）和（+）-pestalotiopsin C（Phytochemistry，1997，46：
313-319）两个，并且仅有（+）-pestalotiopsin A对小鼠淋巴细胞白血病P388细胞株具有细胞毒作用，IC50值为3.82μM（Journal of Organic Chemistry，2009，74，6452-6461）。
但是（+）-pestalotiopsin A和（+）-pestalotiopsin C在Pestalotiopsis sp.中产率较低，分别为1.2mg/L和1.0mg/L，且发酵需要在避光条件下，低温（25℃）培养21～46天，并且其产生也具有很大的偶然性和不稳定性（Phytochemistry，1997，46：313-319），不适宜工业化生产制备。
313-319）两个，并且仅有（+）-pestalotiopsin A对小鼠淋巴细胞白血病P388细胞株具有细胞毒作用，IC50值为3.82μM（Journal of Organic Chemistry，2009，74，6452-6461）。
但是（+）-pestalotiopsin A和（+）-pestalotiopsin C在Pestalotiopsis sp.中产率较低，分别为1.2mg/L和1.0mg/L，且发酵需要在避光条件下，低温（25℃）培养21～46天，并且其产生也具有很大的偶然性和不稳定性（Phytochemistry，1997，46：313-319），不适宜工业化生产制备。
发明内容
[0005] 本发明提供一种从刺囊壳属真菌Ascotricha sp.ZJ-M-5中分离的C-6位为羟基取代的具有五元环状半缩醛结构的新石竹烯型倍半萜类化合物。
[0006] 本发明所述化合物的结构如式I所示，其与（+）-pestalotiopsin A及（+）-pestalotiopsin C结构上的差异在于C-6位为羟基而非甲氧基取代：
[0007]
[0008] 其中R为H或CH3。
[0009] 本发明的制备技术方案包括如下步骤：
[0010] 挑取刺囊壳属真菌（Ascotricha sp.ZJ-M-5，保藏号为CGMCC No.8278）的孢子，直接接种到液体培养基中摇床培养4～10天，其中培养基由蒸馏水配制，包含蔗糖2～4%，NaNO30.2～0.4%，KCl0.03～0.07%，FeSO4·7H2O0.0005～0.0015%，K2HPO40.05～0.15%，培养温度为25～37℃，摇床转速160～200转/分钟，发酵液经过滤除去菌丝体后，滤液采用等体积正丁醇萃取3次，将正丁醇萃取物经1～20倍量200～300目硅胶柱色谱分离，以体积配比（5：1-1：1）的石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱，其中体积配比为3：1的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱部分，经重结晶得到R为CH3的式I化合物，收率为5mg/L，体积配比为1：1的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱部分，经重结晶得到R为H的式I化合物，收率为15mg/L。
[0011] 所得化合物经过系统结构鉴定结果如下：主要利用包括高分辨质谱、核磁共振谱1 13
（HNMR，C NMR，2D-NMR）。
（HNMR，C NMR，2D-NMR）。
[0012] R为H的式I化合物为无色针状结晶，[α]20D+103.4（c1.0,CH3OH），易溶于甲醇。
[0013] HRESIMS（图1）给出准分子离子峰m/z：349.1607[M+Na]+，确定化合物分子式为C17H26O6。
[0014] 1H NMR（400MHz，pyridine-d5）谱（图2）中高场区给出两个连在sp3杂化碳上的甲2
基质子信号：δ1.14（3H，s）、1.55（3H，s），两个连在sp杂化碳上的甲基质子信号：δ1.90（3H，s）、2.02（3H，s），一个烯氢质子信号：δ5.88（1H，d，J=11.5Hz），三个连氧碳上的质子信号：δ5.57（1H，dd，J=10.4，5.7Hz），4.91（1H，dd，J=11.5，5.8Hz），4.75（1H，dd，J=5.8，
