适合转基因小麦定量检测的内标准基因引物设计及应用

摘要

本发明公开了一种适合转基因小麦定量检测的内标准基因引物设计及应用，其步骤：A、通过NCBI数据库BlastN筛选物种特异性好的基因，查找非同源区段设计引物，扩增区段，将上下游序列进行Primer-Blast检测；B、选取16个不同物种种子和35个不同小麦品种提取DNA；C、Southern Blot鉴定候选特异性好的PSG719、UCB基因位点数为6个，拷贝数为2个；D、PCR鉴定内标准基因引物物种特异性：E、PCR鉴定内标准基因引物不同小麦品种间稳定性。方法易行，操作简便，定性检测极限为0.95个小麦基因组，定量检测为5个小麦基因组,通过Real-time PCR检测,线性关系良好。

权利要求

1.一 种 转 基 因 小 麦 定 量 的 内 标 准 基 因 引 物，其 序 列 为：For: ATACCTCCCGCCTGGTGATTGTT；Rev: TAGTGCTCCCAACAGTTTTCAGACC。

说明书

适合转基因小麦定量检测的内标准基因引物设计及应用

[0001] 本申请是针对申请日为2011-12-21，申请号：201110432297.5，发明名称：适合转基因小麦定量检测的内标准基因引物设计及应用的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明属于植物检验检疫小麦属作物、食品、深加工产品转基因检测领域，更具体涉及一种利用Real-time PCR基于PSG719（Ta PSG719gene,FJ497025.1）、UCB（Tu CypB gene,EU868840.1）基因小麦种属特异性区段设计的用于小麦转基因定量检测中内标准基因引物，同时涉及一种转基因小麦定量的内标准基因引物的设计方法，还涉及一种转基因小麦定量的内标准基因引物的用途。

背景技术

[0003] 小麦作为世界第一大作物，由于受到转基因技术的限制，小麦转基因研究滞后于其它作物。近年来，我国在小麦转基因方面也取得了初步的进展，并获得了一批具有抗病虫、抗逆境及改善品质的转基因小麦新材料，部分品系已经进入环境释放阶段（尹钧，李永春我国小麦转基因研究的现状及发展趋势中国农业信息2009.13-17）。而人们也开始关注食品安全与健康，而与之相对的则是现有的转基因检测技术的发展仍然在缓步前行。

[0004] 出于对转基因食品可能存在的未知安全隐患的忧虑，同时也是对消费者知情权的保护，各国政府纷纷立法设立相关的检测阈值以利于管理（C.A.Carter International Approaches to the Labeling of Genetically Modified Foods Agricultural Issue Center University of California2003）。

[0005]

[0006] a：计划0.9%，低于1%；b:暂未执行

[0007] 而要对转基因食品所占成分进行定量，一个内标准基因就显得极为重要了：

[0008] 1.烘焙处理或者深加工食品其中可能掺杂了其它的添加剂或者其它食品，因此，内标准引物可以鉴定所提取的DNA样品质量；

[0009] 2.作为设置的一个阴性对照用以检测PCR是否正常；

[0010] 3.可以对总的反应体系中的DNA进行定量；

[0011] 4.由于具有物种特异性，因此，可以通过对外源基因与内源基因的进行比对，通过绝对相对定量来实现检测转基因成分比例的目的。

[0012] 甚至可以毫不夸张地说，一个合适的内标准引物是定量检测转基因的前提和基础。而一个合适的内标准引物应该具有几个特点：

[0013] 1.具有物种种属特异性；

[0014] 2.在各个品种之间稳定存在，不存在拟等位基因；

[0015] 3.基因组中拷贝数目确定且较低。

[0016] PSG719：小麦PSG719的启动子是一个具有花粉且在花粉发育中期直到花药成熟期间特异表达的启动子，它除了与小麦或大麦中的部分EST具有同源性外，与其他物种均不具有任何同源性，表明该基因具有极好的物种特异性（Ling Chen,Guangyuan He.Isolation and heterologous transformation analysis of a pollen-specific promoter from wheat(Triticum aestivum L.)Mol Biol Rep201037:737–744）；

