一种生产长链二元酸的方法，该方法包括以下内容：将二元酸菌种扩大培养获得种子液，种子液进行扩大发酵，发酵过程中加入乳化烷烃，反应结束后除去菌体蛋白，结晶获得长链二元酸产品。本发明方法改善了发酵体系中水相和油相间的相容性，提高了发酵体系中烷烃的转化率和二元酸产品的收率。
1.一种生产长链二元酸的方法，其特征在于包括以下内容：将二元酸菌种扩大培养获得种子液，种子液进行扩大发酵，发酵过程中加入乳化烷烃，反应结束后除去菌体蛋白，结晶获得长链二元酸产品；其中所述的乳化烷烃为长链烷烃与水混合，进行微波处理得到的；
所述的长链烷烃为碳链中含有10～16个碳原子的烷烃，长链烷烃与水的体积比为3:1～10:
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的二元酸菌种选自能利用正烷烃生长的微生物或具有完整α、ω-氧化途径的微生物；所述的二元酸菌种选自假丝酵母属、隐球酵母属、内孢霉属、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母属、红酵母属、球拟酵母属或丝孢酵母属中的一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的二元酸菌种选自假丝酵母属、隐球酵母属、内孢霉属、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母属、红酵母属、球拟酵母属或丝孢酵母属中的一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的扩大发酵的体积为种子液体积的7～15倍。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵条件为：搅拌转速为100～700rpm，通气量为0.6～1VVM，发酵温度为29～32℃，发酵时间为138～144小时。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于：所述的发酵过程通过逐级调pH值的方式进行调控，发酵开始，控制体系pH值为4～5，15～24小时后，将体系pH值调至6.8～7.2，然后每间隔20～24小时，提高一次pH值，每次提高0.1～0.5，直至发酵结束。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在发酵过程中加入乳化烷烃维持体系中烷烃的体积百分比浓度不小于4％，每次加入乳化烷烃的体积为发酵总体积的3％～12％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：微波处理的功率密度为100W/L～10kW/L，微波频率为300MHz～3000MHz，微波处理时间为10～30分钟。
一种生产长链二元酸的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物化工领域，主要涉及一种利用发酵方式生产长链二元酸的方法。
背景技术
[0002] 长链二元酸（Long chain dicarboxylic acids）是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸（简称DCn），包括饱和及不饱和二羧酸，是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品。同时也是化学工业中合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电介质、高级油漆和涂料、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药等重要原料。
[0003] 发酵法生产长链二元酸是利用微生物特有的氧化能力和微生物胞内酶的作用，在常温常压下分别通过α、ω-氧化，将长链正烷烃两端的甲基氧化成为羧基，生成相应链长的各种长链二元酸。能利用石油烃类的细菌、霉菌和放线菌的种类很多，其中假丝酵母属（candida）的酵母菌是正烷烃发酵生产二元酸的高产微生物。长链二元酸发酵是典型的气相（氧气）—水相（发酵液）—油相（烷烃）—固相（菌体）四相体系，为了维持四相体系的均一性，在发酵过程中通常在培养基中添加乳化剂。
[0004] CN102115768A公开了一种微生物同步发酵正十六烷生产十六碳二元酸的方法，添加表面活性剂（吐温60）0.1～2 g/L以增强油相的乳化效果。一般情况下乳化剂并非微生物代谢所需成分，因此这种外加乳化剂的方式会对正常的微生物发酵产生不利影响。
[0005] 现阶段长链二元酸的发酵一般采用批次发酵，发酵过程中补加烷烃的形式。CN102115767A公开了一种微生物同步发酵正十一烷生产十一碳二羧酸方法，通过在60、90、
