鹅去氧胆酸在制备防治家禽禽流感药物上的应用

摘要

本发明提供了鹅去氧胆酸在制备防治家禽禽流感药物上的应用。发明人研究发现临床上用于胆结石治疗的鹅去氧胆酸体内外具有显著的抗流感及禽流感病毒作用，对感染禽流感病毒鸡具有显著的保护作用。本发明鹅去氧胆酸用于制备防治禽流感的药物，其药效成分明确、疗效稳定、质量可控，安全无毒。且有效成分鹅去氧胆酸主要通过调节宿主细胞的炎症信号通路发挥作用，因此不易导致流感病毒株产生耐药性。

权利要求

1.一种结构如下的鹅去氧胆酸在制备防治家禽禽流感药物上的应用：所述家禽禽流感是选自H9N2亚型和H5N1亚型在内的甲型流感病毒感染导致的家禽禽流感疾病。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为以鹅去氧胆酸作为有效成分配以辅助剂制成喷雾剂、注射液、水溶性粉或颗粒剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述家禽是包括鸡、鸭、鹅和鸽子在内的饲养禽类动物。

说明书

鹅去氧胆酸在制备防治家禽禽流感药物上的应用

技术领域

[0001] 本发明属于兽医药物领域，具体涉及鹅去氧胆酸在制备防治家禽禽流感药物上的应用。

背景技术

[0002] 家禽禽流感是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）引起的一种具有高度传染性的禽急性呼吸道疾病，具有传播快、高发病率和高死亡率等特点。禽流感疫情可导致野禽及家禽大批死亡，生产性能降低，禽肉蛋产品质量下降，严重制约养禽业的健康可持续发展。如2003年底源于东南亚的高致病性H5N1亚型禽流感病毒快速蔓延至世界3个洲15个国家和地区，使成千上万只家禽和野禽死亡。H9N2亚型禽流感病毒的毒力虽然比H5N1亚型低，但它近年来在家禽养殖场普遍存在，严重影响家禽的生长及产蛋等性能。禽流感还可跨越物种屏障，由禽感染给哺乳动物及人，给人类的生命健康造成威胁。如2003年的高致病性H5N1亚型禽流感导致全球近400人感染死亡，病死率高达60%。

[0003] 到目前为止，接种禽流感疫苗是预防家禽禽流感的基本手段，它可以预防同型流感病毒的感染，降低死亡率。然而，由于禽流感病毒的血清型众多、抗原极易发生漂移产生新的流行株，再加部分养殖场的环境较差、管理不善等原因，致使临床上接种禽流感疫苗后达不到预期的防治效果。同时，新的疫苗的研制及生产周期较长，一般至少需要4-6个月时间，往往滞后于病毒变异的速度，难以为新爆发的疫情及时提供疫苗（Bonhoeffer J,Bentsi-Enchill A,Chen R T,et al.Guidelines for collection,analysis and presentation of vaccine safety data in surveillance systems[J].Vaccine,2009,27(16):2289-2297.）。因此，禽流感的防治不能完全依靠疫苗预防。药物防治是禽流感防治不可或缺的重要手段。

[0004] 目前用于防治流感的药物十分匮乏。当前美国食品药品署（FDA）批准的四种抗流感药物可分为两类。一类是以流感病毒基质蛋白（M2）为靶标的抗流感病毒药物，主要有金刚烷胺和金刚乙胺，另一类是以流感病毒神经氨酸酶（NA）为靶标的抗流感病毒药物，主要有奥司米韦（商品名：“达菲”）、扎那米韦及帕拉米韦。而专门用于防治禽流感的药物目前还没有，我国没有批准任何可用于家禽禽流感防治的药物。目前应对禽流感疫情的措施是扑杀疫情区的家禽。虽然扑杀一定程度上可以快速控制禽流感疫情，但给养殖业者造成巨大经济损失，同时扑杀产生的大量动物尸体的处理及掩埋给环境带来不良影响。因此，研制开发新型高效防治禽流感药物迫在眉睫，刻不容缓。

[0005] 鹅去氧胆酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）是多种动物胆汁中均含有的初级胆汁酸，是鸡、鹅等家禽胆汁的主要活性成分。其化学名为：3α,7α-二羟基-5-β-胆烷酸。分子式：C24H40O4，分子量：392.57，为无色针状结晶，无臭、味苦，几乎不溶于水，易溶于乙醇、冰乙酸、微溶于氯仿。化学结构如下：

[0006]