13
2.2Hz）。 C NMR（150MHz，pyridine-d5）谱（图3）中共给出17个碳信号，其中δ170.3和
21.3处的两个碳信号，结合氢谱中δ2.02处的甲基信号，提示结构中存在一个乙酰基，由剩余的15个碳信号包括推测一组C=C双键信号：δ132.1和129.4，一个半缩醛碳信号：
δ109.6，四个连氧碳信号：δ97.3，80.7，74.7和74.2，推测该化合物为一个倍半萜类化合物。将该化合物NMR数据与文献中报道的石竹烯型倍半萜化合物（+）-pestalotiopsin A的数据比较发现，该化合物比（+）-pestalotiopsin A结构中少一个甲氧基的取代。进一步通过HMBC谱，发现δ4.91处的6位质子信号与δ132.1处的4位烯碳信号存在远程相关，而δ4.75处的7位质子信号与δ109.6处的14位半缩醛碳信号有远程相关，同时δ5.57处的2位质子信号与δ170.3处的羰基碳信号存在远程相关，因此确定乙酰基连接在2位，而C-6和C-7位均为羟基取代。利用NOESY谱（图6）确定了该化合物的相对构型，其中δ5.57处的2位质子信号与12位甲基质子信号、15位甲基质子信号、6位质子信号和9位质子信号之间存在NOE相关，从而确定以上质子取向在环的一侧，而8位质子和13位甲基质子信号之间，7位质子信号和5位质子信号之间存在NOE相关，从而确定这些质子取向在环的另一侧，进而观察发现14位半缩醛结构中的质子信号与5位质子和7位质子信号存在NOE相关，从而确定半缩醛羟基朝向结构中四元环的方向，而氢朝向9元环的方向。由于结构中6，7位存在邻二醇羟基，因此该化合物的绝对构型可以用文献（有机化学，2010，30：1270-1278）报道的方法，利用过渡金属试剂Mo2(OAc)4通过测定诱导圆二色谱（ICD）来确定。通过测定该合物与Mo2(OAc)4混合后的ICD图谱（图7），发现在310nm处显示负的Cotton效应，从而确定6、7位绝对构型均为R，并进一步可以确定结构中其他手性中心的绝对构型，从而确定
1 13
该化合物结构如式I所示，其中R为H。并将该化合物的 H NMR、C NMR信号通过HSQC（图
4）和HMBC谱（图5）进行归属（表1）。
基质子信号：δ1.14（3H，s）、1.55（3H，s），两个连在sp杂化碳上的甲基质子信号：δ1.90（3H，s）、2.02（3H，s），一个烯氢质子信号：δ5.88（1H，d，J=11.5Hz），三个连氧碳上的质子信号：δ5.57（1H，dd，J=10.4，5.7Hz），4.91（1H，dd，J=11.5，5.8Hz），4.75（1H，dd，J=5.8，
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2.2Hz）。 C NMR（150MHz，pyridine-d5）谱（图3）中共给出17个碳信号，其中δ170.3和
21.3处的两个碳信号，结合氢谱中δ2.02处的甲基信号，提示结构中存在一个乙酰基，由剩余的15个碳信号包括推测一组C=C双键信号：δ132.1和129.4，一个半缩醛碳信号：
δ109.6，四个连氧碳信号：δ97.3，80.7，74.7和74.2，推测该化合物为一个倍半萜类化合物。将该化合物NMR数据与文献中报道的石竹烯型倍半萜化合物（+）-pestalotiopsin A的数据比较发现，该化合物比（+）-pestalotiopsin A结构中少一个甲氧基的取代。进一步通过HMBC谱，发现δ4.91处的6位质子信号与δ132.1处的4位烯碳信号存在远程相关，而δ4.75处的7位质子信号与δ109.6处的14位半缩醛碳信号有远程相关，同时δ5.57处的2位质子信号与δ170.3处的羰基碳信号存在远程相关，因此确定乙酰基连接在2位，而C-6和C-7位均为羟基取代。利用NOESY谱（图6）确定了该化合物的相对构型，其中δ5.57处的2位质子信号与12位甲基质子信号、15位甲基质子信号、6位质子信号和9位质子信号之间存在NOE相关，从而确定以上质子取向在环的一侧，而8位质子和13位甲基质子信号之间，7位质子信号和5位质子信号之间存在NOE相关，从而确定这些质子取向在环的另一侧，进而观察发现14位半缩醛结构中的质子信号与5位质子和7位质子信号存在NOE相关，从而确定半缩醛羟基朝向结构中四元环的方向，而氢朝向9元环的方向。