黄姜提取物在制备抗脑缺血药物中的应用

摘要

本发明公开了黄姜提取物在制备抗脑缺血药物中的应用。具体地说，甾体总皂苷质量百分比含量大于90%的黄姜提取物对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。所述黄姜提取物可以通过以下方法提取：干燥的黄姜根茎药材粉碎后，过20目筛，经乙醇‑水溶液回流提取、离心除杂、大孔吸附树脂富集、正丁醇萃取和低压真空浓缩得到黄姜提取物，经HPLC测定，采用面积归一化法，其中甾体总皂苷含量达到90%以上。

权利要求

1.黄姜提取物在制备治疗缺血性脑血管病药物中的应用，所述的黄姜提取物采取如下方法制备：取经过粉碎和过20目筛之后的黄姜根茎药材组份7.1 Kg，用10倍量70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，抽滤，减压浓缩，回收乙醇，得浸膏；将上述浸膏加适量水充分搅拌溶解，沉淀析出杂质，静置，离心机离心，取上清液上D101大孔吸附树脂柱，先以去离子水洗至流出液近无色，再以60%乙醇洗脱，至洗脱液无皂苷为止；收集洗脱液，浓缩，回收乙醇得浸膏；将浸膏加2 L去离子水溶解，再用等体积的水饱和正丁醇连续萃取多次，至正丁醇层TLC检测无皂苷反应，合并正丁醇萃取液，减压浓缩，真空干燥，最后得到280 g甾体总皂苷含量大于90%的甾体总皂苷提取物。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于所述缺血性脑血管病为脑缺血再灌注损伤。

说明书

黄姜提取物在制备抗脑缺血药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及黄姜提取物在制备抗脑缺血药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

[0002] 目前，我国已经逐渐步入老龄社会，由于人口的老龄化问题，脑血管病发病率不断增高。据卫生部统计，我国每年死于脑血管疾病约有100万人，位列第三。联合国世界卫生组织调查了57个国家的疾病死亡原因，发现死于脑血管病者占11.3%，其中有40个国家将其列在前三位。

[0003] 在脑血管疾病中，主要是缺血性脑血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICVD），约占80%。ICVD是一种脑部血液循环障碍为特征的中枢神经系统常见疾病，具有发病率高、死亡率高、致残率高、并发症多等特点。目前对于缺血性脑血管疾病，临床主要采用溶栓治疗，解除局部血流阻塞，恢复缺血区域血流再灌注。脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury, I/R）是脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑功能障碍。但是对于缺血后再灌注引起的脑组织损伤尚无有效的治疗药物，因此探讨脑缺血再灌注损伤的发病机制，研究开发保护缺血性脑损伤的药物具有重要的理论意义和实用价值。

[0004] 盾叶薯蓣（Dioseorea Zingiberensise C.H.Wrihgt）又名为黄姜，是薯蓣科薯蓣属（Doiscera.L）多年生草本植物，为我国特有的野生药用植物资源，同时也是世界上薯蓣皂苷元（俗称皂素）含量最高的植物。黄姜以根茎入药，其性味甘、苦、凉，具有清肺止咳，利湿通淋，通络止痛，解毒消肿的功能，民间广泛用于治疗皮肤急性化脓性感染、软组织损伤、蜂哲、虫咬及各种外科炎症等。

[0005] 黄姜的根茎之中含有多种化学成分，除含有大量的淀粉和纤维素外，还含有一些甾体皂苷、生物碱类、单宁、色素等化学成分。其中，甾体皂苷是黄姜中的主要成分。目前对于甾体皂苷化学成分的研究比较明确，已经从黄姜的根茎中分离得到薯蓣皂苷、纤细皂苷、盾叶新苷、原薯蓣皂苷、原纤细皂苷和黄姜素A等螺甾烷型和呋甾烷型多种皂苷。

[0006] 现代药理学研究表明，甾体皂苷具有防治心血管疾病、抗血栓、抗血小板聚集、抗肿瘤、抗血脂、杀灭钉螺等广泛的生物活性。迄今为止，未见黄姜中甾体皂苷用于治疗脑缺血的报道。

