聚集诱导发光荧光分子及其制备方法和荧光染料组合物以及它们在线粒体染色中的应用

摘要

本发明提供了一种聚集诱导发光荧光分子以及该聚集诱导发光荧光分子的制备方法。本发明还提供了一种含有本发明提供的聚集诱导发光荧光分子的荧光染料组合物。另外，本发明还提供了所述聚集诱导发光荧光分子以及所述荧光染料组合物在线粒体染色中的应用。采用本发明提供的聚集诱导发光荧光分子（荧光探针）具有对细胞毒性低、发光稳定性好，且可对线粒体进行有效的染色，同时可指示线粒体膜电位的高低，可用于长时间标记、跟踪细胞内线粒体，并可用于线粒体膜电位的检测。

权利要求

1.聚集诱导发光荧光分子和/或荧光染料组合物在线粒体染色中的应用，该荧光染料组合物含有所述聚集诱导发光荧光分子以及可用于细胞染色的其它染料，其特征在于，所述聚集诱导发光荧光分子为具有下述结构的分子中的任意一种：其中，R1、R2、R3和R4各自独立地为-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1以及-H中的任意一种，其中，n为1-10的整数；

其中，R5为-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1以及-H中的任意一种；R6、R7和R8各自独立地为-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1、-H以及 中的任意一种，其中，n为1-10的整数；

其中，R12、R13、R14、R15、R16和R17各自独立地为-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1、-H以及中的任意一种，其中，n为1-10的整数；

- - -

其中，在结构式(1)、结构式(2)和结构式(4)中，X-选自卤素负离子、ClO4、PF6、CF3、-BF4中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，在结构式(1)、结构式(2)和结构式(4)中，X-选自卤素负离子。

3.根据权利要求2所述的应用，其中，在结构式(1)、结构式(2)和结构式(4)中，X-为- - -Cl、Br或I 。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的应用，其中，

结构式(1)中R1、R2、R3和R4均为-H；

结构式(2)中，R6为 且R5、R7和R8中至少一个取代基为-O-(CH2)n-OH，其中，n为1-10的整数；或R5为-OCnH2n+1和-H中的任意一种，且n为1-3的整数，R6为和-H中的任意一种，且n为1-4的整数，R7为-H，R8为-CnH2n+1和-H中的任意一种，且n为1-3的整数；

结构式(4)中，R13和R15均为-H，R12和R16均为 且n为1-3的整数，R14和R17均为-OCnH2n+1，且n为1-3的整数。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，结构式(2)中，R6为 且R5、R7和R8中至少一个取代基为-O-(CH2)n-OH，其中，n为1-4的整数。

6.根据权利要求4所述的应用，其中，结构式(2)中，R6为 R5和R7均为-H，R8为-O-(CH2)n-OH，或者R5和R8均为-H，R7为-O-(CH2)n-OH，其中，n为1-4的整数。

7.根据权利要求1所述的应用，其中，所述荧光染料组合物含有所述聚集诱导发光荧光分子和可用于细胞染色的其它染料，以荧光染料组合物的总摩尔数为基准，所述诱导发光荧光分子的摩尔含量为1-99％，所述可用于细胞染色的其它染料的摩尔含量为1-99％；

所述可用于细胞染色的其它染料选自罗丹明123、碘化丙啶、4,6-联脒-2-苯基吲哚、噻唑橙、吖啶橙、健那绿、台盼蓝和中性红中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的应用，其中，以荧光染料组合物的总摩尔数为基准，所述诱导发光荧光分子的摩尔含量为30-80％，所述可用于细胞染色的其它染料的摩尔含量为

20-70％。

说明书

聚集诱导发光荧光分子及其制备方法和荧光染料组合物以

及它们在线粒体染色中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种聚集诱导发光荧光分子及其制备方法和一种荧光染料组合物以及它们在线粒体染色中的应用。

背景技术

[0002] 线粒体是细胞内高度活跃的细胞器，是产生ATP的主要部位，在氧化磷酸化、铁稳态、过氧化物生成、细胞凋亡等生命活动中发挥着关键作用。线粒体功能异常与许多急慢性疾病，如癌症、糖尿病、神经退行性疾病等密切相关。

[0003] 因此，对细胞内线粒体的评价尤为重要，目前，对细胞内线粒体的评价主要是先借助荧光染料对其进行染色，然后再对染色后的线粒体进行观察。其中，对线粒体进行相关的观察、检测线粒体膜电位（荧光染料会在线粒体膜电位的驱使下在线粒体内累积，其累积量与线粒体膜电位密切相关，因而可用于线粒体膜电位的检测）以及实时监测线粒体在细胞内的运动等为评估线粒体功能的重要参数。