120小时补加正十六烷，使发酵液中正烷烃浓度始终≥5%（V/V）。在实际生产过程中，为了使补加的烷烃快速与水相混合均匀，一般采用提高搅拌速度的方法，但搅拌速度的提高会使剪切力增大，从而影响发酵菌体的生长。
发明内容
[0006] 针对现有技术的不足，本发明提供一种生产长链二元酸的方法。该方法改善了发酵体系中水相和油相间的相容性，提高了发酵的效率。
[0007] 一种生产长链二元酸的方法，包括以下内容：将保藏的二元酸菌种扩大培养获得种子液，种子液进行扩大发酵，发酵过程中加入乳化烷烃，反应结束后除去菌体蛋白，结晶获得长链二元酸产品。
[0008] 本发明方法中，所述的二元酸菌种选自能利用正烷烃生长的微生物或具有完整α、ω-氧化途径的微生物，优选假丝酵母属、隐球酵母属、内孢霉属、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母属、红酵母属、球拟酵母属或丝孢酵母属等中的一种。
[0009] 本发明方法中，所述的扩大培养，按照7～15倍进行扩大培养，优选9~12倍扩大培养。
[0010] 本发明方法中，基本培养基各组分含量如下：蔗糖20～50g/L、玉米浆1～3g/L、酵母膏1～2g/L、氯化钠0.5～1.5g/L、磷酸二氢钾3～8g/L、硫酸镁1～2g/L、尿素1～5g/L。
[0011] 本发明方法中，所述的扩大发酵的体积为种子液体积的7～15倍，优选9~12倍。
[0012] 本发明方法中，发酵条件为：搅拌转速为100～700rpm，通气量为0.6～1.0VVM，发酵温度为29～32℃，发酵时间为138～144小时。
[0013] 本发明方法中，所述的发酵过程通过逐级调pH值的方式进行调控，发酵开始，控制体系pH值为4～5，24小时后将体系pH值调至6.8～7，然后每间隔24小时提高一次pH值，每次提高0.1～0.5，直至发酵结束。
[0014] 本发明方法中，在发酵过程中加入乳化烷烃维持体系中烷烃浓度不小于4%，每次加入乳化烷烃的体积为发酵总体积的3%～12%。
[0015] 本发明方法中，所述的乳化烷烃为长链烷烃与水混合，进行微波处理得到的。
[0016] 其中长链烷烃为碳链中含有10～16个碳原子的烷烃，长链烷烃与水的体积比为3:1～10:1。
[0017] 其中微波处理的功率密度为100～10kW/L（每升油水混合物的微波功率），微波频率为300～3000MHz，微波处理时间为10～30分钟。
[0018] 与现有技术相比，本发明一种生产长链二元酸的方法具有如下优点：
[0019] 采用微波处理将烷烃和水进行处理，微波处理会产生热效应，利用水分子快速传播微波辐射能量的特征，加强了水分子的向上运动，提高了两者的混合效果，促进了油相与水相间的乳化，提高烷烃的乳化效果，改善气相（氧气）—水相（发酵液）—油相（烷烃）—固相（菌体）四相体系的均一性，避免了添加的乳化剂和高速搅拌对发酵过程的影响。通过对烷烃的乳化预处理提高了发酵体系中烷烃的转化率，并提高了二元酸产品的收率。
具体实施方式
[0020] 下面结合实施例对本发明发法的具体过程及效果进行说明，但不局限于以下实施例。
[0021] 本实施例中选用热带假丝酵母（Candida tropicalis）突变株PF-UV-56作为发酵菌株进行长链烷烃发酵生产长链二元酸实验，该突变株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.0356。
[0022] 实施例1
[0023] 基本培养基各组分含量如下：蔗糖30g/L、玉米浆3g/L、酵母膏2g/L、氯化钠1g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸镁1g/L、尿素4g/L。
[0024] （1）发酵种子液培养：将斜面保藏菌种接种于3000mL摇瓶进行菌种活化培养，活化培养液体积为500mL，培养温度为32℃，摇床转数为120rpm，培养48小时。
[0025] （2）烷烃预处理：取十二碳烷烃3000mL与600mL水混合，微波处理10分钟，微波频率为2450MHz，功率密度为4.2kW/L。
[0026] （3）二元酸发酵：将活化的菌种种子液1000mL加入6000mL发酵培养基中，然后添加600mL经微波乳化的十二碳烷烃，pH值为4.3，搅拌转数为400rpm，通气设置为7000mL/min；
24小时将pH值调至7.2，并添加1200mL经微波乳化的十二碳烷烃；于48小时、72小时分别将pH值上调0.2，并分别添加600mL经微波乳化的十二碳烷烃，于96小时、120小时分别将pH值上调0.2，直至144小时反应结束。最终发酵体系中十二碳二元酸浓度为150.1g/L，十二碳烷
