荧光假单胞菌CB113QS系统comQ基因缺失突变菌株及应用

摘要

荧光假单胞菌CB113 QS系统comQ基因缺失突变菌株及应用属于微生物技术领域，本发明提供的一株荧光假单胞菌突变菌株M2由荧光假单胞菌CB113中的comQ基因编码区675bp缺失获得，一种突变菌株M2的应用，在于与野生型菌株相比显著提高对病原真菌的抑制活性,所述病原真菌为玉米大斑病菌和人参锈腐病菌；本发明的菌株具有较好的抑制真菌的特性，为现有技术提供了一种更好的抑制真菌的途径。

权利要求

1.一株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)突变菌株M2，其特征在于所述荧光假单胞菌突变菌株由荧光假单胞菌CB113中的comQ基因编码区675bp缺失获得。

2.一种权利要求1所述突变菌株M2的应用，其特征在于与野生型菌株相比能提高对病原真菌的抑制活性。

3.按权利要求2所述突变菌株M2的应用，其特征在于所述病原真菌为玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)和人参锈腐病菌(Cylindrocarpon destructans)。

说明书

荧光假单胞菌CB113 QS系统comQ基因缺失突变菌株及应

用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株荧光假单胞菌，特别涉及comQ基因缺失的荧光假单胞菌突变菌株，属于微生物技术领域。

背景技术

[0002] 细菌的群体感应（quorum sensing,QS），是细菌根据种群密度大小进行细胞内或细胞间相互交流、协调群体行为的一种重要机制。虽然每种革兰氏阴性菌所产生的群体感应机制不同，但其调控蛋白具有高度同源性，目前研究的大多数革兰氏阴性菌都存在相似的QS系统。在Pseudomonas fluorescens中，comX-comQ-comP-comA是QS系统中主要的信号途径，调控细菌感受态细胞的形成、芽孢的产生、生物膜的形成以及抗生素的产生等。comX基因编码55氨基酸的comX信息素前体，comQ负责将没有活性的信号分子comX转变为有活性的信号分子，为10氨基多肽（ADPITRQWGD）。信号分子comX被分泌到胞外并在胞外积累，当胞外介质中的信号分子达到一定浓度时可激发细胞膜受体蛋白组氨酸激酶comP的活性，comP自磷酸化并将自身携带的-P转移到调控因子comA上，磷酸化的comA具有了转录调控因子的活性并调控下游一系列基因的表达，可见comQ对整个QS系统的启动具有重要的功能。基于该基因在细菌中的重要地位，发明人研究了荧光假单胞菌中comQ基因的作用，出乎意料的发现，突变后的荧光假单胞菌对真菌有更强的抑制作用。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一株comQ基因缺失的荧光假单胞菌突变菌株。

[0004] 一株荧光假单胞菌突变菌株M2由荧光假单胞菌CB113中的comQ基因编码区675bp缺失获得。

[0005] 一种突变菌株M2的应用，在于与野生型菌株相比显著提高对病原真菌的抑制活性,所述病原真菌为玉米大斑病菌和人参锈腐病菌。

[0006] 本发明实现过程如下:

[0007] CB113是从长白山土壤中分离纯化得到，首先在PDA上进行分离初筛，然后进行拮抗效果鉴定，并采用牛津杯扩散实验进行复筛，确定了CB113对多种菌株具有很好的拮抗能力。通过对该菌进行形态特征和培养特征观察，生理生化的鉴定以及16SrDNA的序列分析，初步鉴定该菌株为荧光假单胞菌，命名为Pseudomonas fluorescens CB113。相关的研究结果已经以硕士论文的形式收录在中国期刊网中，硕士论文题目为“玉米大斑病菌拮抗细菌的筛选鉴定及发酵条件的研究”，本领域技术人员可以随意获得该菌株，而且申请人可以随时提供给需要该菌株的科研机构或院所。

[0008] 根据已公布的与CB113菌株近缘的细菌中的comQ保守序列设计两对引物Q-L-F/Q-L-R 和Q-R-F/Q-R-R，以CB113基因组DNA为模板，利用设计的引物，通过PCR方法获得产物Q-L、Q-R，大小分别为1268bp和1432bp。引物序列如表1所示：

[0009] 表1本试验使用的PCR引物Table1PCRprimers used in this study[0010]

[0011] 在基因组中的上、下游片段。Q-L、Q-R经HindIII酶切连接后，以连接产物为模板，利用Q-L-F/Q-R-R进行PCR扩增，获得大小约2.7kb的DNA片段，与comQ基因相比，其内部缺失大小约600bp，片段经BamHI和EcoRI双酶切后，插入同样双酶切的pMAD质粒相应位点，构建了pMAD-ΔcomQ缺失突变载体，利用电击转化的方法将pMAD-ΔcomQ转入CB113野生型菌株，得到转化子，经高温诱导，使pMAD-ΔcomQ与CB113菌株的comQ基因上下游基因序列发生两次同源重组，获得CB113菌株comQ基因缺失突变菌株。

[0012] 以Q-L-F/Q-R-R为引物对筛选到的突变体菌株进行PCR验证，结果证明，突变体菌株中的扩增片段比CB113野生型菌株中扩增的条带小约600bp，进一步将从突变体菌株中获得的扩增片段进行测序，结果证明，同野生型comQ基因相比，突变体菌株中ΔcomQ中间缺少了675个碱基，将该突变体菌株为M2。