[0017] UCB：urartu cyclophilin B基因编码一个新的定位于内质网的亲环素B蛋白，该蛋白可能参与存储蛋白折叠，该基因在面包小麦中具有8个定位（Huimei Wu,Emma Wensley.Identification and analysis of genes encoding a novel ER-localised Cyclophilin B in wheat potentially involved in storage protein folding,Plant Science2009420–432）。然而通过本实验证明具有6个定位位点。

发明内容

[0018] 本发明的目的是在于提供了一种转基因小麦定量的内标准基因引物，具有良好的小麦属物种特异性，优异的种间稳定性，定性检测极限为0.95个小麦基因组,定量检测为5个拷贝数的小麦基因组,通过Real-time PCR检测,线性关系良好。

[0019] 本发明的另一个目的是在于提供了一种转基因小麦定量的内标准基因引物的制备方法，方法易行，操作简便，通过生物信息学方法,筛选到符合要求的具有种属特异性、种间稳定性良好内标准基因。

[0020] 本发明的再一个目的是在于提供了一种转基因小麦定量的内标准基因引物在小麦转基因定量检测中的应用，定性检测极限为0.95个小麦基因组,定量检测为5个小麦基因组,通过Real-time PCR检测,线性关系良好。

[0021] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

[0022] 一种转基因小麦定量的内标准基因引物的制备方法，其步骤是：

[0023] A、通过不同数据库（NCBI、EMBL、DDBJ）筛选结构基因，并通过生物信息学方法检测其物种特异性，设计引物，并验证其引物在不同数据库中的可能产物；

[0024] B、灭菌消毒萌发35种不同小麦品种与15个不同物种种子，取叶片CTAB法(M.G.Murray,W.F.Thompson.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.Nucleic Acids Research.1980Vol.8No.19)提取DNA；

[0025] 挑选饱满干净的种子，70%(V/V)乙醇浸泡30秒，然后10%NaClO浸泡10分钟，无菌水冲洗3-5次每次1-3min，消毒的种子浸泡在无菌水中、28℃，220r/min萌动过夜，露白后放置于灭菌培养皿中滤纸上萌发至2叶期取幼嫩叶片；

[0026] C、Southern Blot鉴定PSG719、UCB基因在六倍体小麦中的位点数；

[0027] D、普通PCR鉴定其在15个不同物种DNA扩增情况，检测其物种特异性；

[0028] E、普通PCR鉴定其在35个不同品种小麦DNA扩增情况，鉴定其品种间稳定性。

[0029] 两对内标准基因引物及信息见下表:

[0030]