[0004] 现有技术中，对细胞内线粒体的染色主要依赖于一些阳离子化合物，如JC-1、Rhodamine 123、TMRM、TMRE、DiOC6(3)等。这些阳离子化合物经某一波长的光波激发后可发出荧光。因此，使用这些荧光染料，即荧光探针，结合流式细胞仪、荧光显微镜等检测仪器，即可直完成对线粒体上述重要参数的评估。

[0005] 但目前上述常用的几种用于线粒体染色的荧光探针存在着不同的缺点，如：具有较大的线粒体毒性和细胞毒性，且染色稳定性差。

发明内容

[0006] 本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种毒性低、发光稳定性好的聚集诱导发光荧光分子及其制备方法和一种荧光染料组合物以及它们在线粒体染色中的应用。

[0007] 一方面，本发明提供一种聚集诱导发光荧光分子，其中，所述聚集诱导发光荧光分子为具有下述结构的分子中的任意一种：

[0008]

[0009] 其中，R1、R2、R3和R4各自独立地为-O-(CH2)n-OH、—OCnH2n+1、—CnH2n+1以及—H中的任意一种，其中，n为1-10的整数；

[0010]

[0011] 其中，R5为-O-(CH2)n-OH、—OCnH2n+1、—CnH2n+1以及—H中的任意一种；R6、R7和R8各自独立地为-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1、-H以及 中的任意一种，其中，n为1-10的整数；

[0012]

[0013] 其中，R12、R13、R14、R15、R16和R17各自独立地为-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1、-H以及 中的任意一种，其中，n为1-10的整数；

[0014] 其中，在结构式（1）、结构式（2）和结构式（4）中，X-选自卤素负离子、ClO4-、PF6-、- - - - -CF3、BF4中的任意一种，优选为卤素负离子，更优选为Cl 、Br或I 。

[0015] 优选地，结构式（1）中R1、R2、R3和R4均为-H；

[0016] 结构式（2）中，R6为 且R5、R7和R8中至少一个取代基为-O-(CH2)n-OH，其中，n为1-10的整数，优选n为1-4的整数；或R5为-OCnH2n+1和-H中的任意一种，且n为1-3的整数，R6为 和-H中的任意一种，且n为1-4的整数，R7为-H，R8
为-CnH2n+1和-H中的任意一种，且n为1-3的整数；更优选地，R6为 R5和R7
均为-H，R8为-O-(CH2)n-OH，或者R5和R8均为-H，R7为-O-(CH2)n-OH，其中，n为1-4的整数；

[0017] 结构式（4）中，R13和R15均为-H，R12和R16均为 且n为1-3的整数，R14和R17均为-OCnH2n+1，且n为1-3的整数。

[0018] 另一方面，本发明提供了一种所述聚集诱导发光荧光分子的制备方法，其中，该方法包括：在有机溶剂以及碱性物质催化剂的存在下，将如式Ⅱ所示结构的化合物或如式Ⅳ所示结构的化合物与如式III所示结构的化合物混合并加热回流，生成含有如权利要求1所述的聚集诱导发光荧光分子的生成物；

[0019]

[0020] 其中，R1选自-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1以及-H中的任意一种；R2和R4各自独立地为-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1、-H以及 中的任意一种；R3选自-CHO、-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1、-H以及 中的任意一种，n为1-10的
- - - - -
整数；X选自卤素负离子、ClO4、PF6、CF3、BF4中的任意一种，优选为卤素负离子，更优选为- - -
Cl、Br或I ；

[0021] 其中，化合物Ⅱ中1号碳原子位置上连接的甲基与化合物III中固有的醛基发生缩合反应；或者当化合物III中R3取代基为醛基时，化合物Ⅱ中1号碳原子位置上连接的
甲基与化合物III中固有的醛基以及R3取代醛基发生缩合反应；或者化合物Ⅳ中1号和6
号碳原子位置上连接的甲基与化合物III中固有的醛基发生缩合反应。

[0022] 第三方面，本发明提供了一种荧光染料组合物，其中，该荧光染料组合物含有聚集诱导发光荧光分子以及可用于细胞染色的其它染料，所述聚集诱导发光荧光分子为本发明提供的聚集诱导发光荧光分子。