[0013] 本发明的有益效果在于首次获得了一株comQ基因缺失的荧光假单胞突变菌株，该菌株具有较好的抑制真菌的特性，为现有技术提供了一种更好的抑制真菌的途径。

附图说明

[0014] 图1为荧光假单胞菌中comX-comQ-comP-comA群体感应系统信号途径示意图[0015] 图2为Q-L、Q-R的PCR扩增片段的电泳图谱：DNA marker;2.Q-L;3.Q-R[0016] 图3为PCR扩增片段的电泳图谱：1.ΔcomQ;M:DNA marker

[0017] 图4为comQ基因缺失突变载体和突变菌株的构建示意图

[0018] 图5为PCR方法验证comQ基因缺失突变：1:以comQ基因缺失突变菌株基因组为模板；2：以野生型CB113基因组为模板；3：以构建好的重组载体pMAD-ΔcomQ为模板4：DNA marker

具体实施方式

[0019] 实施例

[0020] 1.从CB113菌株基因组DNA中克隆comQ基因

[0021] 对根据已公布的与CB113菌株近缘的细菌中的comQ保守序列设计引物，通过PCR方法获得该菌株comQ基因序列。通过对基因组序列进行比对和功能分析，从CB113菌株中定位并克隆了基因comQ。comQ的完整序列如下：

[0022] 1 atgaaggaga ttgtaagcca aaaaataatg aatcaggact tggaacgata tcttcagaat[0023] 61 tttattgagt ctaaggatac gtttgagttt gccgatttgg ctcttcatca ttatttagct[0024] 121 tttaacggtc aggaccaaaa agcaatcgaa ttgctagctg ccggaattga attgcttata[0025] 181 ctctcattcg atatttatga tgacttagag gatcaagata atggaagtgc tgtctggatg[0026] 241 aagattgact cgtcaatcgc tttaaatgca gttacagctc tttacaccct aagtatacaa[0027] 301 gtgatgtgtc aagctagtca tgaaccagaa tttacacaag agatattgaa ttttgcgtta[0028] 361 caatcaattc aaggccagca tgatgatatt gtgaatgcgc cgcaaactga agaagcctgt[0029] 421 cttgaaatga tcaaaaataa atcaggagcg ctaacggcat tgccctgtgt aatgggagta[0030] 481 atgttggcaa caggcaaata ccatcccatt gtagcttctt attcttatga acttgggatt[0031] 541 attgcacaaa tcgaaaatga ttaccaaggt ttatattatt taaataacga ttttattcag[0032] 601 aagaaaaaca cattggcata cttatactta aataaacgtt ttaatgcagc ttctgcagaa[0033] 661 atcttgagtt ggtatgaaaa tgctgagttg ttcttatcat tgaatcccaa acaaataaaa[0034] 721 gaaaaattaa ctgaggcagg cgtagtgcaa tatttacttg taatgaaaca cttgtcatta[0035] 781 caaaaactaa agaaagaaat tgctagatta gaattgcaag agaataaaat aaaaaaatta[0036] 841 ataacaggaa tcataaaata a

[0037] 2.comQ基因缺失菌株的构建。

[0038] 如图4所示，以CB113基因组DNA为模板，利用Q-L-F/Q-L-R和Q-R-F/Q-R-R两对引物分别扩增，得到PCR产物Q-L、Q-R，大小分别为1268bp和1432bp，是基因comQ[0039] 在基因组中的上、下游片段。Q-L、Q-R经HindIII酶切连接后，以连接产物为模板，利用Q-L-F/Q-R-R进行PCR扩增，获得大小约2.7kb的DNA片段，与comQ基因相比，其内部缺失大小约600bp，片段经BamHI和EcoRI双酶切后，插入同样双酶切的pMAD质粒相应位点，构建了pMAD-ΔcomQ缺失突变载体。

[0040] 利用电击转化的方法将pMAD-ΔcomQ转入CB113野生型菌株，得到转化子，经高温诱导，使pMAD-ΔcomQ与CB113菌株的comQ基因上下游基因序列发生两次同源重组，获得CB113菌株comQ基因缺失突变菌株。以Q-L-F/Q-R-R为引物对筛选到的突变菌株进行PCR验证，结果证明，突变菌株中的扩增片段比CB113野生型菌株中扩增的条带小约600bp，进一步将从突变菌株中获得的扩增片段进行测序，结果证明，同野生型comQ基因相比，突变菌株中ΔcomQ中间缺少了675个碱基，将该突变菌株命名为M2。M2中comQ基因测序结果 为186碱基序列:

[0041] 1 tgaaggagat tgtaagccaa aaaataatga atcaggactt ggaacgattc ttcagaattt[0042] 61 tattgagtct aaggatacgt ttgagttatt tacttgtaat gaaacacttg tcattacaaa[0043] 121 aactaaagaa agaaattgct agattagaat tgcaagagaa taaaataaaa aaattaataa[0044] 181 caggaa

[0045] 3.comQ基因对CB113菌株抑制真菌生长的影响

[0046] 在平板上比较了CB113野生型菌株和突变菌株M2对人参锈腐病菌和玉米大斑病菌生长的抑制能力，结果发现，突变菌株M2与野生型CB113相比，对两种病原菌具有更好的抑制作用，这是本领域技术人员所不能预期的。结果说明，comQ基因缺失以后，突变菌株M2产生了一种对人参锈腐病菌和玉米大斑病菌有较强抑制作用的物质，comQ基因对于这种物质的产生具有负调控作用。

[0047] 表2野生型菌株（CB113）与突变菌株（M2）的抑菌直径Table2Inhibition results of WT CB113and mutant M2

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