多细菌制备物及获得其的方法

摘要

本发明涉及多细菌益生制备物，其包括乳酸细菌NBIMCC编号8720的加氏乳杆菌7/12、NBIMCC编号8722的植物乳杆菌F12和NBIMCC编号8721的瑞士乳杆菌Al的新菌株，并具有下列性质集合：抗氧化、降胆固醇效果、抗炎免疫调节效果、释放抑制血管紧张素转变酶（ACE，其负责高血压）的生物活性肽的能力。本发明的目标还是所述的乳酸细菌的益生菌株和开发的具有有用性质的细菌产品。纳入的NBIMCC编号8720的益生菌株加氏乳杆菌7/12具有一些性质：对结肠上皮层的强粘附、降低胆固醇的能力和通过降低促炎性细胞因子白介素‑8的水平的抗炎效果。本发明涉及乳酸细菌菌株和细菌剂在生产意图影响人和动物健康的起子培养物、食品添加剂、食品、功能性产品和药学制备物中的用途。

权利要求

1.多细菌制备物，其特征在于其由NBIMCC编号8720的加氏乳杆菌7/12 (Lactobacillus gasseri 7/12)、NBIMCC编号8722的植物乳杆菌F12 (Lactobacillus plantarum F12)、NBIMCC编号8721的瑞士乳杆菌Al (Lactobacillus helveticus Al)的菌株的组合组成，所述组合包含如下以cfu/g测量的活细胞：加氏乳杆菌7/12至少109，瑞士乳杆菌Al至少2x109和植物乳杆菌F12至少9x109且具有抗氧化效果、抗炎免疫调节效果、降胆固醇效果和降压效果。

2.根据权利要求1的多细菌制备物，其特征在于NBIMCC编号8721的瑞士乳杆菌Al 具有肽序列Ala-Leu-Pro-Met。

3.根据权利要求1的多细菌制备物，其特征在于其形式——冻干物或液体培养物。

4.细菌制备物，其特征在于其由选自NBIMCC编号8720的加氏乳杆菌7/12和NBIMCC编号

8722的植物乳杆菌-F12的一个菌株组成。

5.根据权利要求4的NBIMCC编号8720的菌株加氏乳杆菌7/12的细菌制备物，其具有降胆固醇活性和抗炎免疫调节活性。

6.根据权利要求4的NBIMCC编号8722的菌株植物乳杆菌F12的细菌制备物，其具有抗氧化活性。

7.根据权利要求4的细菌制备物，其特征在于其形式——冻干物或液体培养物。

8.权利要求1的多细菌制备物在制备益生菌剂中的用途。

9.根据权利要求8的用途，其中所述益生菌剂是用于人和动物的食品添加剂和/或以任何形式包括在食品中。

10.根据权利要求8的用途，其中所述益生菌剂用于获得用于食品生产的起子培养物。

11.根据权利要求8的用途，其中所述益生菌剂是在意图影响人和动物的健康的功能性产品和药学制备物的组合物中。

12.根据权利要求4的细菌制备物作为益生菌剂的用途。

13.根据权利要求12的用途，其中所述益生菌剂用于人和动物的食品添加剂和/或以任何形式包括在用于人和动物的食品中。

14.根据权利要求12的用途，其中所述益生菌剂用于获得用于食品生产的起子培养物。

15.根据权利要求12的用途，其中所述益生菌剂在意图影响人和动物的健康的功能性产品和药学制备物的组合物中。

说明书

多细菌制备物及获得其的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，并且具体是乳酸细菌的益生株和通过它们获得的多细菌制备物。本发明还涉及制备物的复合有益健康效果和其作为膳食补充剂用于预防各种疾病的用途。

背景技术

[0002] 益生菌剂是活的可食用的微生物，其对于人健康具有积极效果。大部分益生菌剂是乳酸杆菌(lactobacilli)和/或双歧杆菌(bifidobacteria)。它们是非致病性细菌，能够在胃肠道上形成集落。已经证实乳酸杆菌和双歧杆菌是人微生物区系（微生物群）的主要组分。两个属的代表可以在结肠的粘膜层形成集落并影响肠生态系统的平衡维持。它们的存在伴随有益的健康效果例如抑制有害微生物、改善消化、免疫刺激效果、减少乳糖不耐性、减少血清胆固醇、预防腹泻和其它。乳酸杆菌的一些菌株产生生物活性肽，其具有降压效果以及钙和镁吸收效果。通常，益生效果不涉及乳酸杆菌和双歧杆菌属，但是是菌株特异性的。为了改善有益效果，在研究期间进行物种和菌株的准确鉴定。消费包含益生菌株的产品后登记了很多有益健康效果。下面列举了最重要的益处：

[0003] 通过刺激有益细菌并抑制有害微生物对肠道菌群的有利效果

[0004] 乳酸细菌的几个菌株产生细菌素，其破坏有害微生物，例如酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutiricum）、金黄色葡萄球菌（St. aureus）、单核细胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）和其它。