[0023] 再一方面，本发明提供所述聚集诱导发光荧光分子以及所述荧光染料组合物在线粒体染色中的应用。

[0024] 通过上述技术方案，采用本发明提供的聚集诱导发光荧光分子荧光探针具有对细胞和线粒体毒性低、发光稳定性好，且可对线粒体进行有效的染色， 同时可指示线粒体膜电位的高低，可用于长时间标记、跟踪细胞内线粒体，并可用于线粒体膜电位的检测。

[0025] 本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

[0026] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。

[0027] 图1为探针4染色的细胞的荧光强度随时间的变化；

[0028] 图2（a）为罗丹明123染色的Hela细胞图片；图2（b）为探针1染色的Hela细胞图片；图2（c）为罗丹明123和探针1混合液染色的Hela细胞图片；

[0029] 图3（a）为罗丹明123染色的Hela细胞图片；图3（b）为探针4染色的Hela细胞图片，图3（c）为罗丹明123和探针4混合液染色的Hela细胞图片。

[0030] 图4（a）为探针1染色的HUVEC细胞图片（0min）；图4（b）为探针1染色的HUVEC细胞图片（15min）；图4（c）为探针1染色的HUVEC细胞图片（30min）；

[0031] 图5（a）为探针1染色的正常Hela细胞图片；图5（b）为探针1染色的线粒体膜电位抑制剂处理的Hela细胞图片；

[0032] 图6（a）、（b）、（c）、（d）分别显示了探针11与100μM的H2O2的混合液处理的Hela细胞在0、40min、80min和120min时间点细胞中的荧光变化。

具体实施方式

[0033] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0034] 一方面，本发明提供一种聚集诱导发光荧光分子，其中，所述聚集诱导发光荧光分子为具有下述结构的分子中的任意一种：

[0035]

[0036] 其中，R1、R2、R3和R4各自独立地为-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1以及-H中的任意一种，其中，n为1-10的整数；

[0037]

[0038] 其中，R5为-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1以及-H中的任意一种；R6、R7和R8各自独立地为-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1、-H以及 中的任意一种，其中，n为1-10的整数；

[0039]

[0040] 其中，R12、R13、R14、R15、R16和R17各自独立地为-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1、-H以及 中的任意一种，其中，n为1-10的整数；

[0041] 其中，在结构式（1）、结构式（2）和结构式（4）中，X-选自卤素负离 子、ClO4-、PF6-、CF3-、BF4-中的任意一种，优选为卤素负离子，更优选为Cl-、Br-或I-。

[0042] 优选地，结构式（1）中R1、R2、R3和R4均为-H；

[0043] 结构式（2）中，R6为 且R5、R7和R8中至少一个取代基为-O-(CH2)n-OH，其中，n为1-10的整数，优选n为1-4的整数；或R5为-OCnH2n+1和-H中的任意一种，且n为1-3的整数，R6为 和-H中的任意一种，且n为1-4的整数，R7为-H，R8
为-CnH2n+1和-H中的任意一种，且n为1-3的整数；更优选地，R6为 R5和R7
均为-H，R8为-O-(CH2)n-OH，或者R5和R8均为-H，R7为-O-(CH2)n-OH，其中，n为1-4的整数；

[0044] 结构式（4）中，R13和R15均为-H，R12和R16均为 且n为1-3的整数，R14和R17均为-OCnH2n+1，且n为1-3的整数。

[0045] 另一方面，本发明提供了一种所述聚集诱导发光荧光分子的制备方法，其中，该方法包括：在有机溶剂以及碱性物质催化剂的存在下，将如式Ⅱ所示结构的化合物或如式Ⅳ所示结构的化合物与如式III所示结构的化合物混合并加热回流，生成含有如权利要求1所述的聚集诱导发光荧光分子的生成物；

[0046]

[0047] 其中，R1选自-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1以及-H中的任意一种；R2和R4各自独立地为-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1、-H以及 中的任意一种；R3选自-CHO、-O-(CH2)n-OH、-OCnH2n+1、-CnH2n+1、-H以及 中的任意一种，n为1-10的
- - - - -
整数；X选自卤素负离子、ClO4、PF6、CF3、BF4中的任意一种，优选为卤素负离子，更优选为- - -
Cl、Br或I ；

[0048] 其中，化合物Ⅱ中1号碳原子位置上连接的甲基与化合物III中固有的醛基发生缩合反应；或者当化合物III中R3取代基为醛基时，化合物Ⅱ中1号碳原子位置上连接的
甲基与化合物III中固有的醛基以及R3取代醛基发生缩合反应；或者化合物Ⅳ中1号和6
号碳原子位置上连接的甲基与化合物III中固有的醛基发生缩合反应。

