植物开花相关蛋白GmSOC1-like及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种植物开花相关蛋白GmSOC1-like及其编码基因与应用。实验证明，将含有序列表序列2中第277位至第912位所示DNA分子的重组表达载体pGFPGUS-GmSOC1-like转化百脉根得到的阳性转基因植株，在长日条件下（16小时光照/8小时黑暗）与转空载体对照植株和野生型百脉根相比开花提前32天。本发明在定向调节植物的光周期方面具有重要意义。

权利要求

1.序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质在调控目的植物的开花期性状中的应用；所述植物为百脉根Lotus corniculatus L.或大豆Glycine max(L.)Merrill。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表序列2中第277位至第912位所示的DNA分子；

2)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子。

3.一种使目的植物开花提前的方法，包括使序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在所述目的植物中表达的步骤；所述植物为百脉根Lotus corniculatus L.或大豆Glycine max(L.)Merrill。

4.一种培育开花提前的转基因植物的方法，包括将序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因导入目的植物，得到表达所述基因的转基因植物；所述植物为百脉根Lotus corniculatus L.或大豆Glycine max(L.)Merrill。

5.根据权利要求3和4所述的方法，其特征在于：所述序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因为如下1)或2)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表序列2中第277位至第912位所示的DNA分子；

2)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子。

说明书

植物开花相关蛋白GmSOC1-like及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种植物开花相关蛋白GmSOC1-like及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 大豆是光周期反应敏感的短日照作物，单个品种的适应范围较为狭窄。长期以来，培育对光周期相对钝感的广适应大豆品种一直是大豆育种的重要目标。常规育种是大豆品种改良的主要方法，通过杂交和株系选择等培育出适合不同地区种植的大豆品种，但在光周期反应敏感性改良方面进展较为缓慢，目前，迫切需要采用分子育种手段，通过外源基因的引入或对内在基因的遗传操作，定向调节大豆品种的光周期反应敏感性，加快广适应大豆品种的选育进程。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种植物开花相关蛋白GmSOC1-like及其编码基因与应用。

[0004] 本发明所提供的植物开花相关蛋白来源于大豆（Glycine max（L.）Merrill），名称为GmSOC1-like，该蛋白质是如下a）或b）的蛋白质：

[0005] a）由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0006] b）将序列表序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花相关的由（a）衍生的蛋白质。

[0007] 序列表序列1所示的氨基酸序列由211个氨基酸残基组成。

[0008] 为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0009] 表1标签的序列

[0010]

[0011] 上述（b）中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白的编码基因可通过将序列表序列2的第277位至第912位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0012] 编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。

[0013] 编码所述蛋白质的基因为如下1）或2）或3）或4）的基因：

[0014] 1）其核苷酸序列是序列表序列2中第277位至第912位所示的DNA分子；

[0015] 2）其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子；

[0016] 3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；

[0017] 4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。

[0018] 序列表序列2由1081个脱氧核苷酸组成，是大豆蛋白GmSOC1-like的全长cDNA序列，其中第277位至第912位为开放阅读框，编码序列表序列1所示的蛋白。

[0019] 所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；
还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，
0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在
65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

[0020] 含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。

[0021] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa 或 pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子（如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin））、组成型启动子或组织特异表达启动子（如种子特异表达的启动子），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

[0022] 含有所述基因的重组载体为将所述基因插入载体pGFPGUSplus得到表达所述蛋白的重组表达载体；具体为将序列表序列2中第277位至第912位所示的DNA分子插入载体pGFPGUSplus的xbal I和sac I酶切识别位点之间得到的重组表达载体。

[0023] 本发明保护所述蛋白和所述基因在调控目的植物的开花期性状中的应用，或调控后所述蛋白或所述基因表达量的物质或方法可用于调控目的植物开花期性状。

[0024] 本发明还提供一种使目的植物开花提前的方法，包括使所述基因在所述目的植物中表达的步骤。

[0025] 本发明还提供一种培育开花提前的转基因植物的方法，包括将所述基因导入目的植物，得到表达所述基因的转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比开花提前；该方法中还可包括将所述转基因植物与其它植物杂交获得含有所述基因的杂交后代的步骤；所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