[0005] 短链脂肪酸的产生

[0006] 在健康人体内，每天产生约400mM短链脂肪酸，作为最重要的是：乙酸、丙酸和丁酸。它们有利地影响肠中的pH。发现丁酸通过抑制亚硝胺和过氧化氢的遗传毒性效果而减少发展结肠癌的风险。并且，丁酸诱导结肠肿瘤细胞中的凋亡。脂肪酸减少促炎性细胞因子TNFα、IL-1β、IL-6的表达。

[0007] 通过免疫调节刺激免疫应答和增强遗传免疫

[0008] 益生细菌调节必需和过量的免疫应答间的精巧平衡。导致IL-10诱导刺激的益生菌株适合用于遭受结肠炎症疾病的人。免疫调节效果是菌株特异性的。检查了乳酸杆菌和双歧杆菌的几个菌株，其中一些导致TNFα的减少和IL-10的增加（McCarthy, 2003）。

[0009] 在宏观生物体内营养吸收的改善

[0010] 乳酸杆菌和双歧杆菌具有β-半乳糖苷酶活性，从而降低乳糖浓度。这对于遭受乳糖不耐性的人是有益的。通过一些双歧杆菌菌株的B-复合维生素的产生是显著的并且在上面提到。乳酸杆菌通过其蛋白水解复合物促成蛋白降解并从而促进人的蛋白吸收。一些双歧杆菌可以同化无机氮，并随后可以降低氨浓度（其在高水平可以是致癌的）。

[0011]  抗氧化效果 在组织中氧自由基增加积累可以导致对细胞的损伤。活性氧的形成可以伴随多种因素，例如某些药物的使用、增加的乙醇消耗、压力和其它因素。增加的氧化伴随一些消化病症，以及老年、动脉硬化、癌性疾病等。机体具有几个针对毒性氧的防御，但是重要的是消耗抗氧化剂以改善这些系统的功能发挥。一些微生物具有抗氧化酶，例如SOD（超氧化物歧化酶）、过氧化氢酶酶类、谷胱甘肽还原酶酶类和其它。

[0012] 血清胆固醇的减少

[0013] 胆固醇通过肠细胞合成并释放到肠内。另一部分胆固醇来自胆汁分泌和食物。微生物群影响胆固醇水平。一些微生物降解胆汁盐，利用牛磺酸和甘氨酸。因此，胆汁盐的循环受阻，并且肝动员额外胆固醇用于新胆汁盐的合成，这导致血清胆固醇的降低。Gilliland等（1985）研究了菌株嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）同化胆固醇的能力。

[0014] 具有降压活性的生物活性肽和改善钙和镁吸收的肽的分泌。

[0015] 通过分解乳蛋白，乳酸细菌放出低分子肽。发现它们的一些抑制血管紧张素转变酶（ACE）。ACE从血管紧张素I切割二肽，将其转化为血管紧张素II（诱导醛固酮产生的血管收缩剂），这导致钠离子浓度和血压升高。研究最多的效果是寡肽Ile-Pro-Pro和 Val-Pro-Pro的降压效果，其在瑞士乳杆菌（L. helveticus）的某些菌株的蛋白水解活性期间释放。它们诱导ACE的强抑制。降压效果在临床实验中得到证实。

[0016] 目前有几种商品化的益生菌剂成功地使用，例如鼠李糖乳杆菌GG（L. rhamnosus GG）(Saxelin M. Lactobacillus GG - a human probiotic strain with thorough clinical documentation. Food Rev Int 1997, 13:293-313)。另一种工业化的益生菌剂是发酵乳杆菌39（L. fermentum 39），用于在菌群失调期间稳定肠内微生物区系（1）。

[0017] 存在细菌菌株发酵乳杆菌ME3，具有SOD活性和针对病原的活性（Mikelsaar 等, 2007）。

[0018] 一个专题的问题是乳酸细菌的益生菌株的鉴定和选择，以及使用它们用于制备具有许多有用的性能，如在胃肠道中高生存、抗氧化效果、对结肠上皮层强烈粘附、减少胆固醇的能力、免疫调节和抗炎效果、ACE抑制活性的多细菌产品。

[0019] 发明公开

[0020] 本发明的目标是鉴定和选择具有有益健康性质的益生乳酸细菌的菌株，其应当用于建立具有功能效果组合的益生制备物。

[0021] 本发明的目标，益生制备物，是由乳酸细菌的三种益生菌株组成的多细菌组合：加氏乳杆菌7/12（Lactobacillus gasseri 7/12）以编号8720保藏在国立银行工业微生物和细胞保藏中心（NBIMCC）、植物乳杆菌F12（Lactobacillus plantarum F12）以编号8722保藏在NBIMCC和瑞士乳杆菌Al（Lactobacillus helveticus Al）以编号8721保藏在NBIMCC。所述产品具有一些健康益处：抗氧化效果；由于水解胆汁盐和直接吸收胆固醇的胆固醇浓度降低；通过降低促炎性细胞因子“白介素-8”的水平的抗炎免疫调节效果；释放抑制负责高血压的酶（ACE）的生物活性肽的能力。