[0031] 一种转基因小麦定量的内标准基因引物在小麦转基因定量检测中的应用，其步骤是：

[0032] A、普通PCR确定内标准基因引物检测极限；

[0033] B、Real-time PCR确定其定量检测极限；

[0034] C、Real-time PCR确定CT值与小麦基因组数目之间的线性关系。

[0035] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

[0036] 在国内2006年由栾凤侠等人设计的基于γ-醇溶蛋白基因(GAG56D)的内标准基因引物可以用于转基因小麦定性检测（栾凤侠,张洪祥，白月小麦内源特异参照基因的查找与定性PCR和实时荧光PCR验证生物技术200616卷6期：50）；而在国外，MAYU IIDA等人通过设计以小麦D基因组中的Waxy-D1为模板的内标准引物检测极限为15个基因组，定量极限未知（MAYU IIDA,AKIHIRO HINO Development of Taxon-Specific Sequences of Common Wheat for the Detection of Genetically Modified Wheat.J.Agric.Food Chem.2005,53,6294-6300）;Hernandez等人基于ACC-1基因设计的内标准基因引物检测极限1个基因组，定量极限20个基因组(M.Hernandez Real-Time Polymerase Chain Reaction Based Assays for Quantitative Detection of Barley,Rice,Sunflower,and Wheat.J.Agric.Food Chem.2005,53,7003-7009)；2006年，Ronning等人基于PKABA1基因设计的内标准基因引物检测极限与本实验大体一致，定量极限为5个基因组，检测极限1.8个基因组(S.B.Ronning,A.H.Jensen.Novel Reference Gene,PKABA1,Used in a Duplex Real-Time Polymerase Chain Reaction for Detection and Quantitation of Wheat-and Barley-Derived DNA.J.Agric.Food Chem.2006,54,682-687)；Vautrin等人基于ALMT-1基因设计的内标准基因引物检测极限2个基因组，定量极限20个基因组(S.Vautrin,D.Zhang.Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay for Endogenous Reference Gene for Specific Detection and Quantification of Common Wheat-Derived DNA(Triticum aestivum L.).Journal of AOAC international2007vol.90,no.3,)。本发明的用于转基因小麦定量检测的两对内标准引物检测极限为0.95个小麦基因组，定量检测极限为5个小麦基因组。附图说明:

[0037] 图1a为一种BlastN检测PSG基因物种特异性示意图。

[0038] PSG719基因在禾本科中小麦属特异性好，仅找到小麦属中的目的基因PSG719具有高同源性；

[0039] 图1b为一种BlastN检测UCB基因物种特异性示意图。

[0040] UCB基因在禾本科中小麦属特异性好，仅找到小麦属中的目的基因UCB具有高同源性；

[0041] 图2a为一种Primer-Blast检测PSGF2/PSGR2引物特异性示意图。

[0042] 在NCBI数据库中通过Primer-Blast检测引物在禾本科中的可能扩增产物，仅找到设计引物区段产物

[0043] 图2b为一种Primer-Blast检测UCBF2/UCBR2引物特异性示意图。

[0044] 在NCBI数据库中通过Primer-Blast检测引物在禾本科中的可能扩增产物，仅找到设计引物区段产物

[0045] 图3a为一种检测PSGF2/PSGR2引物特异性示意图。

[0046] PSGF2/PSGR2在16不同物种中的 扩增结果：1：DL100Marker；2：ddH2O；3：Triticum aestivum:郑9023；

[0047] 4-12：oryza Sativa：华质49、华560、华564、Ne-3、Ne-9、Ne-L-11、RHS、ZR64、9311；13-17：Hordeum vulgare：大麦1号、大麦6741、大麦A438、大麦07A349、大麦32386；
18：Zea mays：郑单958；19：Secale cereale:黑麦4；20：Lycopersicon sculentun：番茄3号；21：Vigna unguiculata：江西丰城3号；22：Brassica campestris：油菜3；23：
Brassica rapa：华良早5号；24：Gossypium spp：鄂棉杂；25：Giycine max：中黄3号；26：
Arabidopsis thaliana:;27:Vigna radiata：中绿1号；28：Cucumis sativus：华黄瓜2号；
29：Solanum tuberosum：中薯13；30：Pisum sativum：中豌6。仅在小麦属的郑9023中有扩增产物。

[0048] 图3b为一种检测UCBF2/UCBR2引物特异性示意图。

[0049] UCBF2/UCBR2在16不同物种中的 扩增结果：1：DL100Marker；2：ddH2O；3：Triticum aestivum:郑9023；

[0050] 4-12：oryza Sativa：华质49、华560、华564、Ne-3、Ne-9、Ne-L-11、RHS、ZR64、9311；13-17：Hordeum vulgare：大麦1号、大麦6741、大麦A438、大麦07A349、大麦32386；
18：Zea mays：郑单958；19：Secale cereale:黑麦4；20：Lycopersicon sculentun：番茄3号；21：Vigna unguiculata：江西丰城3号；22：Brassica campestris：油菜3；23：
Brassica rapa：华良早5号；24：Gossypium spp：鄂棉杂；25：Giycine max：中黄3号；26：
Arabidopsis thaliana:;27:Vigna radiata：中绿1号；28：Cucumis sativus：华黄瓜2号；
29：Solanum tuberosum：中薯13；30：Pisum sativum：中豌6。仅在小麦属的郑9023中有扩增产物。