[0026] 在上述方法中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为百脉根（Lotus corniculatus L.）或大豆（Glycine max（L.）Merrill）。

[0027] 实验证明，将含有序列表序列2中第277位至第912位所示DNA分子的重组表达载体pGFPGUS-GmSOC1-like转化百脉根得到的阳性转基因植株，在长日条件下（16小时光照/8小时黑暗）与转空载体对照植株和野生型百脉根相比开花提前32天。本发明在定向调节植物的光周期方面具有重要意义。

附图说明

[0028] 图1为GmSOC1-like基因的PCR扩增电泳图。其中，泳道M为分子量标准；泳道1和2为目的基因GmSOC1-like的扩增条带。

[0029] 图2为荧光实时定量PCR检测短日照条件下生长的大豆在不同时间不同部位GmSOC1-like基因的相对表达量。其中，7、13、19、23、27表示大豆萌发后继续生长的天数，F表示花，P表示荚。

[0030] 图3为荧光实时定量PCR检测大豆在不同日照条件下生长时一天内GmSOC1-like基因的相对表达量变化。其中，图A为短日照，图B为长日照。

[0031] 图4为荧光实时定量PCR检测大豆经日照转换后基因GmSOC1-like和GmFT2a的相对表达量变化。其中，图A为基因GmFT2a，图B为基因GmSOC1-like。

[0032] 图5为重组载体pGFPGUS-GmSOC1-like的结构示意图。

[0033] 图6为PCR检测转基因植 株的电泳图。其中，M 为 marker，1 为 质粒pGFPGUS-GmSOC1-like阳 性 对 照，2为 野 生 型 百 脉 根 阴 性 对 照，3、4、5 为 转pGFPGUS-GmSOC1-like的百脉根植株，6、7为转空载体对照植株。

[0034] 图7为RT-PCR检测转基因植株的电泳图。其中，1-5为转pGFPGUS-GmSOC1-like的百脉根植株，6为野生型百脉根植株。

[0035] 图8为转基因植株在长日照条件下的开花情况。其中，TL为转pGFPGUS-GmSOC1-like的百脉根植株，CK为野生型百脉根植株。

具体实施方式

[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0037] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0038] 百脉根（Lotus corniculatus）（长日植物）、载体pGFPGUSplus和发根农杆菌K599（Agrobacterium rhizogenes K599）：参考文献：Bo Jian,Wensheng Hou,CunxiangWu,Bin Liu,Wei Liu,Shikui Song,Yurong Bi,Tianfu Han.Agrobacteriumrhizogenes-mediated transformation of Superroot-derived Lotus corniculatusplants:a valuable tool for functional genomics.BMC plant Biology.2009,9:78；中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供。

[0039] 实施例1、植物开花期相关蛋白GmSOC1-like及其编码基因的获得[0040] 将拟南芥AtSOC1基因的氨基酸序列在Genebank数据库中进行同源比对，找到大豆中同源性较高的基因，并根据进一步获得的全长cDNA序列，设计PCR引物F1：5’-ATGGTGAGAGGAAAGACTCAGCT-3’和R 1：5’-ATAGCTAGACCTGAGTAGTCCAATGA-3’。

[0041] 取短日照（每天8小时光照和16小时黑暗）条件下培养三周的大豆品种贡选一号（Glycine max（L.）Merrill）幼苗，用剪刀小心剪取其枝顶端（尽量去除幼嫩复叶）后液氮冻存，并于-80℃冰箱保存。利用Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA，再以此cDNA为模板，利用上述引物F1和R1进行PCR扩增，将得到的扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（如图1所示），回收0.6kb左右的片段进行测序，结果如序列表序列2的第277位至第912位所示。