[0022] 本发明的目标还有NBIMCC编号8720的加氏乳杆菌7/12 、NBIMCC编号8722的植物乳杆菌F12和NBIMCC编号8721的瑞士乳杆菌Al的新菌株和它们的有益性质。

[0023] NBIMCC编号8722的植物乳杆菌F12具有抗氧化活性和对上皮细胞的显著粘附。

[0024] NBIMCC编号8720的益生菌株加氏乳杆菌7/12具有下列有用性质的集合：在胃肠道中的高存活、对结肠上皮层的强粘附、降低胆固醇的能力和通过降低促炎性细胞因子“白介素-8”的水平的抗炎免疫调节效果。

[0025] NBIMCC编号8721的益生菌株瑞士乳杆菌Al具有强抗ACE效果。

[0026] 本发明的目标是新的益生菌株和益生多细菌制备物在药学和食品工业中的用途以预防社会显著的疾病，例如：高血压，动脉硬化和高胆固醇血症，肠道中的免疫削弱和炎症过程，肠道微生物区系中平衡扰动。

[0027] NBIMCC编号8720的加氏乳杆菌7/12和NBIMCC编号8722的植物乳杆菌F12分离自健康志愿者的肠道。NBIMCC编号8721的瑞士乳杆菌Al分离自自制的白奶酪，这证明了它们的GRAS状态（通常认为安全）。三个菌株的种隶属关系和菌株身份，通过精确的基于DNA的方法（2）16S核糖体基因测序，ARDRA，脉冲电泳，AFLP建立。

[0028] 使用API 50 CHL系统（BioMerieux, France）进行三个菌株的表型鉴定。

[0029] 菌株通过AFLP和脉冲电泳的方法分子鉴定。用于三个菌株鉴定和获得它们菌株特异性DNA概况的两种主要的分子方法描述于上述文章（Dimitrov Zh. 等, 2008）。 在图1中表示NBIMCC编号8722的植物乳杆菌F12的脉冲电泳DNA概况，在图2中——NBIMCC编号8720的加氏乳杆菌7/12的脉冲电泳DNA概况并且在图3中——NBIMCC编号8721的瑞士乳杆菌Al的脉冲电泳DNA概况。

[0030] NBIMCC编号8722的植物乳杆菌F12形成大小1-2mm的白色S菌落。细菌细胞是短的（0.9-1.2 X 3-8 um）具有圆角。主要的培养基是MRS液体培养基和琼脂（OXOID）。根据伯杰氏手册（2009）通过使用Api Web数据库（API 50CHL条）和MicroLog M5.1.1数据库（Biolog AN 微孔板）进行鉴定。ARDRA概况对于菌株植物乳杆菌是典型的。可溶的细胞蛋白的概况与植物乳杆菌（ATCC）的概况相同。以0.1%接种后，其在MRS液体培养基中生长。培养在37℃进行约18-24小时。液体培养基和大气在培养期间不需要任何初步厌氧化。菌株在MRS琼脂上在厌氧环境中发展48小时。

[0031] NBIMCC编号8720的加氏乳杆菌7/12形成大小1-2mm的白色S菌落。细菌细胞是短的（0, 6-0.8 X 3.0-5.0 um）具有圆角。主要的培养基是MRS液体培养基和琼脂（OXOID）。根据伯杰氏手册（2009）通过使用Api Web数据库（API 50CHL条）和MicroLog M5.1.1数据库（Biolog AN 微孔板）鉴定菌株。ARDRA概况对于加氏乳杆菌菌株是典型的。可溶的细胞蛋白的概况与加氏乳杆菌33323（ATCC）的概况相同。以0.1%接种后，加氏乳杆菌7/12在MRS液体培养基上生长。培养在37℃进行约18-24小时。液体培养基和大气在培养期间不需要任何初步厌氧化。菌株在MRS琼脂上在厌氧环境中发展48小时。

[0032] NBIMCC编号8721的瑞士乳杆菌Al形成大小1-2mm的白色R菌落。细菌细胞具有3,0-5,0 um的长度。基本培养基是MRS液体培养基和琼脂（OXOID）和用于微生物学目的的无菌脱脂乳，10%干物质（OXOID）。根据伯杰氏手册（2009）通过使用Api Web数据库（API 50CHL条）和MicroLog M5.1.1数据库（Biolog AN 微孔板）鉴定菌株。ARDRA概况对于瑞士乳杆菌是典型的。可溶的细胞蛋白的概况与瑞士乳杆菌15009（ATCC）的概况相同。以0.1%接种后，瑞士乳杆菌Al在MRS液体培养基上生长。培养在37℃进行约18-24小时。液体培养基和大气在培养期间不需要任何初步厌氧化。菌株在MRS琼脂上在厌氧环境中发展48小时。以0.1%接种并在37℃培养18-24小时后，该菌株在无菌脱脂乳上发展。