[0051] 图4a为一种检测PSGF2/PSGR2种间稳定性示意图。

[0052] PSGF2/PSGR2在35个不同小麦品种中的扩增结果：1、20为DL100Marker；2为ddH2O；3-19、21-38依次为35个小麦品种：Ponpei，周麦19，豫农99，豫麦10，温麦6号，郑麦004，小偃81，徐麦958，泰山034682，洛麦21，冀58，科农119，新原958，中国春，矮抗8号，吨抗58，运4002，烟福188，平安3号，众麦1号，新麦19，阜麦936，冀麦776，郑9023，豫农
49498，豫农391，豫麦9676，豫麦7036，豫麦58，周麦16,温麦8，温麦19，泰山04533，丰舞
981，矮抗58

[0053] 在所有小麦品种中均有目的条带

[0054] 图4b为一种检测UCBF2/UCBR2种间稳定性示意图。

[0055] UCBF2/UCBR2在35个不同小麦品种中的扩增结果：1、20为DL100Marker；2为ddH2O；3-19、21-38依次为35个小麦品种：Ponpei，周麦19，豫农99，豫麦10，温麦6号，郑麦004，小偃81，徐麦958，泰山034682，洛麦21，冀58，科农119，新原958，中国春，矮抗8号，吨抗58，运4002，烟福188，平安3号，众麦1号，新麦19，阜麦936，冀麦776，郑9023，豫农49498，豫农391，豫麦9676，豫麦7036，豫麦58，周麦16,温麦8，温麦19，泰山04533，丰舞981，矮抗58

[0056] 在所有小麦品种中均有目的条带

[0057] 图5a为一种Southern Blot鉴定PSG基因大致位点示意图。

[0058] 1-4依次表示ECoR V、Hind III、Nde I、SaC I酶切消化Yangmai158基因组DNA，PSG719最多为2号泳道有多达6个条带，由此推知PSG719在六倍体小麦中有6个定位位点。

[0059] 图5b为一种Southern Blot鉴定UCB基因大致位点示意图。

[0060] 1-4依次表示ECoR V、Hind III、Nde I、SaC I酶切消化Yangmai158基因组DNA，UCB在4号泳道有6个条带，由此推知UCB在六倍体小麦中有6个定位位点。

[0061] 图6a为一种普通PCR检测PSGF2/PSGR2检测极限示意图。

[0062] 其中：1.DL100Marker;2.ddH2O;3.82.33ng;4.16.5ng;5.8.233ng;6.1.65ng;7.823pg;8.165pg;9.82.3pg;10.16.5pg;11.8.23pg;12.4.1pg;13.1.65pg。PSG719常规PCR检测极限为16.5pg或0.95个基因组。

[0063] 图6b为一种普通PCR检测UCBF2/UCBR2检测极限示意图。

[0064] 其中：1.DL100Marker;2.ddH2O;3.82.33ng;4.16.5ng;5.8.233ng;6.1.65ng;7.823pg;8.165pg;9.82.3pg;10.16.5pg;11.8.23pg;12.4.1pg;13.1.65pg。UCB常规PCR检测极限为16.5pg或0.95个基因组。