[0049] 根据本发明，所述化合物Ⅱ、化合物Ⅳ和化合物III的来源和纯度的可选范围较宽，只要可用于所述聚集诱导发光荧光分子的合成即可。例如，上述三类反应物均可购自天津市佰斯康科技有限公司，纯度分别可以为96重量%-99重量%。

[0050] 根据本发明，对所述化合物II与化合物III的用量摩尔比没有特别的限制，只要保证反应后可生成具有上述结构的聚集诱导发光荧光分子即可。例如，以反应物的摩尔数计，当所述化合物II过量且化合物III中R3取代基为-CHO时，可生成上述结构式（1）所示的聚集诱导发光荧光分子；当化合物II与化合物III的用量不用特别限定且化合物III
中R3取代基不为-CHO时，可生成上述结构式（2）所示的聚集诱导发光荧光分子；优选情况下，为了更好的控制反应的进行以及生成的聚集诱导发光荧光分子的种类，所述 化合物II与化合物III的用量摩尔比1:0.5-2；当生成上述结构式（1）所示的聚集诱导发光荧光分子时，所述化合物II与化合物III的用量摩尔比更优选1:0.5-0.8；当生成上述结构式
（2）所示的聚集诱导发光荧光分子时；所述化合物II与化合物III的用量摩尔比更优选
1:0.8-1.5。优选的情况下，所述化合物Ⅳ与化合物III的用量摩尔比小于1且化合物III
中R3取代基不为-CHO时，可生成上述结构式（4）所示的聚集诱导发光荧光分子；更优选的情况下，为了得到较纯的结构式（4）所示的聚集诱导发光荧光分子，所述化合物Ⅳ与化合物III的用量摩尔比为0.3-0.8:1。

[0051] 根据本发明，对所述有机溶剂的种类和加入量没有特别的限制，只要可将化合物II或化合物Ⅳ与化合物III充分溶解，并不与反应物和生成物反应即可。优选情况下，为了便于后续过程中对所述有机溶剂进行有效地去除，选用沸点为30-80℃的有机溶剂，以1mM总反应物为基准，有机溶剂的加入量为10-100mL；更优选的情况下，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸乙酯和二氯甲烷中的任意一种。

[0052] 根据本发明，碱性物质催化剂的种类和加入量没有特别的限制，只要能够催化化合物II或化合物Ⅳ与化合物III反应生成所述聚集诱导发光荧光分子，并不与反应物和生成物反应即可。优选情况下，碱性物质催化剂选自氢氧化钠、醋酸钠、醋酸钾、磷酸钠、甲酸钠、丙酸钠、丙酸钾、草酸钠和草酸钾中的一种或多种，碱性物质催化剂的加入量与反应物总加入量的摩尔量比为1:1-2。

[0053] 根据本发明，加热回流的时间的可选范围也较宽，只要保证化合物II或化合物Ⅳ与化合物III充分反应即可，优选情况下，加热回流的时间为3-10小时。

[0054] 根据本发明，在有机溶剂以及碱性物质催化剂的存在下，将化合物Ⅱ或化合物Ⅳ与化合物III混合的方式没有特别限定，例如，可以将化合物Ⅱ或 化合物Ⅳ与化合物III加入到含有碱性物质催化剂的有机溶剂中并混合均匀，也可以先将化合物Ⅱ或化合物Ⅳ与化合物III混合后，向该混合物中加入有机溶剂和碱性物质催化剂。

[0055] 根据本发明，该制备方法还包括将生成物冷却至常温，如20-30℃后，加入干燥剂对生成物进行干燥。所述干燥剂的种类为本领域技术人员所公知，例如，可以为无水硫酸镁、无水硫酸钙、无水氯化钙、无水碳酸钾、无水硫酸钠和金属钠中的一种或多种。对干燥剂的加入量和干燥的时间的可选范围较宽，只要充分吸收生成物中的水分即可，优选情况下，以所述生成物总重量为基准，所述干燥剂的加入量为10-500重量%，干燥的时间为2-8小时。

[0056] 根据本发明，该制备方法还包括分离所述干燥剂，并除去干燥后的生成物中的有机溶剂。所述分离干燥剂的方法为本领域技术人员所公知，例如，可以采用过滤的方法。所述除去有机溶剂的方法为本领域技术人员所公知，例如，可以采用蒸馏的方法，优选情况下，为了保护反应物、生成物不被分解，在真空的条件下进行蒸馏。