[0033] NBIMCC编号8722的植物乳杆菌F12的功能性质

[0034]  抗氧化效果的确定

[0035] 菌株植物乳杆菌F12具有抗氧化性质并且就此其选自多于400种乳酸杆菌中。为了进行此关于抗氧化性质的选择，菌株在MRS液体培养基中孵育24小时并在4℃下在3500g离心10分钟。用盐水溶液清洗后，细胞重悬在1.15%KCl中到在1ml中1x109个细胞。细胞混悬液在冰浴中接受超声（Branson B-12 Sonic power Company）5分钟，然后在-20℃下10分钟。混悬液在4℃下在10000g离心10分钟。上清液用作无细胞提取物。确定了三种类型的活性：

[0036] -总抗氧化活性ORAC

[0037] 用于确定总抗氧化活性的主要方法是ORAC（氧化自由基吸收能力）。结果显示在109微生物细胞的TROLOX等效物中。使用Cao等（1995）的方法。原理如下：底物OI-藻红蛋白（Sigma Chemical Co.）通过自由基产生剂2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（AAPH；Waco Chemical USA）接受氧化剂攻击。通过在200ml 0.2M磷酸缓冲液（储备溶液）中溶解5mg物质制备标准溶液TROLOX（ 6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸，Trolox；Aldrich）。
通过混合1ml的储备溶液与9ml磷酸缓冲液获得工作溶液。

[0038] 在存在具有抗氧化性质的样品的情况下，藻红蛋白的氧化在一定程度上减少。分别使用535nm（激发）和595nm（发射）长度的波测量相对荧光，进行60分钟的时期。使用下列公式：

[0039] ORAC值=X K（S样品-S空白）/（Strolox-S空白）

[0040] 其中X是以微升计的样品体积，并且K是稀释系数。S-荧光曲线的面积。

[0041] -通常的抗自由基活性

[0042] 对每个菌株基于化合物1,1-二苯基-2-苦味酰肼（DPPH）的染色强度的减少程度确定捕获游离自由基的物质。自由基捕获活性的强度与DPPH的紫色的褪色程度成正比。与相应菌株一起发酵的乳离心并且用二乙醚萃取上清液。该过程随后是醚层蒸发并在甲醇中溶解残余物。0.1ml体积的此溶液与1.4ml的DPPH溶液（40μg/ml，甲醇中）混合。自由基捕获活性定义为空样品和样品之间在517nm吸收中的差异[A517 (空) - A517 (样品)]。

[0043] -SOD活性

[0044] 根据Chang & Hasan, 1997进行测试。菌株在液体培养基（对于链球菌是M17，对于乳酸杆菌是MRS）上生长并且孵育后，离心培养物，用含0.1mM EDTA，pH7.8的磷酸缓冲液清洗，重悬在相同的缓冲液中并然后超声。在17000g离心并对上面的磷酸缓冲液透析24小时。在20000g再次离心。根据Lowry法确定无细胞提取物的总蛋白浓度。使用专门的测试试剂盒（SIGMA）根据制造商的说明定义两种酶活性。通过细胞色素C法在具有黄嘌呤氧化酶的缀合的酶系统中确定SOD。原理是：当细胞色素C被还原时，黄嘌呤氧化酶氧化黄嘌呤。在存在具有SOD活性的样品的情况下，细胞色素C的还原在一定程度上被抑制，因为两个质子结合来自SOD的超氧化物自由基而非转移到细胞色素C上。

[0045] 表1表示不同抗氧化活性的确定结果：通过ORAC测试的总抗氧化活性，总抗自由基活性和SOD活性。

[0046] 表1

[0047]

[0048] 在菌株植物乳杆菌F12的完整细胞中和无细胞提取物中均发现显著的总抗氧化活性。关于SOD活性，此菌株的无细胞提取物超越所有测试的来自不同细菌物种的乳杆菌。

[0049] 对上皮细胞粘附的确定

[0050] 上皮细胞系Caco-2和HT29在加入10%胎牛血清的DMEM培养基（Dilbecco's modified Eagle's medium, Gibco, UK）中作为单层培养。孵育温度是在含5%CO2的水饱和的空气中37℃。当约90%的形成单层时，细胞通过用0.25％胰蛋白酶和10mM EDTA溶液，在37℃下孵育10分钟经历传代。为了确定粘附，真核细胞以2xl05细胞/ ml的浓度接种于6孔集群培养皿。培养基每2天更换总共10天，期间单层形成（3-4天）并且细胞受体逐渐成熟。粘附后，单层用PBS缓冲液清洗两次。在不含抗生素的2mlDMEM中108个细胞/ml浓度的细菌培养物添加到单层。在含5%CO2的饱和空气中37℃下进行孵育60分钟。然后孔用PBS清洗5次并用甲醇固定3分钟。之后进行革兰氏染色和粘附的显微镜评价。计数粘附到20个上皮细胞的细菌数目。测试包括10个显微镜视野的报告。

