高产安丝菌素发酵工艺

摘要

本发明公开了高效大规模生产安丝菌素的发酵工艺，该工艺显著特征是首先进行补料分批发酵，随后转换为重复补料分批发酵。本发明还公开了一种生产安丝菌素的培养基以及由发酵液获取高纯度安丝菌素的精制方法。

权利要求

1.一种安丝菌素高效发酵工艺，其特征在于，首先进行补料分批发酵，随后转换为重复补料分批发酵，其中，在补料分批发酵阶段，使用发酵培养基发酵一段时间后，向发酵液中加入异丁醇，继续发酵一段时间后，向发酵液中流加葡萄糖；继续发酵一段时间后，进入重复补料分批发酵阶段，放掉发酵液的一部分，补加发酵培养基并向发酵液中加入异丁醇，一段时间后，向发酵液中流加葡萄糖。

2.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，在补料分批发酵阶段，使用发酵培养基发酵2～3天后，向发酵液中加入0.10～0.30％(v/v)的异丁醇，发酵进行4～6天后，向发酵液中流加葡萄糖，流加速率为3～10g/L/d；发酵进行8～12天后，进入重复补料分批发酵阶段，放掉发酵液的30～50％，补加发酵培养基并向发酵液中加入0.10～0.30％(v/v)的异丁醇，在重复补料分批发酵阶段开始2～4天后，向发酵液中流加葡萄糖，流加速率为3～10g/L/d，重复补料分批发酵阶段持续时间为7～10天。

3.如权利要求1所述的发酵工艺，其参数为，接种量为发酵培养基的0.3％～10.0％(v/v)，温度25～30℃，pH 6.8～7.6，DO(溶氧)40％～60％，压力0.03～0.08MPa，通气量0.1～

0.6VVM(air volume/culture volume/min，通气比)，搅拌速度100～300rpm。

4.如权利要求3所述的发酵工艺，其参数为，接种量为发酵培养基的6.0％(v/v)，温度

28℃，pH 7.3，DO 40％，压力0.05MPa，通气量0.4VVM，搅拌速度160rpm。

5.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于使用的发酵菌种为珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema Pretiosum)ATCC 31565及其衍生菌株。

6.如权利要求1所述的发酵工艺，其还包括在发酵完成后，用水溶性提取试剂从发酵液中纯化安丝菌素，具体地包括如下步骤：(1)灭活发酵液中微生物；

(2)向发酵液中加入50％～80％提取试剂，实现安丝菌素的抽提及去除固形物；

(3)通过离心或过滤去除菌体及固形物，得到发酵上清液，接着向上清液中加入0.1％～0.3％(质量比)的絮凝剂，静置6～16h，以去除残留物，其中采用的絮凝剂选自硫酸铝、氯化铁及硫酸铝钾中的一种或其混合；

(4)采用硅胶层析手段，实现初步分离发酵液中安丝菌素；

(5)采取蒸发的方法浓缩安丝菌素；

(6)采取高效液相色谱的方法精制安丝菌素。

7.如权利要求6所述的发酵工艺，所述提取试剂是醇类及酸酯类中的一种或其混合，其中醇类选自甲醇、乙醇、丙醇的一种或其混合，酸酯类选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯的一种或其混合。

8.如权利要求1-7任一项所述的发酵工艺，其中在所述发酵培养基中，碳源为0.3％～

4.0％葡萄糖和0.2％～2.0％糊精的混合；氮源为0.3％～3.0％玉米浆、0.1％～0.5％甘氨酸及0.1％～0.5％缬氨酸的混合。

9.如权利要求8所述的发酵工艺，其中在所述发酵培养基中，所述碳源为2.6％葡萄糖和1.5％糊精的混合；所述氮源为1.0％玉米浆、0.2％甘氨酸及0.2％缬氨酸的混合。