由于结构中6，7位存在邻二醇羟基，因此该化合物的绝对构型可以用文献（有机化学，2010，30：1270-1278）报道的方法，利用过渡金属试剂Mo2(OAc)4通过测定诱导圆二色谱（ICD）来确定。通过测定该合物与Mo2(OAc)4混合后的ICD图谱（图7），发现在310nm处显示负的Cotton效应，从而确定6、7位绝对构型均为R，并进一步可以确定结构中其他手性中心的绝对构型，从而确定
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该化合物结构如式I所示，其中R为H。并将该化合物的 H NMR、C NMR信号通过HSQC（图
4）和HMBC谱（图5）进行归属（表1）。
[0015]
[0016] 表1R为H的式I化合物1H NMR和13C NMR的化学位移值（溶剂为pyridine-d5）[0017]
[0018]
[0019] R为CH3的式I化合物为无色针状结晶，[α]20D+91.5（c0.1,CH3OH），易溶于甲醇。
[0020] HRESIMS（图8）给出准分子离子峰m/z：363.1796[M+Na]+，确定化合物分子式为C18H28O6。
[0021] 将该化合物的1H NMR（600MHz，pyridine-d5）谱（图9）与R为H的式I化合物比较发现，在δ3.56处多处一个甲氧基质子信号，同时7位质子信号由δ4.75向高场位移至13
δ4.08，而其他位置质子信号差异不大。 C NMR（100MHz，pyridine-d5）谱（图10）与R为H的式I化合物比较，在δ57.5处多出一个甲氧基碳信号，7位碳信号向低场位移10.1个化学位移单位，而6、8位碳信号分别向高场位移2.1和4.7个化学位移单位，这一变化基本符合醇羟基甲醚化位移规律，推测该化合物7位为甲氧基取代。通过HSQC谱（图11）归属
1 13
了该化合物的 H NMR、C NMR信号（表2）。进一步观察HMBC谱（图12）中，δ3.56处的甲氧基质子信号与δ90.8处的7位碳信号存在远程相关，从而确定甲氧基取代在7位。该化合物的相对构型通过NOESY谱（图13）进行确定，其中δ5.55处的2位质子信号与12位甲基质子信号、15位甲基质子信号、6位质子信号和9位质子信号之间存在NOE相关，从而确定以上质子取向在环的一侧，而7位质子信号和5位质子信号之间存在NOE相关，从而确定这些质子取向在环的另一侧，进而观察发现14位半缩醛结构中的质子信号与5位质子和7位质子信号存在NOE相关，从而确定半缩醛羟基朝向结构中四元环的方向，而氢朝向9元环的方向。有鉴于该化合物与R为H的式I化合物均来自同一真菌菌株相同培养条件下的发酵产物，并且二者具有相同的相对构型和旋光方向，可以确定该化合物各手性中心的绝对构型与R为H的式I化合物相同。
δ4.08，而其他位置质子信号差异不大。 C NMR（100MHz，pyridine-d5）谱（图10）与R为H的式I化合物比较，在δ57.5处多出一个甲氧基碳信号，7位碳信号向低场位移10.1个化学位移单位，而6、8位碳信号分别向高场位移2.1和4.7个化学位移单位，这一变化基本符合醇羟基甲醚化位移规律，推测该化合物7位为甲氧基取代。通过HSQC谱（图11）归属
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了该化合物的 H NMR、C NMR信号（表2）。进一步观察HMBC谱（图12）中，δ3.56处的甲氧基质子信号与δ90.8处的7位碳信号存在远程相关，从而确定甲氧基取代在7位。该化合物的相对构型通过NOESY谱（图13）进行确定，其中δ5.55处的2位质子信号与12位甲基质子信号、15位甲基质子信号、6位质子信号和9位质子信号之间存在NOE相关，从而确定以上质子取向在环的一侧，而7位质子信号和5位质子信号之间存在NOE相关，从而确定这些质子取向在环的另一侧，进而观察发现14位半缩醛结构中的质子信号与5位质子和7位质子信号存在NOE相关，从而确定半缩醛羟基朝向结构中四元环的方向，而氢朝向9元环的方向。有鉴于该化合物与R为H的式I化合物均来自同一真菌菌株相同培养条件下的发酵产物，并且二者具有相同的相对构型和旋光方向，可以确定该化合物各手性中心的绝对构型与R为H的式I化合物相同。