[0042] 序列表序列2序列长1081bp，为GmSOC1-like基因的全长cDNA序列，自序列表序列2的第277位至第912位为开放阅读框，编码序列表序列1所示的蛋白GmSOC1-like。

[0043] 实施例2、GmSOC1-like基因在大豆不同发育时期、不同组织中的表达模式[0044] 将大豆品种贡选一号于短日（每天8小时光照和16小时黑暗）条件下种植，分别于萌发后继续生长7、13、19、23、27天取植株的根、茎、叶和顶端组织（即枝顶端组织，还包括后期的花和豆荚）样品，液氮冷冻后于-80℃中保存。Trizol法分别提取各样品的总 RNA，再反转录为 cDNA，以该 cDNA 为模板，5’-AGGCTGTGTGAGCAGTATGGTATC-3’和5’-TAGATAGACCTGGGTAGTCCAATGA-3’为引物，荧光实时定量PCR检测GmSOC1-like基因的相对表达量（设枝顶端组织中表达量最低点的表达量数值为1，其余时间点的表达量均和最低点的相对表达量比较，得出不同时间点的相对表达量），其中，内参基因为GMGGDPH，引物为5’-ACTCCTTGATACCGTTGTCCAT-3’和5’-GTCTGTTATCCGCCTACAGCCT-3’。结果如图4所示。

[0045] 结果表明，在短日条件下，随着大豆由营养生长向生殖生长转变的进行，GmSOC1-like在大豆顶端组织的表达量表现为逐渐升高的趋势，其峰值出现在贡选一号开花转变的早期。此外，在茎、根、花、叶及荚中仅检测到少量GmSOC1-like基因的表达。这表明GmSOC1-like可能是一种大豆开花诱导因子。

[0046] 实施例3、GmSOC1-like基因表达的日节律现象及其在不同日照长度处理下的表达模式

[0047] 1、不同日照下GmSOC1-like基因表达的日节律现象

[0048] 将大豆品种贡选一号种子分别种植于短日照（8h光照和16h黑暗）和长日照（16h光照和8h黑暗）条件下萌发后生长9天后，每隔一小时取植株的顶端组织样品，液氮冷冻后于-80℃中保存。Trizol法分别提取各样品的总RNA，再反转录为cDNA，以该cDNA为模板，按照实施例2的荧光实时定量PCR方法检测各样品中GmSOC1-like基因的相对表达量，结果如图3中的A和B所示。结果表明，短日照条件下、一天24小时内大豆中GmSOC1-like基因的表达在午夜（15小时）出现峰值，而长日照条件下的大豆则没有这样的峰值出现，说明GmSOC1-like基因能够被短日照条件所诱导。

[0049] 2、GmSOC1-like基因在不同日照长度下的表达模式

[0050] 1）设两种处理

[0051] 处理1：大豆品种贡选一号种子种植于短日照（每天8h光照和16h黑暗）条件下萌发后生长13天时转至长日照（每天16h光照和8h黑暗）条件下继续生长；

[0052] 处理2：大豆品种贡选一号种子种植于短日照（每天8h光照和16h黑暗）条件下萌发并生长。

[0053] 2）取样及cDNA的获得

[0054] 在步骤1）的大豆萌发后生长9天开始，每隔两天取顶端组织样品，液氮冷冻后于-80℃中保存。Trizol法分别提取各样品的总RNA，再反转录为cDNA。

[0055] 3）荧光实时定量PCR检测

[0056] 以步骤2）的cDNA为模板，按照实施例2的荧光实时定量PCR方法分别检测各样品中GmSOC1-like基因和已知的控制大豆开花期的基因GmFT2a（Genbank号为AB550122）的相对表达量，其中检测GmFT2a的引物为5’-TAATTCATAACAAAGCAAACGAGTA-3’和5’-GCTGACATCTCTGTTATTGTAGGTA-3’。结果如图4中的A和B所示。