[0007] CDCA主要作用是降低胆汁内胆固醇的饱和度，临床上主要用于治疗胆固醇型胆结石等。而在传统医学上，鸡胆汁多用于治疗呼吸系统疾病,如百日咳、气管炎、肺炎、喘息、咳嗽等。李培锋等曾证明CDCA具有显著的平喘和抗炎作用。其作用机制与CDCA能显著降低大鼠血清和气管组织中的NO含量及显著地降低小鼠气管和肺组织中的PGE2含量有关。（李培锋,关红,赵红霞,斯琴。鹅去氧胆酸的平喘及抗炎作用机理研究.中国中药杂志,Vol.29,Issue4:349-352）。他们还发现在体外CDCA对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。（李培锋，哈斯苏荣，关红，曹金山。鸡胆汁有效成份CDCA和T CDCA的提取及其抗菌作用研究。内蒙古农业大学学报，Vol21(4):68-71）。

[0008] 迄今为止，未见CDCA抑制流感病毒及用于防治禽流感的报道，也未见CDCA用于制备防治禽流感药物的发明专利申请。

[0009] 家禽胆汁中虽然含有鹅去氧胆酸，但动物自身的胆汁酸主要在肝肠中循环。郑瑞等的研究结果表明，小鼠灌喂同位素标记的鹅去氧胆酸后，其在胆汁、肠和胃及其内容物中的含量远远高于在其它组织中的分布（郑瑞，王振立，袁玲，李乃宽.鹅去氧胆酸在小鼠体内的吸收、分布和排泄的研究.药学学报，1981，Vol16(3):235-237）。虽然至今没有家禽肺组织中鹅去氧胆酸含量的报道，但由郑瑞的研究结果可以推测鹅去氧胆酸在家禽肺等呼吸道器官的含量极其低微。

发明内容

[0010] 为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供鹅去氧胆酸在制备防治家禽禽流感药物上的应用。

[0011] 为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

[0012] 一种结构如下的鹅去氧胆酸在制备防治家禽禽流感药物上的应用：

[0013]

[0014] 优选的，所述应用为以鹅去氧胆酸作为有效成分配以辅助剂制成的喷雾剂、注射液、水溶性粉或颗粒剂。

[0015] 优选的，所述家禽禽流感是包括H9N2亚型和H5N1亚型在内的甲型流感病毒感染导致的家禽禽流感疾病。

[0016] 优选的，所述家禽是包括鸡、鸭、鹅和鸽子在内的饲养禽类动物。

[0017] 本发明鹅去氧胆酸的分子式：C24H40O4，分子量：392.57，其化学名为：3α,7α-二羟基-5-β-胆烷酸。

[0018] 本发明的原理：从动物胆汁中寻找一种具有抗流感及禽流感病毒作用的有效成分鹅去氧胆酸，并探明其药理作用机制。通过试验得到鹅去氧胆酸在细胞和鸡体内有显著的抑制流感及禽流感病毒增殖作用，对感染禽流感病毒鸡具有显著保护作用，可用于制备防治家禽禽流感的药物。通过深入研究，发明人发现鹅去氧胆酸能抑制显著降低病毒感染诱导的细胞炎症因子的分泌，抑制病毒感染诱导激活的炎症信号通路，进而抑制病毒核蛋白(NP)的出核及病毒颗粒的组装，减少病毒在体内的增殖。因此，本发明阐明了鹅去氧胆酸抗流感病毒的作用机制。

[0019] 家禽胆汁中虽然含有鹅去氧胆酸，但动物自身的鹅去氧胆酸主要在肝肠中循环，在肺等呼吸道器官中含量极低微，而喷雾和注射等给药方式使该药能到达肺部，显著提高其在呼吸道系统中的浓度，因而起到防治禽流感作用。

[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

[0021] 本发明鹅去氧胆酸用于制备防治家禽禽流感的药物，药效成分及作用机制明确，质量可控，疗效稳定。鹅去氧胆酸医学临床上已被用于治疗胆结石，因此它在有效剂量范围内对人和动物安全。