发明内容

[0007] 本发明目的是提供黄姜提取物在制备抗脑缺血药物中的应用。具体地说，甾体总皂苷质量百分比含量大于90%的黄姜提取物对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

[0008] 本发明黄姜提取物可以使用市售产品，也可以通过以下方法提取：

[0009] 干燥的黄姜根茎药材粉碎后，过20目筛，经乙醇-水溶液回流提取、离心除杂、大孔吸附树脂富集、正丁醇萃取和低压真空浓缩得到黄姜提取物，经HPLC测定，采用面积归一化法，其中甾体总皂苷含量达到90%以上。

附图说明

[0010] 图1为采用高效液相色谱法对黄姜提取物含量进行测定结果；

[0011] 图2为脑梗死体积测定结果；

[0012] 图3为血清中TNF-α和IL-10含量的影响；

[0013] 图4为缺血侧脑组织Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。

具体实施方式

[0014] 一、黄姜提取物的制备

[0015] 本实验所用黄姜根茎药材采集自陕西安康旬阳县，由西北大学生命科学学院孙文基教授鉴定为薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea.L）盾叶薯蓣（Dioseorea Zingiberensise C.H.Wrihgt）。将黄姜根茎切片，飚干之后备用。D101大孔吸附树脂购自西安蓝深树脂有限公司。柱层析用硅胶（100-160目）购自青岛海洋化工厂，其余化学试剂均为分析纯。

[0016] 取经过粉碎和过筛（20目筛）之后的黄姜根茎药材组粉7.1 Kg，用10倍量70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，抽滤，减压浓缩，回收乙醇，得浸膏。将上述浸膏加适量水充分搅拌溶解（沉淀析出杂质），静置，离心机离心，取上清液上D101大孔吸附树脂柱，先以去离子水洗至流出液近无色，再以60%乙醇洗脱，至洗脱液无皂苷为止。收集洗脱液，浓缩，回收乙醇得浸膏。将浸膏加2 L去离子水溶解，再用等体积的水饱和正丁醇连续萃取多次，至正丁醇层TLC检测无皂苷反应，合并正丁醇萃取液，减压浓缩，真空干燥，最后得到280 g甾体总皂苷提取物。

[0017] 通过正向硅胶、反向硅胶层析柱和高压制备液相色谱等手段综合使用，最终得到黄姜素A、盾叶新苷、三角叶薯蓣皂苷、薯蓣皂苷和纤细皂苷等化合物，经MS、1H NMR、13C NMR鉴定结构，HPLC检测，面积归一化法计算纯度均大于98%。

[0018] 采用高效液相色谱法对化合物含量进行测定：

[0019] 色谱条件：

[0020] 色谱柱：Welchrom C18柱（250 mm x 4.6 mm，5 μm），采用乙腈（A）-水（B）梯度洗脱（0 5 min，25% A→30% A；5 20 min，30% A；20 35 min，30% A→35% A；35 45 min，35% A→~ ~ ~ ~47% A；45 47 min，47% A→60% A；47 60 min，60% A）；流速1.0 mL·min-1；进样量10 μL；柱~ ~
温：23℃；ELSD检测器，漂移管温度90.0℃，气体流速2.8 L·min-1。在该色谱条件下，样品中
5个分析物和其他组分分离效果良好，对照品与样品色谱图见图1，其中A.混合对照品；B.样品；1.黄姜素A；2.盾叶新苷；3.三角叶薯蓣皂苷；4.薯蓣皂苷；5.纤细皂苷。

[0021] 溶液的配制：

[0022] 对照品溶液的配制 采用差量法精密称定对照品黄姜素A、 盾叶新苷、三角叶薯蓣皂苷、薯蓣皂苷和纤细皂苷适量，用70%甲醇水溶液溶解并定容至10 mL量瓶中，制成浓度分别为1.24、1.62、1.36、1.57、1.52 mg·min-1的混合溶液，经微孔滤膜（0.45 μm）过滤后备用。

[0023] 供试品溶液的配制 精密称定盾叶薯蓣根茎药材粉末2 g，以70%乙醇水溶液20 mL回流提取3次，每次2 h，滤过，合并滤液，蒸干，用70%甲醇水溶液溶解并定容至50 mL量瓶中，摇匀，经微孔滤膜（0.45 μm）过滤后备用。