[0057] 结果表明：在短日照条件下，GmSOC1-like基因在萌发后19天被大量诱导表达，比基因GmFT2a诱导所需时间（萌发后23天）更短，而长日照条件不能诱导基因GmSOC1-like和GmFT2a的表达。这说明与GmFT2a基因相比，GmSOC1-like基因是一种更早形成的开花诱导因子，且不受GmFT2a的调控。

[0058] 实施例4、开花提前的转基因百脉根植株的获得

[0059] 1、目的基因GmSOC1-like的重组表达载体构建

[0060] 用5’端分别含有Xbal I和Sac I酶切识别序列的引物F1-X：

[0061] 5’-GCTCTAGAATGGTGAGAGGAAAGACTCAGCT-3’和R1-S：

[0062] 5’-CGAGCTCATAGCTAGACCTGAGTAGTCCAATGA-3’PCR扩增实施例1中大豆品种贡选一号GmSOC1-like基因的cDNA，将获得PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收纯化0.65kb的片段，用xbal I和Sac I双酶切，连入载体pGFPGUSplus的xbal I和Sac I的位点间，获得重组载体pGFPGUS-GmSOC1-like。经测序证实，重组载体pGFPGUS-GmSOC1-like（如图5所示）是在载体pGFPGUSplus的xbal I和Sac I的位点间插入了序列表序列2第277位至第912位所示的DNA片段。

[0063] 2、重组发根农杆菌的获得

[0064] 取步骤1的重组载体pGFPGUS-GmSOC1-like，电击法转化发根农杆菌K599，获得含有重组载体pGFPGUS-GmSOC1-like的重组发根农杆菌K599/pGFPGUS-GmSOC1-like。

[0065] 按照同样的方法，将空载体pGFPGUSplus电击转化发根农杆菌K599，获得含有空载体pGFPGUSplus的重组发根农杆菌K599/pGFPGUSplus。

[0066] 3、转基因百脉根植株的获得

[0067] 参 照 文 献“Bo Jian,Wensheng Hou,Cunxiang Wu,Bin Liu,Wei Liu,Shikui Song,Yurong Bi,Tianfu Han.Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation ofSuperroot-derived Lotus corniculatus plants:a tool for functional genomicsin legumes.BMC plant Biology.2009,9:78”中的方法，用步骤2获得的重组发根农杆菌K599/pGFPGUS-GmSOC1-like侵染百脉根（Lotus corniculatus L.）获得抗性转pGFPGUS-GmSOC1-like的百脉根植株，具体步骤如下：

[0068] 1）将重组发根农杆菌K599/pGFPGUS-GmSOC1-like在含卡那霉素50mg/L的LB固体培养基上进行划线培养，挑取单菌落在于含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中，28℃过夜培养。取菌液按照1:1000的比例摇菌至OD600=0.6获得侵染液。

[0069] 2）将长日条件下培养的百脉根（Lotus corniculatus L.）幼苗的茎切段，每段含一个节间，浸泡于步骤一获得的侵染液中，25℃、50rpm振荡侵染30min，倒掉液体，再用无菌滤纸吸取多余菌液，置表面铺滤纸的CCM培养基上，共培养2天后用无菌水冲洗三遍，然后放在洗涤培养基中50rpm振荡1h，倒掉液体，用无菌滤纸吸干液体，置于发状根诱导培养基上于25℃，每天16h光照8h黑暗条件下培养诱导发状根的产生。

[0070] 上述培养基的配方如下：

[0071] CCM培养基：1/10MS液体培养基中添加2-吗啉乙磺酸钠（MES）3.9mg/L、乙酰丁香酮（As）200mM、二硫苏糖醇（DTT）150mg/L、半胱氨酸（Cys）100mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7.5g/L，pH5.4；