10.如权利要求8所述的发酵工艺，其中所述发酵培养基还含有0.1％～1.0％CaCl2·

2H2O、0.1％～1.0％KH2PO4、0.1％～1.2％NH3·H2O及0.01％～0.3％消泡剂。

11.如权利要求10所述的发酵工艺，其中CaCl2·2H2O含量为0.5％，KH2PO4含量为0.2％，NH3·H2O含量为0.15％，消泡剂含量为0.05％。

说明书

高产安丝菌素发酵工艺

技术领域

[0001] 本发明涉及生产安丝菌素的培养基及一种新型安丝菌素发酵工艺和精制方法，属于生物工程和生物技术领域。

背景技术

[0002] 1972年S.M.库普钱等从非洲收集的卵叶美登木中(含量为千万分之二)首先分离得到美登素，其母核为19-C的大环内酰胺或Ⅰ型多聚酮类，后来发现珍贵橙色束丝放线菌（Actinosynnema pretiosum）也能产生与其类似的多种产物，将之称为美登素类抗生素，在限定的培养条件下，安丝菌素P-3（AP-3）是其主要成分。因它对各种肿瘤，如L-1210、P-388白血病、S-180、W-256、路易斯肺癌和体外鼻咽癌均有显著疗效，从而具有巨大的应用前景，例如目前AP-3作为免疫毒素结合剂的方式治疗恶性肿瘤的临床试验已进入最后阶段。因此，未来市场对AP-3的需求将是大量的，从而高效大规模生产AP-3已成为研究热点之一。

[0003] 高效大规模生产AP-3，主要从三个方面入手。一是获得AP-3高产菌株，二是得到利于高产菌株生长和代谢的培养基，三是探索应用适合的发酵工艺。目前报道的AP-3高产菌株通过基因改造和诱变的手段获得。Bandi等（J.Microbiol.biotechnol.（2006）,16（9）,1338 1346）通过将出发菌株ATCC 31565的asm2（AP-3生成相关基因)删除，AP-3含量由0.53 ~
mg/L提高到5.0 mg/L，之后通过响应曲面方法优化其培养基组成，AP-3含量提高到78.3 mg/L。Daniel等（J Ind Microbiol Biotechnol(2009 36:1345 1351)）分别将asm2和asm39~
上调表达，使得AP-3含量分别提高到33 mg/L和52 mg/L。辛西亚·郭等通过将菌株ATCC31565经紫外和化学试剂两轮诱变，获得变异菌株Actinosynnema pretiosum PF4-4，在其限定的培养基和补料分批发酵工艺下，900 L/1500 L发酵罐水平AP-3含量达到304mg/L（专利CN 101103120A，WO 03/064610 A2）。这也是目前报道的AP-3最高发酵水平和最大发酵规模。

发明内容

[0004] 本发明提供了一种安丝菌素高效发酵工艺，其特征在于，首先进行补料分批发酵，随后转换为重复补料分批发酵。在一个实施方案中，在补料分批发酵阶段，使用发酵培养基发酵一段时间后，向发酵液中加入异丁醇，继续发酵一段时间后，向发酵液中流加葡萄糖；继续发酵一段时间后，进入重复补料分批发酵阶段，放掉发酵液的一部分，补加发酵培养基并向发酵液中加入异丁醇，一段时间后，向发酵液中流加葡萄糖。

[0005] 在一个实施方案中，在所述发酵工艺的补料分批发酵阶段，使用发酵培养基发酵23天后，向发酵液中加入0.10 0.30%(v/v)的异丁醇，发酵进行4 6天后，向发酵液中流加葡~ ~ ~
萄糖，流加速率为3 10 g/L/d；发酵进行8 12天后，进入重复补料分批发酵阶段，放掉发酵~ ~
液的30 50%，补加发酵培养基并向发酵液中加入0.10 0.30%(v/v)的异丁醇，在重复补料分~ ~
批发酵阶段开始2 4天后，向发酵液中流加葡萄糖，流加速率为3 10 g/L/d，重复补料分批~ ~
发酵阶段持续时间为7 10天。
~

[0006] 在一个实施方案中，所述发酵工艺参数为，接种量为发酵培养基的0.3% 10.0%（v/~v），温度25 30℃，pH 6.8 7.6，DO（溶氧）20% 60%，压力0.03 0.08 MPa，通气量0.1 0.6 VVM~ ~ ~ ~ ~
（air volume/culture volume/min，通气比），搅拌速度100 300 rpm。
~