[0022] 本发明药物鹅去氧胆酸主要通过调节宿主细胞的炎症信号通路发挥作用，因此不易导致禽流感病毒株产生耐药性。

附图说明

[0023] 图1是实施例1中鹅去氧胆酸（CDCA）在细胞中不同作用时间对H5N1亚型禽流感病毒增殖的抑制作用；

[0024] 图2是实施例2中不同浓度鹅去氧胆酸（CDCA）在细胞中对H9N2亚型禽流感病毒增殖的抑制作用；

[0025] 图3是实施例3中不同浓度鹅去氧胆酸（CDCA）在细胞中对H5N1亚型禽流感病毒增殖的抑制作用；

[0026] 图4是实施例5中不同浓度鹅去氧胆酸（CDCA）在细胞中对流感病毒核蛋白(NP)出核的抑制作用；

[0027] 图5是实施例6中不同浓度鹅去氧胆酸（CDCA）对流感病毒感染诱导A549细胞产生炎症因子IL-6的抑制作用；

[0028] 图6是实施例6中不同浓度鹅去氧胆酸（CDCA）对流感病毒感染诱导A549细胞产生炎症因子IL-8的抑制作用；

[0029] 图7是实施例6中不同浓度鹅去氧胆酸（CDCA）对流感病毒感染诱导A549细胞产生炎症因子TNF-α的抑制作用。

具体实施方式

[0030] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0031] 以下实施例中所用到的鹅去氧胆酸购自广州市药品检验所及绍兴依珂姆化工科技有限公司。

[0032] 实施例1鹅去氧胆酸在细胞中不同作用时间对H5N1亚型禽流感病毒增殖的抑制作用

[0033] 待A549细胞生长至单层后，加入已用基础培养基稀释好的H5N1毒株病毒液（含100TCID50），100μL/孔，37℃孵育1h，弃去病毒上清，PBS（磷酸盐缓冲液）液清洗一遍，加入50μg的CDCA，100μL/孔。实验同时设正常对照组（不加受试药物，不加流感病毒液）与流感病毒对照组（不加受试药物），每个受试浓度设三个平行。细胞继续培养，分别至24h、48h和72h时，终止培养，观察其病变状况后，于-80℃和4℃反复冻融细胞板三次，使细胞充分裂解，致使细胞内的病毒全部释放进入细胞上清，然后收集各孔上清液。
根据终点稀释法（Geiler J,Michaelis M,Naczk P,et al.N-acetyl-L-cysteine(NAC)inhibits virus replication and expression of pro-inflammatory molecules in A549cells infected with highly pathogenic H5N1influenza A virus[J].Biochem Pharmacol,2010,79(3):413-420.），将所收集的细胞上清用基础培养基10倍倍比稀释，加入生长至单层的MDCK细胞，继续置于培养箱内培养。培养72h后，观察其CPE程度。细胞出现病变程度按以下6级标准记录：“-”为细胞生长正常，无病变出现；“±”为细胞病变少于整个单层细胞的10%；“+”为细胞病变约占整个单层细胞的25%；“++”为细胞病变约占整个单层细胞的50%；“+++”为细胞病变约占整个单层细胞的75%；“++++”为细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。用Reed-Muench法计算出各个时间段内各试验组细胞培养液中的病毒滴度（TCID50）值。实验结果如图1所示，H5N1代表病毒感染对照组，CDCA代表鹅去氧胆酸处理组。图中，与病毒感染对照组比较，“*”表示差异显著（P<0.05）。从图1中可看到，本发明的药物鹅去氧胆酸在50μg/ml的浓度下A549细胞中不同作用时间对H5N1亚型流感病毒的增殖均有显著的抑制作用。

[0034] 实施例2A549细胞中不同浓度鹅去氧胆酸对H9N2亚型禽流感病毒增殖的抑制作用

[0035] 感染用的病毒为H9N2亚型流感病毒株，感染时间为2h，至药物作用48h时终止培养，其它实验步骤与实施例1相同。实验结果如图2所示，从图2中可看到，本发明的药物鹅去氧胆酸在12.5～50μg/ml的浓度范围内对细胞内H9N2亚型流感病毒的增殖有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。

[0036] 实施例3A549细胞中不同浓度鹅去氧胆酸对H5N1亚型禽流感病毒增殖的抑制作用

[0037] 实验步骤与实施例1相同，药物作用48h时终止培养，测定病毒滴度值。实验结果如图3所示，从图3中可看到，本发明的药物鹅去氧胆酸在12.5～50μg/ml的浓度范围内对细胞内H5N1亚型流感病毒的增殖有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。