[0051] 图4显示菌株植物乳杆菌F12对上皮细胞Caco-2的粘附图片。表示为粘附到真核细胞上细菌平均数目的菌株的粘附结果显示在表2。该测试进行3次以分别评价在细胞系Caco-2和HT-29上的粘附，并且结果被平均。

[0052] 表2 菌株 粘附到Caco-2真核细胞的细菌的平均数目 粘附到HT-29真核细胞的细菌的平均数目植物乳杆菌F12 25 29

[0053] NBIMCC编号8720的菌株加氏乳杆菌7/12的功能性质

[0054] 对上皮细胞粘附的确定

[0055] 方法显示在上面。图5显示菌株加氏乳杆菌7/12对上皮细胞Caco-2的粘附照片。表示为粘附到真核细胞上细菌平均数目的菌株的粘附结果显示在表3。该测试进行3次以分别评价在细胞系Caco-2和HT-29上的粘附，并且结果被平均。

[0056] 表3 菌株 粘附到Caco-2真核细胞的细菌的平均数目 粘附到HT-29真核细胞的细菌的平均数目加氏乳杆菌7/12 20 22

[0057] 抗炎免疫调节效果的确定

[0058] 在炎症性肠病（IBD）的人中促进炎性细胞因子的诱导是高度不希望的。炎性细胞因子的合成通过信号肽白介素10（IL-10）抑制，其通过幼稚T辅助细胞或巨噬细胞产生。证明人单核细胞系U-937不仅对于评价细胞毒性TNFα和IL-1的诱导，而且在确定信号肽IL-10的诱导中都是合适的。

[0059] 抗原呈递细胞的两种信号肽TNFα和IL-10的表达的定量确定用于测量免疫调节效果：人单核细胞系U-937（ATCC）的分化的巨噬细胞。细胞系的维持在37℃和5%CO2中在含有10%胎牛血清（ATCC30-2020）、4.5g/l葡萄糖、10mMHEPES、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、
1.5g/l碳酸氢钠、100 U/ ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基（ATCC30-2001）上完成。维持在每毫升2 x 105-1 x 106个细胞范围内。达到约1 x 106的密度后，细胞离心并更新培养基。通过流式细胞仪报告的细胞含量是2x 105。在48孔集群培养皿中，每毫升1 x 
106个细胞（对于孔是5 x 105）可以在5 μg/ml PMA（佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯，SIGMA）的帮助下分化为巨噬细胞，所述PMA添加到在CO2培养箱中的生长培养基中48小时。
分化的粘附的巨噬细胞用PBS缓冲液（Dulbecco磷酸盐缓冲盐水，GibcoBRL）清洗两次，并用不含PMA的新鲜培养基孵育48小时。吸干具有粘附的巨噬细胞的各孔中的培养基后加入每ml 1×106浓度的0.5ml的细菌细胞，悬浮在巨噬细胞的生长培养基中。细胞在CO2培养箱中孵育24小时。

[0060] -对乳酸细菌的信号肽TNFα的诱导的评价通过夹心ELISA完成。孵育结束时，收集上清液并离心以清除细菌和人细胞。200μl获得的上清液用于TNFα的确定，通过专门的R&D Systems的试剂盒（人TNF-a/TNFSFIA免疫测定, Cat. # DTA00C），按照制造商的说明进行。简言之：免疫皿覆盖抗人TNF-α的单克隆抗体，其以特殊方式持有TNF-α。清洗后，孔用与酶辣根过氧化物酶连接的抗TNF-α的多克隆抗体处理。之后添加底物，过氧化氢和四甲基联苯胺，并且在室温酶反应20分钟后，在黑暗处用2N硫酸终止反应。测量在450nm处的吸收。对于TNF-α浓度的计算，使用标准品并绘制标准曲线。

[0061] -对乳酸细菌的信号肽IL-6的诱导的评价通过夹心ELISA完成。检测的原理与上述类似。在评价期间使用分析型ELISA试剂盒并然后根据制造商的说明进行定量评价。

[0062] -对乳酸细菌的信号肽IL-10的诱导的评价通过夹心ELISA完成。在评价期间使用分析型ELISA试剂盒并然后根据制造商的说明进行定量评价。

[0063] 对每个分离的菌株的五种细胞因子TGF-β、IL-8、IL-6、IL-10和TNFα的评价进行3次。表4给出了对于5种细胞因子的平均诱导结果。在其它受试者中，具有中等粘附的菌株加氏乳杆菌7/12是最成功的抗炎菌株。其在IL-10和TNF-α之间具有良好的关联，IL-8和TGF-β的显著减少，并且没有显著的IL-6的诱导。促炎性细胞因子IL-8通过上皮细胞合成。对于评价使用细胞系Caco-2和HT-29。IL-8的水平增加可以导致中性粒细胞的活性增加并因此导致结肠中的炎症问题。能够降低IL-8水平的菌株的发现对于建立用于预防胃肠道炎症疾病的细菌制备物是至关重要的。在这方面菌株加氏乳杆菌7/12是有价值的。用加氏乳杆菌7/12对上皮细胞的刺激结果显示在表5中。