[0057] 第三方面，本发明提供了一种荧光染料组合物，该荧光染料组合物含有聚集诱导发光荧光分子以及可用于细胞染色的其它染料，其中，所述聚集诱导发光荧光分子为本发明提供的聚集诱导发光荧光分子。

[0058] 根据本发明，所述可用于细胞染色的其它染料的可选范围较宽，只要可用于细胞的染色即可，例如，可以为罗丹明123、碘化丙啶、4,6-联脒-2-苯基吲哚、噻唑橙、吖啶橙、健那绿、台盼蓝、中性红等，其中，所述用于细胞染色的其它染料可以为一种，也可以为多种的混合物。

[0059] 根据本发明，所述荧光染料组合物中聚集诱导发光荧光分子和所述可用于细胞染色的其它染料的含量可选范围较宽，其中，以所述荧光染料组合物的总摩尔数为基准，所述诱导发光荧光分子的摩尔含量为1-99%，所述可用 于细胞染色的其它染料的摩尔含量为1-99%；优选地，以荧光染料组合物的总摩尔数为基准，所述诱导发光荧光分子的摩尔含量为30-80%，所述可用于细胞染色的其它染料的摩尔含量为20-70%。

[0060] 再一方面，本发明提供所述聚集诱导发光荧光分子以及所述荧光染料组合物在线粒体染色中的应用。

[0061] 根据本发明，所述聚集诱导发光荧光分子以及荧光染料组合物可用于任何含有线粒体的细胞的染色。其中，所述聚集诱导发光荧光分子以及荧光染料组合物在细胞染液中的浓度的可选范围较宽，只要能够有效地将细胞中的线粒体染色即可，优选情况下，所述聚集诱导发光荧光分子以及荧光染料组合物中的聚集诱导发光荧光分子在细胞染液中的浓度可以为1nM-1mM。

[0062] 根据本发明，所述聚集诱导发光荧光分子以及荧光染料组合物在线粒体染色中的应用主要为：对线粒体相关的观察（例如，线粒体形态研究）、线粒体在细胞内运动的实时监测以及线粒体膜电位检测。

[0063] 根据本发明，所述聚集诱导发光荧光分子以及荧光染料组合物对细胞进行染色的条件为本领域技术人员所公知，一般根据所述染色的细胞的种类和染色的目的不同而有所改变，如何根据细胞的种类和染色的目的选择合适的染色条件为本领域技术人员所公知。通常情况下，当只用于线粒体染色时，所述聚集诱导发光荧光分子以及荧光染料组合物对细胞进行染色的条件为：pH为6-8、温度为20-38℃、染色时间为3-60min；当用于时监测线粒体在细胞内的运动时，所述聚集诱导发光荧光分子以及荧光染料组合物对细胞进行染色的条件为：pH值可以为6-8、温度可以为20-38℃、染色时间可以为3分钟到24小时；当用于线粒体膜电位检测时，所述聚集诱导发光荧光分子以及荧光染料组合物对细胞进行染色的条件为：pH值可以为6-8、温度可以为20-38℃、染色时间可以为3分钟到24小时。

[0064] 根据本发明，对染色后的细胞进行观察的方法为本领域技术人员所公 知，例如，可以使用荧光显微镜、流式细胞术。如何对线粒体进行相关的观察（例如，线粒体形态研究）、对线粒体在细胞内的运动进行实时监测以及对线粒体进行膜电位检测的方法为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

[0065] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

[0066] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

[0067] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

[0068] 以下实施例中所用试剂均购自西格玛奥德里奇公司以及北京泛博生物化学有限公司（除非特别说明）；细胞培养用试剂购自美国GBICO公司；荧光显微镜购自蔡司中国公司，型号为Axio Observer A1；细胞毒性检测用酶标仪购自北京东胜创新生物科技有限公司，型号为Infinite M200；全自动真空蒸馏装置购自上海西域机电系统有限公司，型号ilmdest+；核磁共振仪购自瑞士布鲁克（Bruker）公司，型号为Bruker AV 400；质谱仪购自上海仁特检测仪器有限公司，型号为Orbitrap Elite；激光共聚焦扫描显微镜购自蔡司中国公司，型号为LSM 510 SYSTEM；化学合成实验所用器皿购自西化仪(北京)科技有限公
司；合成反应的反应物2、反应物3、反应物5、反应物7、反应物8、反应物10、反应物12和反应物13均购自天津市佰斯康科技有限公司，纯度均为98重量%；CCK-8检测试剂盒购自南
京恩晶生物科技有限公司。