[0038] 实施例4鹅去氧胆酸对感染H9N2亚型禽流感病毒鸡只的保护作用

[0039] 10日龄鸡胚接种H9N2亚型禽流感病毒，2天后收集鸡胚尿囊液，用做攻毒感染鸡只病毒液。试验鸡为15日龄H9N2抗体阴性岭南黄鸡，每只鸡翅下肌肉注射0.4mL病毒尿囊液，建立鸡只感染H9N2禽流感病毒疾病模型。感染组一般在第三天部分鸡开始出现症状，表现为：采食量减少，体重增长慢；精神不振、沉郁，羽毛蓬松，消瘦，缩颈，呆立；喉头、鼻腔有时流出分泌物，鼻窦肿胀；眼结膜发红，流出少量分泌物；张口呼吸或呼吸困难，甩鼻，肿眼或者肿头，鸡冠和肉垂发绀。并且在气温较低（<10℃）情况下部分鸡只死亡。

[0040] 取鹅去氧胆酸20g，用100mL5%的碳酸氢钠水溶液溶解。用生理盐水将该溶液稀释至鹅去氧胆酸质量浓度为5%的溶液，用于鸡腹腔及皮下注射。用水将该溶液稀释至鹅去氧胆酸质量浓度为5%的溶液，用于喷雾给药。喷雾给药在一带有雾化装置的密闭的塑料箱中进行。

[0041] 鹅去氧胆酸在感染病毒当天开始给药，连续给药5天，试验至第11天结束。结果表明不同给药方式可不同程度地保护感染鸡只，显著降低鸡只死亡率，抑制病毒感染导致的鸡只体重减轻，给药方式、剂量及试验结果详见表1。

[0042] 表1鹅去氧胆酸不同给药方式对感染H9N2亚型禽流感病毒鸡只的保护作用[0043]

[0044] *表示：与病毒感染组比较，P﹤0.05；**表示：与病毒感染组比较，P＜0.01[0045] △△表示：与正常组相比较，P<0.01;

[0046] 实施例5鹅去氧胆酸在A549细胞中对流感病毒核蛋白(NP)出核的抑制作用[0047] 将1×104个A549细胞稀释悬液加至激光共聚焦培养皿（玻底直径为15mm）内，37℃、体积浓度为5%CO2培养箱中培养过夜。待细胞长满至50%左右时，弃旧液，PBS清洗两遍，加入H5N1亚型流感病毒稀释液（MOI=0.1），100μL，吸附1h。终止培养后，吸弃病毒液，PBS清洗两遍，加入溶解于PBS的鹅去氧胆酸溶液，37℃、体积浓度为5%CO2培养箱中继续培养。实验设病毒对照组、溶剂对照组、25μg/ml、50μg/ml及100μg/ml鹅去氧胆酸组。除溶剂对照组外（含0.4%二甲基亚砜的PBS溶液），其它组均感染病毒。于感染后8h，终止培养。PBS清洗细胞爬片，每孔加入质量浓度为4%的低聚甲醛500μl固定10min；PBS清洗3次，加入质量浓度为0.25%Triton X-100透膜化，室温下15min；加入质量浓度为5%BSA封闭杂蛋白，4℃封闭2h；PBS清洗3次，加入鼠源NP单抗（1：100稀释），37℃孵育1h；PBS清洗3次，避光加入二抗（ 488标记山羊抗小鼠IgG），37℃避光孵育1h；PBS清洗3次，避光加入DAPI，染色10min，PBS洗净；甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察。结果见图4，从图中可看到鹅去氧胆酸对病毒核蛋白NP的出核具有显著抑制作用。

[0048] 实施例6鹅去氧胆酸在A549细胞中对流感病毒诱导的细胞炎症因子的抑制作用6

[0049] 取生长于对数期的A549细胞按常规消化，调整其密度至2×10个细胞/mL接种于6孔细胞培养板，培养18-24h，待其铺满细胞培养皿，弃旧液，PBS清洗两遍，加入0.1MOI的H5N1流感病毒，37℃、体积浓度为5%CO2培养1h，弃病毒液，PBS清洗两遍，加入SSa稀释液，置于培养箱，继续培养24h。实验组设正常对照组（不加受试药物，不用流感病毒刺激）、H5N1病毒对照组(不加受试药物)以及250μg/ml、50μg/ml和100μg/ml三个浓度的鹅去氧胆酸试验组。每个受试浓度均设三个平行组。培养终止后，吸取各孔培养上清，4℃离心（1000r/min，5min），根据Human TNF-αELISA Kit、Human IL-6ELISA Kit及Human IL-8ELISA Kit说明书测定各个样品中的TNF-α、IL-6及IL-8的含量。结果见图5、6、7，从图5-7可以看到，鹅去氧胆酸对流感病毒感染诱导A549细胞产生的炎症因子具有显著的抑制作用。

[0050] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。