[0064] 表4

[0065]

[0066] 表5

[0067]

[0068] 降低胆固醇水平的能力的确定

[0069] -胆汁盐水解酶（BSH）活性

[0070] 菌株在如上文给出的液体培养基中的最佳条件下生长，但在培养液中添加两个最重要的胆汁盐：牛磺胆酸钠（TCA）和甘氨胆酸钠（GCA）。盐的浓度是1mM。它们在通过对液体培养基微滤灭菌后添加。接种物是1%并且孵育时间是24小时。未接种的液体培养基用作对照。BSH活性测量为去缀合的（deconjugated）纳摩尔TCA和GCA，进行1分钟。确定方法是高效液相色谱（HPLC）。使用的柱子是 Ultrasphere ODS柱，80埃，15cm，3μm的填料颗粒直径。所使用的配置是SHIMADZU UV检测器，在210nm。在梯度反相模式下检测游离的和缀合的胆汁酸。溶剂A是在0.03M乙酸钠中的65%甲醇，用磷酸调节在pH4.3。溶剂B是具有HPLC品质的甲醇。洗脱程序是在15％洗脱液B进行8分钟的等梯度步骤，并然后经过17分钟到85％的线性梯度。该过程随后是5分钟的在85%的等梯度步骤。注射体积是10μl。BSH活性值表示为每分钟和24小时孵育时间从1010个细胞释放的微摩尔胆碱酸（CA）。

[0071] -胆固醇的直接减少

[0072] 菌株以1%的浓度接种在各自的培养基中24小时。液体培养基包含0.3%Oxgal和每ml 100μg水溶的胆固醇（胆固醇-PEG600, SIGMA）。孵育后，细胞通过离心沉淀并且0.5ml上清液用4ml甲醇的2M KOH通过在80℃下加热20分钟处理。其用5ml己烷萃取并且4ml的己烷层被转移到试管，并在60℃下用氮气蒸发。干燥的残留物溶解在0.5ml异丙醇并且胆固醇含量用Boeringer Manhaim的分析试剂盒确定。胆固醇减少的程度基于未接种的对照培养基确定。

[0073] 检查了胆固醇减少相关的两种主要的活性——胆固醇水平的直接降低和作为针对胆汁盐的去缀合活性（BSH）的结果的血清胆固醇的间接胆固醇减少。在胆固醇的直接清除中，主要由于吸附到微生物的细胞壁组分上，如方法学部分中所述测量残留的胆固醇。使用酶学测试进行胆固醇浓度的测量。测量进行三次并且结果进行平均。表6显示表示为胆固醇的百分比减少的直接抗胆固醇活性的结果。

[0074] 表6 菌株 %胆固醇减少
加氏乳杆菌7/12 36.2

[0075] BSH去缀合活性间接影响血清胆固醇水平。具有BSH活性的菌株水解胆汁盐并且去缀合的胆汁盐然后转移到肠道的出口。胆汁盐在体内被回收，并且在其浓度在肝脏中减少后，胆固醇的一部分切换到胆汁酸和随后胆汁盐（胆汁酸缀合氨基酸牛磺酸和甘氨酸）的产生。尽管所有，血清胆固醇水平预期下降。在表7中给出了加氏乳杆菌7/12的BSH活性的结果，经过三次测试并平均化结果。

[0076] 表7 菌株 %胆汁盐去缀合
加氏乳杆菌7/12 60.1

[0077] NBIMCC编号8721的瑞士乳杆菌Al的功能性质

[0078] 分泌生物活性ACE抑制肽的能力的确定

[0079] -ACE抑制活性

[0080] 纯化的菌株以0.1%接种物在9%脱脂乳中在37℃孵育18小时。用50%乳酸调整pH到4.3后，样品离心（5000g，10分钟）。上清液加载（dosed）到反相预装柱（cartridge）上并且用水清洗。此过程随后用在0.1%三氟乙酸中的60%乙腈洗脱，并然后蒸发并重构获得的提取物。分析提取物或其稀释的ACE抑制。

[0081] 制备总肽提取物。通过常规测试进行酶学反应，但使用肽提取物的不同稀释，同时它们的体积是20 μl。酶溶液是40μl，具有0.1U/ml的活性。底物马脲酰组氨酰亮氨酸（hipuril-histidil-leucine）溶于pH为8.3的硼酸盐缓冲液，并具有190μl的体积。底物的终浓度是6mM，并且氯化钠的浓度是300mM。反应在37℃进行30分钟。捕捉（seizing）用100微升4N HCl进行，并且释放出的马尿酸的萃取用1ml乙酸乙酯完成。溶剂蒸发后，残留物溶解在1ml水中并且在228nm进行分光光度法测试。