[0024] 测定：

[0025] 取供试品溶液10 μL，注入HPLC仪中，进行测定。

[0026] 黄姜根茎中黄姜素A含量0.43 0.83%，盾叶新苷0.25 0.83%，三角叶薯蓣皂苷0.25~ ~0.57%，薯蓣皂苷0.08 0.17%，纤细皂苷0.04 0.32%。
~ ~ ~

[0027] 二、黄姜提取物的应用

[0028] 对于黄姜根茎中甾体总皂苷提取物在药物中的应用，本发明主要针对其在抗脑缺血方面的治疗效果。发明人在陕西省生物医药重点实验室进行相关实验，使用上述方法得到的甾体总皂苷提取物用于以下药理实验，各种情况如下：

[0029] 1. 实验药物及试剂

[0030] 上述方法制备的黄姜根茎甾体总皂苷提取物；尼莫地平片，山东新华制药股份有限公司，生产批号：20130907；TTC染色剂购自AMRESCO公司；TNF-α和IL-10ELISA试剂盒，北京晶美生物工程有限公司；兔抗大鼠Bcl-2和Bax抗体，Bioworld technology公司。

[0031] 2.实验动物及分组

[0032] 健康雄性Sprague-Dawley成年大鼠，72只，周龄8 10周，体质量250 280 g，购自西~ ~安第四军医大学实验动物中心。合格证号：医动字第09-003。所有实验动物均在室温为24°C ± 1°C，相对湿度为55-65%，人工照明的SPF级实验室饲养。自由摄食饮水，良好通风，在实验前适应喂养一周。将72只老鼠随机分成6组，每组12只，分别是：假手术组、脑缺血再灌注损伤组，尼莫地平组（20 mg·Kg-1），甾体总皂苷小剂量组（3 mg·Kg-1）、甾体总皂苷中剂量组（10 mg·Kg-1）和甾体总皂苷大剂量组（30 mg·Kg-1）。除给药组以外，正常组与脑缺血再灌注损伤组灌胃给予生理盐水。

[0033] 3.实验方法

[0034] 采用线栓法制作大脑中动脉阻断（MCAO）再灌注模型。大鼠连续灌胃6天，每天一次，第6天灌胃之后半小时，用水合氯醛（350 mg/kg）麻醉各组大鼠，仰卧位固定于鼠台上，切开颈正中部皮肤，先分离右侧颈总动脉（CCA），然后再分离颈外动脉（ECA）和其下方的颈内动脉（ICA）。分离好的 CCA 近心端用动脉夹夹住，远心端用一手术线打个活结，并在 CCA上用眼科剪剪一小切口，用一端加热变圆钝的3.5号鱼线，向ICA缓缓推入约18mm（从ICA和ECA分叉处算起），感到有轻微阻力停止，表明已到达大脑前动脉。用手术线结扎固定鱼线，缝合皮肤。术后 90 min选择出现竖毛，右眼 horner's 征，左侧肢体出现偏瘫的大鼠进行再灌注24 h，假手术组只暴露颈外和颈内动脉，不进行栓塞。

[0035] 4. 血清的采集和脑组织的制备

[0036] 实验结束后，大鼠腹腔注射水合氯醛处死，腹主动脉采血。将血液放到PE管静置1~-1
2 h，用高速离心机3500 r·min 离心15 min后得血清。将血清于-20℃低温冰箱保存，用于检测TNF-α和IL-10。

[0037] 取新鲜脑组织，去除小脑和低位脑干，置于-20℃冰箱冻30 min。取出之后，沿冠状位自前向后，在脑前极与视交叉连线中点处视交叉处漏斗柄部漏斗柄与后叶尾极中点切成6片，放到含4%的TTC的磷酸盐缓冲溶液中（PH=7.4），37℃水浴锅避光孵育20 min后拍照。正常脑组织为红色，梗死灶为白色。利用an Image-Pro plus（version 6.0）图像分析软件进行计算，脑梗死体积计算方法为：测量每一脑片的梗死面积，各脑片梗死面积之和乘以厚度（2 mm）后为脑梗死灶体积的近似值，以脑梗死体积全脑体积作为统计参数。另将新鲜得到的脑组织放入10%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，脱水，最后用苏木精-伊红（H&E）染色。光镜下观察大鼠海马区和皮层区组织形态学变化。最后利用Western Blot方法测定大鼠缺血测脑组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达量。