[0022] 表2R为CH3的式I化合物 1H NMR和13C NMR的化学位移值（溶剂为pyridine-d5）[0023]
[0024]
[0025] 对所得到的R为H和R为CH3的式I化合物进行肿瘤细胞生长抑制方面的研究。体外实验结果表明R为H和R为CH3的式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病HL-60细胞株、人白血病K562细胞株和小鼠淋巴细胞白血病P388细胞株具有生长抑制作用，且作用强度均高于阳性对照药顺铂或与其作用强度相当，因此，本发明所述的新倍半萜化合物具有制备临床白血病预防和治疗药物的前景。
[0026] 本发明涉及的C-6位为羟基取代的式I化合物，迄今在国内外尚未见有与此雷同的化合物及活性的相关专利或文献报道，并且获得式I化合物所采用的微生物发酵培养基成分简单，培养周期仅为4～10天，收率较大，分别为15mg/L和5mg/L，同时化合物的产生稳定可重复。进一步通过体外抗肿瘤活性测试发现，R取代基为H和CH3的式I化合物对人急性早幼粒白血病HL-60细胞株、人白血病K562细胞株和小鼠淋巴细胞白血病P388细胞株表现出显著的生长抑制作用。
[0027] 本发明的优点在于，所得到的化合物结构新颖，且具有抑制肿瘤细胞生长的活性，其发酵培养基组成简单，提取分离方法简易，发酵产量高，发酵工艺稳定可重复，便于对其进行进一步的药理和临床研究，为开发疗效好且毒副作用小的新型抗白血病药物创造条件。
[0028] 本发明所用的菌种ZJ-M-5由中国科学院微生物研究所鉴定为刺囊壳属真菌Ascotrichasp.，检验鉴定报告编号：（2011）微检字第227号，并于2013年9月27日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.8278。附图说明：
[0029] 图1：R为H的式I化合物的高分辨ESIMS谱；
[0030] 图2：R为H的式I化合物的1H NMR谱；
[0031] 图3：R为H的式I化合物的13C NMR谱；
[0032] 图4：R为H的式I化合物的HSQC谱；
[0033] 图5：R为H的式I化合物的HMBC谱；
[0034] 图6：R为H的式I化合物的NOESY谱；
[0035] 图7：R为H的式I化合物的ICD谱；
[0036] 图8：R为CH3的式I化合物的高分辨ESIMS谱；
[0037] 图9：R为CH3的式I化合物的 1H NMR谱；
[0038] 图10：R为CH3的式I化合物的 13C NMR谱；
[0039] 图11：R为CH3的式I化合物的HSQC谱；
[0040] 图12：R为CH3的式I化合物的HMBC谱；
[0041] 图13：R为CH3的式I化合物的NOESY谱。具体实施方式：
[0042] 下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0043] 实施例1：R为H和R为CH3的式I化合物的制备：
[0044] 挑取刺囊壳属真菌（Ascotricha sp.ZJ-M-5，保藏号为CGMCC No.8278）的孢子，直接接种到液体培养基中摇床培养7天，其中培养基由蒸馏水配制，含有蔗糖3%，NaNO30.3%，KCl0.05%，FeSO4·7H2O0.001%，K2HPO40.1%，培养温度为28℃，摇床转速180转/分钟，发酵液经过滤除去菌丝体后，滤液采用等体积正丁醇萃取3次，将正丁醇萃取物经2倍量200～300目硅胶柱色谱分离，以体积配比（5：1-1：1）的石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱，其中体积配比为3：1的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱部分，经重结晶得到R为CH3的式I化合物，收率为5mg/L，体积配比为1：1的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱部分，经重结晶得到R为H的式I化合物，收率为15mg/L。