[0007] 在一个优选的实施方案中，所述发酵工艺参数为，接种量为发酵培养基的6.0%（v/v），温度28℃，pH 7.3，DO 40%，压力0.05 MPa，通气量0.4 VVM，搅拌速度160 rpm。

[0008] 在一个实施方案中，所述发酵工艺中pH的控制是通过自动流加NH3·H2O和30%醋酸来实现的。

[0009] 在一个实施方案中，所述发酵工艺使用的菌种为珍贵橙色束丝放线菌ATCC 31565。发酵种子为利用发酵培养基，从珍贵橙色束丝放线菌的平板上挑取单菌落，在28℃
260 rpm摇床培养4 6天获得的。
~

[0010] 在一个实施方案中，所述发酵工艺使用的发酵培养基，其碳源为乳 糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉、糊精、果糖及葡萄糖中的一种或其混合，其氮源为花生饼粉、大豆粉、酵母粉、蛋白胨、玉米浆、甘氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸中的一种或其混合。其中，碳源比例为0.2% 6.0%，氮源比例为0.1% 3.0%。~ ~

[0011] 在一个优选的实施方案中，所述发酵培养基的碳源为0.3% 4.0%葡萄糖和0.2%~ ~2.0%糊精的混合；氮源为0.3% 3.0%玉米浆、0.1% 0.5%甘氨酸及0.1% 0.5%缬氨酸的混合。
~ ~ ~

[0012] 在一个更优选的实施方案中，所述发酵培养基的碳源为2.6%葡萄糖和1.5%糊精的混合；氮源为1.0%玉米浆、0.2%甘氨酸及0.2%缬氨酸的混合。

[0013] 在一个实施方案中，所述发酵培养基还含有0.1%~1.0%CaCl2·2H2O、0.1%~1.0%KH2PO4、0.1% 1.2%NH3·H2O及0.01% 0.3%消泡剂。~ ~

[0014] 在一个优选的实施方案中，所述发酵培养基中CaCl2·2H2O含量为0.5%，KH2PO4含量为0.2%，NH3·H2O含量为0.15%，消泡剂含量为0.05%。

[0015] 本发明还涉及在发酵完成后，用水溶性提取试剂从发酵液中纯化安丝菌素，具体地包括如下步骤：

[0016] （1）灭活发酵液中微生物；

[0017] （2）向发酵液中加入50% 80%提取试剂，实现安丝菌素的抽提及去除固形物；~

[0018] （3）通过离心或过滤去除菌体及固形物，得到发酵上清液，接着向上清液中加入0.1% 0.3%（质量比）的絮凝剂，静置6 16 h，以去除残留物。其中采用的絮凝剂选自硫酸铝、~ ~
氯化铁及硫酸铝钾中的一种或其混合；

[0019] （4）采用硅胶层析手段，实现初步分离发酵液中安丝菌素；

[0020] （5）采取蒸发的方法浓缩安丝菌素；

[0021] （6）采取高效液相色谱的方法精制安丝菌素。

[0022] 在一个实施方案中，通过加热和/或调节发酵液pH的方法灭活发酵液中微生物。

[0023] 在一个优选的实施方案中，通过将发酵液加热至60-70℃并维持1.0-2.0 h（搅拌或不搅拌）以灭活发酵液中微生物。

[0024] 在一个优选的实施方案中，通过调节发酵液pH为3.0-4.0或pH为10.0-11.0并维持1.0-2.0 h（搅拌或不搅拌）以灭活发酵液中微生物。

[0025] 在一个实施方案中，所采用的提取试剂是醇类及酸酯类中的一种或其混合，其中醇类选自甲醇、乙醇、丙醇的一种或其混合，酸酯类选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯的一种或其混合。

附图说明

[0026] 图1为使用Design-Expert软件探索不同培养基成分对AP-3发酵影响的2Ⅳ8-3析因设计效应分析图（半正态图，Half-Normal Plot），其中横坐标为标准化效应（Standardized Effect），纵坐标为半正态概率（Half-Normal%Probability）。