[0038] 5. 统计学处理

[0039] 采用SPASS 19.0软件进行数据分析处理。所有数据资料先进行组间Lev-ene’s方差齐性检验，然后采用独立样本t检验进行均值显著性统计，其结果以 表示。

[0040] 6.实验结果

[0041] 6.1 脑梗死体积测定结果

[0042] 假手术组脑组织进行TTC染色均呈现粉红色，脑缺血再灌注损伤脑组织染色可见苍白色梗死区，说明造模结果理想，而给药组梗死区域面积均有不同程度的缩小。通过Image-Pro plus软件分析，脑缺血再灌注损伤组梗死面积与正常组相比具有显著统计学差异（p<0.001），尼莫地平和甾体皂苷小、中、大剂量组与脑缺血再灌注损伤组相比均具有显著的统计学差异（p<0.001，p<0.05，p<0.01，p<0.001），甾体皂苷大剂量组与尼莫地平组具有相似的实验效果，结果见图2，其中（a）：TTC染色；（b）大鼠脑梗死面积（n=3，x ± s）A：假手术组；B：脑缺血再灌注损伤组；C：尼莫地平组；D：甾体皂苷小剂量组；E：甾体皂苷中剂量组；F：甾体皂苷大剂量组；p#与假手术组相比；p*与模型组相比。

[0043] 6.2 光镜下脑组织H&E染色结果

[0044] 假手术组大脑海马CA1区及皮层区神经细胞形态基本正常，脑缺血再灌注损伤组神经细胞明显变性坏死，胞体肿胀，周围间隙增宽，结构不清，出现不同程度的核深染、核固缩和核溶解。尼莫地平组与甾体皂苷大剂量组神经细胞呈轻度缺血改变，变性坏死不明显，胞体呈轻度肿胀，神经细胞形态变化趋势较甾体皂苷小剂量组轻。

[0045] 6.3 血清中TNF-α和IL-10含量的影响

[0046] 与假手术组比较，脑缺血再灌注损伤组大鼠血清TNF-α浓度显著升高（p<0.001）。与此相反，IL-10浓度显著降低（p<0.001）。各给药组均能减轻脑缺血引起的这两种炎症因子的变化趋势，并且具有统计学差异，p值均小于0.001，结果见图3，炎症细胞因子（n=10，x ± s），A：假手术组；B：脑缺血再灌注损伤组；C：尼莫地平组；D：甾体皂苷小剂量组；E：甾体皂苷中剂量组；F：甾体皂苷大剂量组；p#与假手术组相比；p*与模型组相比。

[0047] 6.4 缺血侧脑组织Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

[0048] Western Blot结果显示，与假手术组相比，脑缺血再灌注损伤组Bcl-2和Bax蛋白分别呈现出降低和升高的趋势，并且统计学差异显著（p<0.01，p<0.05）。尼莫地平组（p<0.01，p<0.05）与甾体皂苷大剂量组（p<0.01，p<0.01）均能缓解脑缺血引起的两种蛋白质的变化趋势，甾体皂苷小剂量组与中剂量组也具有相同的效果，但是不具有统计学差异，结果见图4，其中（a）：蛋白质印记图；（b）：Bcl-2和Bax蛋白质的相对表达量（n=3，x ± s）A：假手术组；B：脑缺血再灌注损伤组；C：尼莫地平组；D：甾体皂苷小剂量组；E：甾体皂苷中剂量组；
F：甾体皂苷大剂量组；p#与假手术组相比；p*与模型组相比。

[0049] 7.结论

[0050] 本实验结果表明，黄姜中甾体总皂苷提取物对脑缺血具有较好的保护作用。它能够改善缺血测脑组织中海马区CA1区和皮层区神经细胞的形态，降低脑缺血引起的脑梗死面积。这种保护作用可能通过调节促炎症细胞因子TNF-α和抑制炎症细胞因子IL-10的平衡，同时上调抑制细胞凋亡蛋白Bcl-2和下调促细胞凋亡蛋白Bax的表达从而发挥神经保护作用。