[0045] 实施例2：式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病HL-60细胞株、人白血病K562细胞株和小鼠淋巴细胞白血病P388细胞株的生长抑制实验：
[0046] HL-60，K562或P388细胞培养于含有10%经加热灭活的胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素及1mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI1640培养液中，置37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中孵育，待细胞70%-80%融合使用。称取台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水稀释到4%的储存浓度，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，将该储存液用PBS稀释至0.4%工4
作浓度。取HL-60，K562或P388细胞以3×10个/mL密度，每孔1mL接种于24孔板中后，随即加入不同浓度药物（终浓度为0.1、0.5、1、3、10、30、100μM），对照组加入等容积DMSO。
孵育72小时后制备单个细胞悬液，取50μL细胞悬液加入50μL的0.4%台盼蓝溶液，混匀，在3分钟内，于显微镜下观察，用血球计数板分别计数各组活细胞和死细胞（死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染）。利用下列公式求得细胞生长抑制率并计算IG50，结果如表3所示。
作浓度。取HL-60，K562或P388细胞以3×10个/mL密度，每孔1mL接种于24孔板中后，随即加入不同浓度药物（终浓度为0.1、0.5、1、3、10、30、100μM），对照组加入等容积DMSO。
孵育72小时后制备单个细胞悬液，取50μL细胞悬液加入50μL的0.4%台盼蓝溶液，混匀，在3分钟内，于显微镜下观察，用血球计数板分别计数各组活细胞和死细胞（死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染）。利用下列公式求得细胞生长抑制率并计算IG50，结果如表3所示。
[0047] 抑制率=[1–(加药孔细胞数/对照孔细胞数)]×100%
[0048] 表3式I化合物在体外对HL-60，K562和P388细胞的生长抑制作用[IG50±SE(μM),n=6]
[0049]Compounds HL-60 K562 P388
R为H的式I化合物 6.9±0.4 10.1±0.9 1.7±0.3
R为CH3的式I化合物 8.5＝0.7 12.3±1.1 3.1±0.4
顺铂 13.4±1.9 19.1±2.3 0.5±0.1
R为H的式I化合物 6.9±0.4 10.1±0.9 1.7±0.3
R为CH3的式I化合物 8.5＝0.7 12.3±1.1 3.1±0.4
顺铂 13.4±1.9 19.1±2.3 0.5±0.1
[0050] 体外实验结果表明式R为H和R为CH3的式I化合物在体外具有对人急性早幼粒白血病HL-60细胞株和人白血病K562细胞株的生长抑制作用，其IG50为6.9～12.3μM，作用强于阳性对照药顺铂。R为H和R为CH3的式I化合物对小鼠淋巴细胞白血病P388细胞株的生长抑制作用弱于阳性对照药顺铂，但均强于（+）-pestalotiopsin A（3.82μM），提示（+）-pestalotiopsin A结构中6位甲氧基改变为羟基取代，即成为式I化合物后，其对白血病细胞株表现出更强的生长抑制作用，同时，由表3结果可以看出，式I结构中7位由甲氧基改变为羟基取代后，对白血病细胞株的生长抑制作用也有所增强。因此，式I化合物与6位均为甲氧基取代的（+）-pestalotiopsin A及（+）-pestalotiopsin C相比，更具有开发成为抗白血病药物的前景。