[0027] 图2为采用HPLC检测发酵液中AP-3浓度而建立的AP-3标准曲线。

[0028] 图3为采用葡萄糖检测试剂盒检测发酵液中葡萄糖而建立的葡萄糖标准曲线。

[0029] 图4为采用15L-罐发酵，AP-3、pH、PCV（细胞压缩体积）随时间变化的过程曲线。

[0030] 图5为采用150L-罐进行补料分批发酵，AP-3、pH、PCV、葡萄糖浓度随时间变化的过程曲线。

[0031] 图6为采用150L-罐将补料分批发酵和重复补料分批发酵相结合，AP-3、pH、PCV、葡萄糖浓度随时间变化的过程曲线。

[0032] 图7为使用HPLC检测AP-3纯度的数据。

具体实施方式

[0033] 提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本发明，所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。

[0034] 实施例中用于菌种划线的平板培养基配方见表1。

[0035] 表1.平板培养基配方

[0036]

[0037] 平板培养条件为：26℃恒温培养7 10天。~

[0038] AP-3检测采用HPLC方法，取发酵液4.0 mL，加入无水乙醇至8mL，震荡10 15 min，~10000 rpm离心10 min，取上清以0.45μm滤膜过滤后即可检测。HPLC采用反向C18柱，5 μm，
250×4.6 mm，前置预过滤柱，流动相采用ACN:水=7:3，流速1.0 mL/min进样量20 μL，波长
252 nm。关联AP-3浓度和峰面积，建立AP-3标准曲线，见图2。

[0039] 葡萄糖测定采用葡萄糖检测试剂盒(宁波美康生物科技股份有限公司，产品标准编号：YZB/浙2120-2012)方法，具体操作见该试剂盒说明书，取发酵液8.0 mL，10000 rpm离心10 min，取上清以0.45μm滤膜过滤后即可检测。关联葡萄糖浓度和OD值关系，建立葡萄糖标准曲线，见图3。

[0040] 生物量测定采用细胞压缩体积（PCV）法，取发酵液4.0 mL，10000rpm离心10 min，计算沉淀固形物在总体积中的比例即是PCV。

[0041] 在发酵完成，灭活发酵液中微生物后，向发酵液中加入50% 80%提取试剂，实现安~丝菌素的抽提及去除固形物，所采用的提取试剂是水溶性的，提取速度较快，收率高，经过高效液相色谱制备，产品纯度较高。

[0042] 实施例

[0043] 实施例1不同培养基成分对AP-3发酵的影响

[0044] 考虑到初始培养基（见表2）中的胰蛋白胨、酵母膏两种成分价格因素，以去除这两种成分的初始培养基为基础，在摇瓶中进行发酵。实验使用的发酵菌种为珍贵橙色束丝放线菌ATCC 31565，摇瓶培养条件为：28℃，260 rpm，并于培养1天后，添加0.2%（v/v）异丁醇， 如不特别说明，采用的摇瓶容量为100 mL，装液量为30 mL，开始培养3天后补加3 mL浓度为100 g/L的葡萄糖溶液，以后每隔三天重复此操作，这样做目的有两个，一个是作为初步的补糖策略，一个是消除培养过程中蒸发对发酵结果的影响（实验证明采取此操作后发酵开始和结束时发酵液的体积基本一致），培养13天后收获发酵液。并用HPLC检测发酵液中AP-3的浓度，探索如表3所示不同成分组成的培养基对AP-3发酵的影响。

[0045] 表2.初始培养基

[0046]

[0047] 表3.2Ⅳ8-3析因设计因素编码表

[0048]

[0049] 本实验采用2Ⅳ8-3析因设计，按照Design-Expert软件（版本7.1.6）的输出结果（表4）进行实验，于实验结束后将AP-3检测结果输入程序得到分析结果（见图1）。

[0050] 表4.2Ⅳ8-3析因设计实验安排表

[0051]

[0052]