[0082] ACE酶的抑制百分比通过下式报告：

[0083]

[0084] 其中A是在上面反应下的吸收，C是不含酶的吸收，B是不涉及肽提取物的吸收。

[0085] 构建图形并在横坐标上显示肽提取物的微升数——20，10，5，和在纵坐标上显示抑制百分数。抑制效果的强度在图形上被认为是导致50%ACE酶抑制的肽提取物的体积。更小的体积表明产品更高的ACE抑制能力。表8提供了菌株瑞士乳杆菌Al的重要的肽酶活性，其主要基于此菌株释放生物活性肽的能力。表9提供瑞士乳杆菌Al的ACE抑制活性，以ACE的%抑制四舍五入到最近的整数。

[0086] 表8

[0087]

[0088] 表9 菌株 %ACE抑制
瑞士乳杆菌Al 88%

[0089] 对于瑞士乳杆菌Al绘制图形（图5），其定义了所分析的上清液1/2和1/4稀释的抑制效果。主要目标是检测对样品稀释的抗ACE效果的强度。横坐标上显示实验中使用的上清液的微升数，并且纵坐标显示ACE抑制的百分比。

[0090] 结果显示菌株瑞士乳杆菌Al具有强抗ACE效果。-来自菌株瑞士乳杆菌Al的ACE抑制肽的序列的确定

[0091] 浓缩的肽提取物的制备

[0092] 每个菌株的上清液通过具有5000Da分子量截留的专门的超滤预装柱接受离心超滤。低分子量疏水和中等疏水肽（通常在其中寻找抗ACE的代表物）在反相预装柱上浓缩。具体是，超滤后样品添加三氟乙酸到0.1%并且混合物经过预装柱。肽被保留。用0.1%TFA清洗后，接着用在0.1%TFA中的60%乙腈洗脱低分子量肽。蒸发后，肽重悬在0.1%TFA中的10%乙腈中并加载到制备型反相HPLC柱Nucleosil C18上。高效液相色谱装置SHIMADZU配备有两个泵、具有保持特定温度的能力的HPLC柱模块、吸收检测器和级分收集器。

[0093] 为了证实活性，测量所有浓缩物的抗ACE活性。

[0094] 肽的粗分级在色谱分离后浓缩。

[0095] 如上述注射入HPLC柱的样品接受反相梯度分级。乙腈梯度是在0.1%TFA中从0%到80%。在214nm波长检测肽。通过级分收集器捕获1ml的级分。粗分级后，这些级分在真空离心中蒸发并重悬在0.1%TFA中。测试级分的抗ACE活性以选择那些具有该活性的级分。显示菌株瑞士乳杆菌Al的肽浓缩物的粗分级的色谱图显示在图6中。

[0096] 对于在高效反相色谱之后收集纯化的肽对所选择的级分再分级。以与粗分级相同的原理进行有条不紊的精细分级——即反相，但是梯度的斜率更平缓。对于菌株瑞士乳杆菌Al的级分的梯度条件是25-35%乙腈。所使用的柱子是半制备型Nucleodur Sphinx。

[0097] 图7中显示了对于菌株瑞士乳杆菌Al的预选择的粗肽级分精细反相再分级样品的色谱图。对ACE抑制进行酶学测试后活性抗ACE级分用粗线标记。对于所选择的肽级分的纯化的最终步骤是通过离子交换HPLC柱纯化。柱子是具有以锂形式的苯磺酸离子活性基团的高度酸性阳离子交换柱。通过在柠檬酸缓冲液中以pH3.0到9.0的pH梯度实现洗脱。

[0098] 图7中显示对于菌株瑞士乳杆菌Al的预选择的活性抗ACE级分离子交换处理的色谱图。粗线标记具有抗ACE活性的单个肽。

[0099] 肽测序

[0100] 测序的原理是用异硫氰酸苯酯人工测序的经典方案：从异硫氰酸苯酯开始：肽氨基末端的初始衍生化；使用100%三氟乙酸（TFA）切掉衍生的N末端氨基酸（CA）；通过将衍生的N末端氨基酸从残留肽提取分离；通过用40%（TFA）处理将N末端氨基酸转化成苯硫脲衍生物；HPLC分析PTH-氨基酸；对新的N末端氨基酸的下一循环。在小的疏水肽的情况下，通过将衍生的N末端氨基酸从残留肽提取分离的步骤是不可能的。这可以通过将肽的C末端初步固定在芳香胺-PVDF膜上完成。从而，肽可以从N末端测序到最后的C末端氨基酸。在通过用EDC（乙基-二甲基氨基丙基碳二亚胺）处理活化COOH末端和后续的活化的羧基与膜的芳香胺分子反应后可以从COOH末端固定肽。表10显示通过瑞士乳杆菌Al释放的抗ACE肽的序列[0101] 表10菌株 抗ACE活性% 肽序列
瑞士乳杆菌Al 78.0 Ala-Leu-Pro-Met