[0065] 图7a为一种Real-time PCR PSGF2/PSGR2溶解峰值示意图。

[0066] 通过查看PSGF2/PSGR2Real-time PCR扩增溶解曲线，在反应中仅有一个峰值，证明其无非预期产物

[0067] 图7b为一种Real-time PCR UCBF2/UCBR2溶解峰值示意图。

[0068] 通过查看UCBF2/UCBR2Real-time PCR扩增溶解曲线，在反应中仅有一个峰值，证明其无非预期产物

[0069] 图8a为一种Real-time PCR PSGF2/PSGR2扩增循环曲线示意图。

[0070] 通过查看PSGF2/PSGR2Real-time PCR扩增循环曲线，梯度相关性，扩增荧光累积量均正常。

[0071] 图8b为一种Real-time PCR UCBF2/UCBR2扩增循环曲线示意图。

[0072] 通过查看UCBF2/UCBR2Real-time PCR扩增循环曲线，梯度相关性，扩增荧光累积量均正常。

[0073] 图9a为一种Real-time PCR PSGF2/PSGR2扩增标准曲线示意图。

[0074] 利用Roche480所带软件分析扩增CT值与PSGF2/PSGR2PCR体系起始DNA浓度之间的线性关系，结果良好。图9b为一种Real-time PCR UCBF2/UCBR2扩增标准曲线示意图。

[0075] 利用Roche480所带软件分析扩增CT值与UCBF2/UCBR2PCR体系起始DNA浓度之间的线性关系，结果良好。

具体实施方式

[0076] 实施例1：

[0077] 一种转基因小麦定量的内标准基因引物的制备方法（及其物种特异性、品种间稳定性验证），其步骤是：A、通过NCBI数据库BlastN筛选物种特异性好的基因，查找非同源区段设计引物，扩增区段如下，同时将上下游序列进行Primer-Blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/#），设置参数为：特异物种：Poales（禾本科）；数据库：nr（Non-Redundant，非冗余序列）

[0078] PSG种属特异性区段:（其序列为SEQ ID NO：1所示）

[0079] 601 CTTTTCCGAA CTTTTCCATC AAGACCTATT AACGTGGGAT CTAGTTATGA AGATCTTGAC[0080] 661 GCGAGAAATC CAATGATGAA ACCGGTTAGG AATGCGGACG CACATTTCAA GAGATATATA[0081] 721 TTTTTGGAAT AATTGGAACT ACAGAAAAGC AAAGAAAAAA CCATGTTGCG ACAAGTGGTG[0082] 781 CACATTGTCA GCGCCTAGGA AGATGGGTGT GACCTTTGTA AGGGCTACCG TCAGTTGATG[0083] 841 ATTTTGGAGT ATCCAGCGCG CTGGAAGAAT TCTATTCCGT GCATGGCGCA TAGAATAGTT[0084] 备注：来自于NCBI Datebase，Gene Accession：FJ497025.1

[0085] UCB种属特异性区段:（其序列为SEQ ID NO：2所示）

[0086] 2641 ATACCTCCCG CCTGGTGATT GTTTTTTTAT GAGGACCAAT CTCACAGTAG TTTTATACTT

[0087] 2701 GAAAATCTTT AAAGAAACAT TTCTGGCTTT ACGCTTTAAA AGGTCTGAAA ACTGTTGGGA

[0088] 2761 GCACTACCCT ATGACCTTTG TGTCGATGAA GCTCCACCAC TGCCCGGTAG AGGAGAATCT

[0089] 备注：来自于NCBI Datebase，Gene Accession：EU868840.1

[0090] 利用Primer5（Primer Co.Ltd.Canada）设计的符合无错配，低发夹结构，二聚体自由能低等要求的内标准基因引物，其相关信息见下表：

[0091] 内标准基因引物序列及相关信息

[0092]

[0093] 通过上述引物，可以利用绝对定量检测体系中的DNA拷贝数，同时可以通过与外源基因同时扩增，利用绝对相对定量法检测外源插入基因插入位点数与转基因成分所占比例。

[0094] B、实验材料：

[0095] 16个不同物种种子：1：小麦Triticum aestivum:郑9023；2：水稻oryza Sativa：华质49、华560、华564、Ne-3、Ne-9、Ne-L-11、RHS、ZR64、9311；3：大麦Hordeum vulgare：
大麦1号、大麦6741、大麦A438、大麦07A349、大麦32386；4：玉米Zea mays：郑单958；5：
黑麦Secale cereale:黑麦4；6：番茄Lycopersiconsculentun：番茄3号；7：豇豆Vigna unguiculata：江西丰城3号；8：油菜Brassica campestris：油菜3；9：小白菜Brassica rapa：华良早5号；10：棉花Gossypium spp：鄂棉杂；11：黄豆Giycine max：中黄3号；12：
拟南芥Arabidopsis thaliana:;13:绿豆Vigna radiata：中绿1号；14：黄瓜Cucumis sativus：华黄瓜2号；15：马铃薯Solanum tuberosum：中薯13；16：豌豆Pisum sativum：
中豌6