[0053] 从图1的效应分析图上可以观察到，有5种成分（A：葡萄糖，B：甘氨酸，C：玉米浆，D：缬氨酸，E：糊精）对AP-3发酵产生显著的影响，并且A成分和B成分及C成分之间有交互作用。
由表4可以看出，实验中AP-3最高发酵水平可达到270 mg/L以上，是初始培养基（140 mg/L）的1.93倍，得到较为满意的结果。用AP-3最高发酵水平的各种成分组合替换筛选初始培养基中的胰蛋白胨、酵母膏，组成新的发酵培养基配方，其中碳源为2.6%葡萄糖和1.5%糊精的混合，氮源为1.0%玉米浆、0.2%甘氨酸及0.2%缬氨酸的混合，并还含有0.5%的CaCl2·2H2O，
0.2%的KH2PO4，0.15%的NH3·H2O，0.05%的消泡剂。

[0054] 实施例2.15L-罐AP-3发酵（补料分批发酵）

[0055] 种子培养：将-20℃甘油保存管的珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565于平板上划线分离，26℃培养8天后，将二十个单菌落挑取到装 有发酵培养基的摇瓶中，培养5天，合并获得约0.5L培养液即是种子。

[0056] 使用15L发酵罐（上海洋格生物设备有限公司，）按照发酵培养基配方配制培养基10L，121℃,灭菌30min，冷却到28℃，将上述种子无菌接入。培养条件，温度28℃，pH 7.3，通过调节罐压0.03 0.08MPa，通气量0.1 0.6VVM，转速100 300rpm，将DO控制在40%以上。培养~ ~ ~
两天后补加0.2%（v/v）异丁醇，培养进行三天后开始补加含有450g/L的葡萄糖液，补糖速率为0.1L/d，直至培养结束。HPLC测得发酵结束时发酵液中AP-3含量为223mg/L，发酵过程的pH及PCV变化见图4。

[0057] 实施例3.150L-罐AP-3发酵（补料分批发酵）

[0058] 一级种子培养：将-20℃甘油保存管的珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565于平板上划线分离，26℃培养8天后，将二十个单菌落挑取到装有发酵培养基的摇瓶中，培养5天，合并获得约0.5L培养液即是种子。

[0059] 二级种子培养：使用15L发酵罐（上海洋格生设备有限公司，）按照发酵培养基配方配制培养基10L，121℃,灭菌30min，冷却到28℃，将上述种子无菌接入。培养条件，温度28℃，pH 7.3，通过调节罐压0.03 0.08MPa，通气量0.1 0.6VVM，转速100 300rpm，将DO控制在~ ~ ~40%以上。培养进行三天后开始补加含有450g/L的葡萄糖液，补糖速率为0.1L/d，直至培养结束。培养时间为5天。

[0060] 使用150L发酵罐（上海洋格生设备有限公司）按照发酵培养基配方配制培养基100L，121℃,灭菌30min，冷却到28℃，将上述5.0L种子无菌接入。培养条件，温度28℃，pH 
7.3，通过调节罐压0.03 0.08MPa，通气量0.1 0.6VVM，转速100 300rpm，将DO控制在40%以~ ~ ~
上。培养两天后补加0.2%（v/v）异丁醇，培养进行三天后开始补加含有450g/L的葡萄糖液，补糖速率为1.0L/d，直至培养结束。HPLC测得发酵结束时发酵液中AP-3含量为290mg/L，发酵过程的pH、葡萄糖浓度及PCV变化见图5。

[0061] 实施例4 150L-罐AP-3发酵（补料分批发酵和重复补料分批发酵相结合）[0062] 一级种子培养：将-20℃甘油保存管的珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565于平板上划线分离，26℃培养8天后，将二十个单菌落挑取到装有实施例1所述发酵培养基的摇瓶中，培养5天，合并获得约0.5 L培养液即是种子。