[0069] 细胞用培养基配方：DMEM、10%胎牛血清、100U/mL青霉素、80μg/mL链霉素。

[0070] 实施例1

[0071] 1、探针1的合成

[0072]

[0073] （1）将200mg（0.66mmol）化合物2与239mg（0.66mmol）化合物3进行混合，混合均匀后向混合物中加入20mL乙醇，并加入52.8mg氢氧化钠作为催化剂混合均匀后形成反应混合物。

[0074] （2）将所述反应混合物在回流加热装置中加热回流6小时后停止加热，得到生成物。

[0075] （3）将生成物冷却至25℃，向冷却后的有机相中加入100mg无水硫酸镁进行干燥，干燥时间为3小时，然后对干燥后的生成物进行过滤以除掉干燥剂。

[0076] （4）将除掉干燥剂的生成物在全自动真空蒸馏装置中进行真空蒸馏除出溶剂，得到350mg红色纯产物1，即探针1。

[0077] 2、探针4的合成

[0078]

[0079] （1）将602mg（2mmol）化合物2与388mg（1mmol）化合物5进行混合，混合均匀后向混合物中加入65mL乙醇，并加入294mg醋酸钾作为催化剂混合均匀后形成反应混合物。

[0080] （2）将所述反应混合物在回流加热装置中加热回流9.5小时后停止加热，得到生成物。

[0081] （3）将生成物冷却至25℃，向冷却后的有机相中加入210mg无水硫酸钙进行干燥，干燥时间为4小时，然后对干燥后的生成物进行过滤以除掉干燥剂。

[0082] （4）将除掉干燥剂的生成物在全自动真空蒸馏装置中进行真空蒸馏除溶剂，得到1003mg红色纯产物4，即探针4。

[0083] 3、探针6的合成

[0084]

[0085] （1）将269mg（0.85mmol）化合物7与528mg（0.85mmol）化合物8进行混合，混合均匀后向混合物中加入40mL甲醇，并加入139mg醋酸钠作为催化剂混合均匀后形成反应混合物。

[0086] （2）将所述反应混合物在回流加热装置中加热回流7小时后停止加热，得到生成物。

[0087] （3）将生成物冷却至25℃，向冷却后的有机相中加入160mg无水氯化钙进行干燥，干燥时间为3.5小时，然后对干燥后的生成物进行过滤以除掉干燥剂。

[0088] （4）将除掉干燥剂的生成物在全自动真空蒸馏装置中进行真空蒸馏除溶剂，得到620mg红色纯产物6，即探针6。

[0089] 4、探针9的合成

[0090]

[0091] （1）将301mg（1mmol）化合物2与601mg（1mmol）化合物10进行混合，混合均匀后向混合物中加入40mL乙酸乙酯，并加入328mg磷酸钠作为催化剂混合均匀后形成反应混合物。

[0092] （2）将所述反应混合物在回流加热装置中加热回流5小时后停止加热，得到生成物。

[0093] （3）将生成物冷却至25℃，向冷却后的有机相中加入200mg无水氯化钙进行干燥，干燥时间为4小时，然后对干燥后的生成物进行过滤以除掉干燥剂。

[0094] （4）将除掉干燥剂的生成物在全自动真空蒸馏装置中进行真空蒸馏除溶剂，得到710mg红色纯产物9，即探针9。

[0095] 5、探针11的合成

[0096]

[0097] （1）将430mg（1mmol）化合物12与1116mg（2mmol）化合物13进行混合，混合均匀后向混合物中加入50mL乙醇，并加入120mg氢氧化钠作为催化剂混合均匀后形成反应混合物。

[0098] （2）将所述反应混合物在回流加热装置中加热回流9小时后停止加热，得到生成物。

[0099] （3）将生成物冷却至25℃，向冷却后的有机相中加入280mg无水硫酸镁进行干燥，干燥时间为4小时，然后对干燥后的生成物进行过滤以除掉干燥剂。

[0100] （4）将除掉干燥剂的生成物在全自动真空蒸馏装置中进行真空蒸馏除溶剂，得到1205mg红色纯产物11，即探针11。

[0101] 使用核磁共振仪以及质谱仪分析上述所得的探针1、4、6、9和11，确定其结构，核磁及质谱数据显示，成功合成了上述探针1、4、6、9和11，核磁及质谱数据如下：