[0072] 洗涤培养基：1/2MS液体培养基中添加头孢霉素（Cef）250mg/L、羧苄青霉素（Cb）250mg/L和蔗糖30g/L，pH6.8；

[0073] 发状根诱导培养基：1/2MS液体培养基中添加头孢霉素（Cef）250mg/L、羧苄青霉素（Cb）250mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7.5g/L，pH6.8。

[0074] 3）两周后，将长出的发状根切下，放在再生培养基上诱导芽分化。将长出的芽放置于生根培养基上培养，最终获得20株抗性转pGFPGUS-GmSOC1-like的百脉根植株。

[0075] 上述培养基的配方如下：

[0076] 再生培养基：MS液体培养基中添加6-BA 0.5mg/L、Cef 250mg/L、Cb 250mg/L、琼脂7.5g/L和蔗糖30g/L，pH6.8。

[0077] 生根培养基：MS液体培养基中添加Cef 250mg/L、Cb 250mg/L、琼脂7.5g/L和蔗糖30g/L，pH6.8。

[0078] 同时，按照上述步骤1）-3）方法用重组发根农杆菌K599/pGFPGUSplus转化百脉根（Lotus corniculatus L.），获得20株抗性转空载体对照植株。

[0079] 4、转基因植株的PCR鉴定

[0080] 取步骤3获得的抗性转pGFPGUS-GmSOC1-like的百脉根植株和抗性转空载体对照植株，分别提取基因组DNA，以GUS基因片段为靶基因，用上游引物5’-GATGATAGTTACAGAACCGACG-3’和下游引物5’-CATTCGGAATCTCCACGTTAC-3’进行PCR检测，预测产物的大小750bp，部分结果如图6所示。转pGFPGUS-GmSOC1-like的植株20株全部呈阳性，转空载体对照植株20株全部呈阳性。

[0081] 5、转基因植株的RT-PCR检测

[0082] 取经步骤4PCR检测为阳性转pGFPGUS-GmSOC1-like的百脉根株系植株的叶片，Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA后，以该cDNA为模板，PCR扩增目的基因GmSOC1-like，以β-tubulin为内参基因，同时经步骤4PCR检测为阳性转空载体对照株系植株及野生型百脉根中的目的基因GmSOC1-like的表达为对照，部分结果如图7所示。

[0083] 检测GmSOC1-like的引物序列如下：

[0084] 上游引物：5’-TTCAAAGCGGCGTAATGGGT-3’（对应于序列表序列2的第339-358位）；

[0085] 下游引物：5’-CACTCCTGTTATGCCTGCGG-3’（对应于序列表序列2的第483-502位）。

[0086] 检测β-tubulin的引物序列如下：

[0087] 上游引物：5’-TCTGATACTGTTGTGGAGCCT-3’；

[0088] 下游引物：5’-TGGGATCAGATTCACTGCTAG-3’；

[0089] 产物大小为252bp。

[0090] 结果：转pGFPGUS-GmSOC1-like的百脉根植株均稳定表达基因GmSOC1-like，而转空载体对照株系植株及野生型百脉根中不表达GmSOC1-like。

[0091] 6、转基因植株开花提前

[0092] 观察步骤3获得的20株阳性转pGFPGUS-GmSOC1-like的百脉根植株在温室长日照（每天16小时光照/8小时黑暗）培养条件下的开花情况，以同苗龄（即叶片数相同）的步骤3获得的20株阳性转空载体对照株系植株及20株野生型百脉根为对照。

[0093] 结果：在相同培养条件下，转pGFPGUS-GmSOC1-like的百脉根植株全部开花，而同苗龄的转空载体对照株系植株和野生型百脉根植株在此期间一直无花芽分化（图8），经过32±2天后开始开花。

[0094] 上述结果表明，蛋白GmSOC1-like及其编码基因GmSOC1-lilke具有调控植物开花或开花期性状的功能。