[0063] 二级种子培养：使用15 L发酵罐（上海洋格生设备有限公司）按照发酵培养基配方配制培养基10 L，121℃灭菌30 min，冷却到28℃，将上述种子无菌接入。培养条件为，温度28℃，pH 7.3，罐压0.03 0.08 MPa，通气量0.1 0.6 VVM，转速100 300 rpm，将DO控制在40%~ ~ ~
以上。培养进行三天后开始补加浓度为450 g/L的葡萄糖液，补糖速率为0.1 L/d，直至培养结束。培养时间为5天。

[0064] 补料分批发酵阶段：使用150 L发酵罐（上海洋格生设备有限公司）按照实施例1所述发酵培养基配方配制培养基100 L，121℃灭菌30min，冷却到28℃，将上述种子无菌接入。培养条件为，温度28℃，pH 7.3，罐压0.03 0.08 MPa，通气量0.1 0.6 VVM，转速100~ ~ ~
300rpm，将DO控制在40%以上。培养两天后补加0.2%（v/v）异丁醇，培养进行三天后开始补加浓度为450 g/L的葡萄糖液，补糖速率为1.0L/d。

[0065] 重复补料分批发酵阶段：补料分批发酵进行280 h后，放掉33 L发酵液（此时AP-3含量为320 mg/L），使用15 L发酵罐（上海洋格生设备有限公司）按照实施例1所述发酵培养基配方配制培养基30 L（分三次），121℃灭菌30 min，冷却到28℃，将之无菌转入到150L发酵罐，并同时加入0.10%（v/v）异丁醇，继续培养，培养条件同上。HPLC测得发酵结束时发酵液中AP-3含量为410 mg/L，明显高于实施例3中使用相同菌种和工艺参数而只进行补料分批发酵的150L-罐（290mg/L）。发酵过程的pH、葡萄糖浓度及PCV变化见图6。

[0066] 实施例5发酵液的处理及安丝菌素抽提

[0067] 将实施例4中的发酵培养液（105L）于发酵罐中加热至65℃，120rpm搅拌维持1.0 h。然后与0.6倍发酵液体积的丙醇混合，常温下，120 rpm搅拌2.0 h，离心，收集上清。菌丝沉淀重新添加0.5倍菌体体积的丙醇，常温下，120 rpm搅拌2.0 h，离心，收集上清。重复该步骤，直至所收集的上清不含或含较少量安丝菌素。向上述处理好的上 清液中添加0.1%（质量比）硫酸铝，静置过夜。将残留物絮凝出来后，离心收集上清液。

[0068] 实施例6安丝菌素初步分离及精制

[0069] 将实施例5中最后得到的上清液通过装有3kg硅胶的层析柱，使安丝菌素吸附到硅胶上。然后配制约2个柱体积的80%乙腈溶液，将安丝菌素洗脱下来。将洗脱液通过旋转蒸发仪蒸发掉多余溶剂，最终溶液体积在2-4L之间。将上述浓缩后的溶液通过0.45μm有机滤膜过滤，将过滤液上样到Varian Prostar218制备型高效液相色谱柱，收集纯的安丝菌素，并通过旋转蒸发仪蒸发掉多余溶剂。最后经过冷冻干燥40h，得到安丝菌素P-3 41.7g，以高效液相色谱检测其纯度大于98%，具体见图7（面积百分比即为纯度），核算收率约为95%。

[0070] 参考文献：

[0071] 1.Bandi Srinivasulu,Yoonjung Kim,Yongkeun Chang,et al.Construction of asm2 Deletion Mutant of Actinosynnema pretiosum and Medium Optimization for Ansamitocin P-3 Production Using Statistical Approach [J].J Microbiol Biotechnol,2006,16(9):1338-1346.

[0072] 2.Daniel Ng·Hing Kah Chin·Victor Vai Tak Wong Constitutive overexpression of asm2 and asm39 increase AP-3 production in the actionmycete Actionsynnema pretiosum[J].J Ind Microbiol Biotechnol.2009,36(11):1345 1351.~

[0073] 3.辛西亚·郭,格雷厄姆·S·宾,韦恩·C·威德森.用于制备安丝菌素的方法.中国发明专利公开号:101103120.专利申请日2005-12-12.METHODS FOR THE PRODUCTION OF ANSAMITOCINS.US20050170475A1.

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