[0102] （1）探针1的核磁数据如下：

[0103] 1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.33(d,J=16.3Hz,1H),7.82(d,J=8.5Hz,3H),7.77(dd,J=6.0,2.7Hz,1H),7.68–7.62(m,2H),7.58(d,J=16.3Hz,1H),7.23(s,1H),7.
21(s,1H),7.19-7.11(m,9H),7.10-7.01(m,6H),4.15(s,3H),1.84(s,6H).13C NMR（
100MHz,CD3OD）:δ189.12,182.08,154.00,150.68,142.90,142.82,141.53.131.39,131.3
0,128.08,128.00,127.75,115.14,112.38,52.57,37.30,26.91；

[0104] 探针1的高分辨质谱数据：ESI:m/z=516[M]+。

[0105] （2）探针4的核磁数据如下：

[0106] 1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.42（d，4H），7.37（s，4H）,7.30（s，4H）,7.26（s，4H）,7.2-7.1（m，11H），5.6（s，2H），3.73（s，3H），1.32（s，12H），0.9（s，6H）。

[0107] 探针4的高分辨质谱数据：ESI:m/z=731[M]+。

[0108] （3）探针6的核磁数据如下：

[0109] 1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.42（s，2H），7.37（s，2H）,7.32-7.30 （m，6H）,7.26（s，2H）,7.11-7.06（d，3H），6.77（s，2H），6.6（d，3H），5.89（s，2H），5.6（s，1H），3.73（s，3H），3.3（s，9H），2.35（s，3H），1.3（s，6H），0.9（s，3H）。

[0110] 探针6的高分辨质谱数据：ESI:m/z=775[M]+。

[0111] （4）探针9的核磁数据如下：

[0112] 1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.42（s，2H），7.37（s，2H）,7.32-7.30（m，6H）,7.26（s，2H）,7.2-7.1（m，5H），6.77（s，4H），6.6（s，1H），5.6（s，1H），4.38（s，2H），4.13（s，2H），3.95（s，2H），3.66（s，2H），3.30（s，9H），2.0（s，1H），1.3（s，6H），0.9（s，3H）。

[0113] 探针9的高分辨质谱数据：ESI:m/z=679[M]+。

[0114] （5）探针11的核磁数据如下：

[0115] 1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.42（s，4H），7.37（s，4H）,7.32-7.30（m，12H）,7.26（s，4H），7.11（s，2H），7.1（s，2H），6.77（d，8H），6.6（s，2H），5.89（s，4H），5.6（s，2H），3.73（s，6H），3.30（s，18H），1.3（s，12H），0.9（s，6H）。

[0116] 探针11的高分辨质谱数据：ESI:m/z=1192[M]+。

[0117] 实施例2

[0118] 1、探针1、4、6、9、11和罗丹明123的细胞毒性测试

[0119] 将Hela细胞接种于96孔板中，37℃，5体积%CO2的条件下在细胞培养箱中培养12小时，并更换新鲜培养基。然后向96孔板中分别加入不同浓度（浓度分别为0、50μM和
500μM）的染色探针1、4、6、9、11和罗丹明123，37℃，5体积%CO2以及pH值7.4的条件下培养6h，清洗96孔板并加入新鲜细胞培养基，按照CCK-8检测试剂盒说明书进行CCK-8细
胞活性检测实验，并使用酶标仪检测光密度，并以光密度表示细胞的活性，以未加荧 光探针的细胞活性为100%计，当探针1、4、6、9、11和罗丹明123的浓度分别50μM时，细胞的活性分别为89.08%、83.72%、87.54%、89.48%、83.25%、79.63%；当探针1、4、6、9、11和罗丹明123的浓度分别500μM时，细胞的活性分别为77.86%、78.51%、75.23%、76.82%、76.19%、
67.26%，说明本发明提供的探针具有较小的细胞毒性。

[0120] 2、探针1、4、6、9、11和罗丹明123发光稳定性测试

[0121] 使用探针1、4、6、9、11和罗丹明123分别对Hela细胞的线粒体进行染色，染色的条件为：pH值7.4、温度为37℃、染色时间为30min。用新鲜培养基清洗一次后，置于100W汞灯下照射，每2min使用荧光显微镜检测一次荧光。25min内探针1染色的细胞的荧光强度下降了13%；探针4染色细胞的荧光强度下降了16%；探针6染色的细胞的荧光强度下降
了10%；探针9染色的细胞的荧光强度下降了17%；探针11染色的细胞的荧光强度下降了
20%；而罗丹明123染色的细胞的荧光强度下降了61%。说明本发明提供的探针具有较好的荧光稳定性。图1显示出了探针4染色的细胞的荧光强度随时间的变化趋势。