附图说明

[0102] 图1：用酶Xhol.水解后并以5伏/厘米脉冲1s-12s进行24小时的植物乳杆菌F12的脉冲电泳菌株特异性DNA概况。分子量标记-λ-DNA HindIII(0.1-200 kbp)。

[0103] 图2：用酶Apal.水解后并以5伏/厘米脉冲2s-28s进行24小时的加氏乳杆菌7/12的脉冲电泳菌株特异性DNA概况。分子量标记-λ-梯形DNA(50-1000 kbp)。

[0104] 图3：用酶Smal.水解后并以5.2伏/厘米脉冲5s-30s进行26小时的瑞士乳杆菌Al的脉冲电泳菌株特异性DNA概况。分子量标记-λ-梯形DNA(50-1000 kbp)和λ-DNA HindIII (0.1-200 kbp)。

[0105] 图4：植物乳杆菌F12对上皮细胞Caco-2的粘附。

[0106] 图5：瑞士乳杆菌Al的ACE抑制图。横坐标-μl肽提取物，纵坐标-%ACE抑制。

[0107] 图6：瑞士乳杆菌Al的肽浓缩物的粗分级。

[0108] 图7：对于菌株瑞士乳杆菌Al具有最高抗ACE活性的初步分级的肽级分的精细反相纯化。

[0109] 图8：对于菌株瑞士乳杆菌Al的前面的纯化循环的活性级分的离子交换纯化。具体实施方案

[0110] 包含NBIMCC编号8720的加氏乳杆菌7/12 、NBIMCC编号8722的植物乳杆菌-F12和NBIMCC编号8721的瑞士乳杆菌Al的冻干菌株的多细菌制备物。这三个菌株在实验室发酵室单独地生长，每个5升，以乳作为培养基进行生物量积累，所述培养基用碱性蛋白酶水解，补充有0.2%酵母自溶物用于营养目的（Springer Biotec），同时接种物的量是1%并且pH用氢氧化钠保持在5.7。继续孵育直至静止期开始。包含对于植物乳杆菌F12和瑞士乳杆菌Al约9 8
10 ，并且对于加氏乳杆菌7/12 2x10的富集的生物量的三种培养物，作为工业发酵剂接种到用碱性蛋白酶水解，通过补充有0.2%酵母自溶物用于营养目的（Springer Biotec）的乳培养基中，作为接种物的量是2%。pH用氢氧化钠维持在5.7。所获得的三种益生菌株的生物量混合物加载到工业冻干机。在-28到-29℃进行升华干燥。最终加热至多到30℃。残留湿度是4%。混合物在惰性（氮气）气氛中包装。在技术循环期间采取专门的措施以减少菌株的死亡。对发酵、冻干和包装的参数进行优化。通过现代分子生物学技术（实时PCR）控制菌株的存活和活性。益生效果的存在和强度用高精度的技术进行控制-高效液相色谱法（胆汁盐的水解，生物活性肽的分析）、气相色谱法（胆固醇减少活性的确定）、实时PCR（确定菌株的活力和其数量）、光谱设备（抗氧化活性的确定，免疫调节活性的检测）。

[0111] 即用的冻干的多细菌制备物包含至少下列的三种益生菌株的活细菌（每1g活细胞数）：109的加氏乳杆菌7/12、2x109的瑞士乳杆菌Al、9x109的植物乳杆菌F12。在表11中给出了确定特异性抗氧化活性例如：总抗氧化活性、总抗自由基活性、成品的SOD活性的结果。

[0112] 表11

[0113]

[0114] 在表12和表13中给出了通过108/ml制备物的细菌细胞诱导的人细胞系U-937和HT-29的细胞因子水平。

[0115] 表12

[0116]

[0117] 表13

[0118]

[0119] 表14中给出了多细菌制备物的抗胆固醇活性，涉及以百分比的胆汁盐水解和胆固醇降低的能力。

[0120] 表14 产品 %胆固醇降低 %胆汁盐去缀合
多细菌制备物 21.0 42.4

[0121] 表15中给出了制备物的ACE抑制活性。

[0122] 表15 产品 %ACE抑制
多细菌制备物 65%

[0123] 工业实用性

[0124] 多细菌制备物是冻干的膳食补充剂，具有适合于预防社会显著疾病如高血压，动脉硬化和高胆固醇血症，肠道免疫削弱和炎症过程，肠道微生物区系中平衡干扰的益生性质的独特组合。此产品的生产需要共享先进的工业设备和高技术研究设备。此产品生产的原理在实施例中描述。

[0125] 参考文献：

[0126] 1. PCT/SU89/00264, C12N1/20, A61K35/74, University of Tartu, 1991[0127] 2. Dimitrov Zh. 等, 2008.Comparative evaluation of three molecular typing methods in their applicability to differentiate Lactobacillus strains with human origin.World Journal of Microbiology and Biotechnology 24:1305-1312