[0122] 3、对线粒体特异性染色的检测

[0123] （1）将Hela细胞接种于11个confocal小皿中，37℃，5体积%CO2条件下在细胞培养箱中培养12小时，并更换新鲜培养基。向11个培养皿中分别加入探针1溶液、探针4
溶液、探针6溶液、探针9溶液、探针11溶液、罗丹明123溶液以及罗丹明123和探针1的
混合液、罗丹明123和探针4的混合液、罗丹明123和探针6的混合液、罗丹明123和探针9
的混合液、罗丹明123和探针11的混合液（溶解在细胞培养基中，其中，罗丹明123和上述各探针的混合液中，罗丹明与各探针的摩尔比为1：2）。只含有本发明提供的探针溶液的培养皿中，探针浓度为50μM；只含有罗丹明123溶液的 培养皿中，罗丹明123浓度为25μM；
含有混合溶液的培养皿中，探针浓度为50μM，罗丹明123浓度为2μM。37℃和pH值7.4
的条件下孵育30分钟，培养基冲洗2遍，加入新鲜培养基，在激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞形态。结果显示探针1、4、6、9和11与罗丹明123染色位置完全相同，并且可与罗丹明混合对细胞中的线粒体进行染色，说明探针1、4、6、9、11以及其与罗丹明的混合液可进行特异性的线粒体荧光标记。

[0124] 图2（a）为罗丹明123染色的Hela细胞图片，图2（b）为探针1染色的Hela细胞图片，图2（c）为罗丹明123和探针1混合液染色的Hela细胞图片；图3（a）为罗丹明
123染色的Hela细胞图片，图3（b）为探针4染色的Hela细胞图片，图3（c）为罗丹明123和探针4混合液染色的Hela细胞图片。

[0125] 4、细胞内线粒体示踪实验

[0126] 将HUVEC细胞接种于5个confocal小皿中，37℃、5体积%CO2培养12小时，分别更换含有探针1、4、6、9、11的新鲜培养基（探针终浓度50μM），37℃和pH值7.4的条件下孵育30分钟。清洗后加入新鲜培养基，在激光共聚焦扫描显微镜下持续观察30min，结构显示，细胞中的线粒体并不是固定不动的，而是不断变换着位置，由此说明探针1、4、6、9、11可用于细胞内线粒体示踪。

[0127] 图4（a）、图4（b）、图4（c）分别显示了探针1染色的细胞在第0、15min、30min的图片。

[0128] 5、线粒体膜电位检测

[0129] （1）将Hela细胞接种于10个confocal小皿中，37℃，5体积%CO2条件下在细胞培养箱中培养12小时，更换新鲜培养基。向两个培养皿中分别 加入探针1、4、6、9、11溶液以及探针1、4、6、9、11和线粒体膜电位抑制剂Valinomycin的混合溶液，其中，各探针的终浓度分别为50μM；抑制剂的终浓度分别为200ng/mL，37℃和pH值7.4的条件下孵育30
分钟，培养基冲洗2遍，加入新鲜培养基，在激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞形态。结果显示不加抑制剂的细胞样品可见明显的红色荧光，说明探针1、4、6、9、11在线粒体膜电位的驱使下大量累积在线粒体中，线粒体功能正常；在抑制剂的作用下，只有极微弱的荧光信号，几乎没有探针1、4、6、9、11累积在细胞线粒体中，说明线粒体膜电位几乎消失。上述结果表明，这些探针可以正确指示线粒体膜电位的降低。

[0130] 图5（a）显示了探针1染色的正常Hela细胞图片；图5（b）显示了探针1染色的线粒体膜电位抑制剂处理的Hela细胞图片。

[0131] （2）使用探针1、4、6、9和11（浓度5μM）混合100μM的H2O2（100μM的H2O2处理会引起线粒体膜电位的下降）处理Hela细胞，其它条件同上，使用荧光显微镜观察细胞形态和荧光变化。结果显示，随着处理时间的延长，细胞内荧光逐渐降低，说明这些探针可以正确反映细胞内线粒体膜电位的变化。

[0132] 图6（a）、（b）、（c）、（d）分别显示了探针11与100μM的H2O2的混合液处理Hela细胞在0、40min、80min和120min时间点细胞中的荧光变化。

[0133] 综上所述，采用本发明提供的聚集诱导发光荧光分子荧光探针具有对细胞和线粒体毒性低、发光稳定性好的优点，且可对线粒体进行有效的染色，同时可指示线粒体膜电位的高低，可用于长时间标记、跟踪细胞内线粒体，并可用于线粒体膜电位的检测。