[0096] 35个不同小麦品种：Ponpei，周麦19，豫农99，豫麦10，温麦6号，郑麦004，小偃81，徐麦958，泰山034682，洛麦21，冀58，科农119，新原958，中国春，矮抗8号，吨抗58，运4002，烟福188，平安3号，众麦1号，新麦19，阜麦936，冀麦776，郑9023，豫农49498，豫农391，豫麦9676，豫麦7036，豫麦58，周麦16,温麦8，温麦19，泰山04533，丰舞981，矮抗
58。

[0097] 不同物种种子灭菌消毒取叶片：

[0098] 挑选饱满干净的种子，70%（V/V，以下相同）乙醇浸泡30秒，然后10%NaClO浸泡10分钟，无菌水冲洗3-5次每次1-3min，消毒的种子浸泡在无菌水中、28℃，220r/min萌动过夜，露白后放置于灭菌培养皿中滤纸上萌发至2叶期取幼嫩叶片。

[0099] 提取DNA：

[0100] 取 幼 嫩 小 麦 叶 片，采 用 改 进 的 CTAB法（M.G.Murray,W.F.Thompson.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.Nucleic Acids Research.1980Vol.8No.19）抽提DNA，具体步骤如下：

[0101] 1）取小麦幼嫩叶片0.1～0.5g放入烘干灭菌的研钵，倒入液氮迅速将叶片磨成粉末并装入2ml离心管中。

[0102] 2）磨好的样品中加入0.9ml预热的CTAB缓冲液混匀，65℃水浴1小时，期间颠倒混匀3次。

[0103] 3）加入5mol/L的醋酸钾214μl，氯仿158μl，上下颠倒混匀至氯仿层颜色加深，-20℃放置30min。

[0104] 4）室温（20-25℃，以下相同）下10500r/min离心15min，吸取上清液700μl转移入新的1.5ml离心管，加入560μl异丙醇，70μl3mol/L的醋酸钠，颠倒混匀，室温放置10min。

[0105] 5）10000r/min离心15min，弃上清，风干至异丙醇挥发完全（约20min）。

[0106] 6）加入500μl预冷的70%乙醇浸洗沉淀，将沉淀悬起，使之脱离管底。

[0107] 7）10500r/min离心5min，弃上清，自然干燥。

[0108] 8）加入30μl TE缓冲液，0.1～0.2μl10mg/ml RNase A，4℃过夜溶解，-20℃贮存备用。

[0109] C、Southern Blot鉴定位点数：

[0110] Southern杂交探针引物序列

[0111]

[0112] 用Takara的随机引物标记试剂盒进行探针的同位素标记。

[0113] 标记的步骤如下：

[0114] 1)在1.5ml离心管中加入100ng探针DNA，2μl随机引物；并补水到14μl。

[0115] 2)沸水中煮沸5min，冰水浴中冷却5min，离心。

[0116] 3)加入2.5μl10×Buffer，2.5μl dNTP，5μlα-[P32]-dCTP。

[0117] 4)加入1μl DNA聚合酶。37℃水浴30min。

[0118] 5）加入1.6μl的0.5M EDTA，终止反应。

[0119] 6)沸水中煮沸5min，冰水浴中冷却10min，离心。

[0120] 酶切和电泳：

[0121] 取约15～20μg小麦基因组DNA，分别加3U/μg的限制性内切酶ECoR V、Hind III、Nde I、SaC I，在合适的反应体系中，37℃的温箱中进行DNA的消化。酶切时间为12h左右。

[0122] 1)酶切结束后，取二十分之一的DNA在0.8%的胶上电泳检测酶切的效果，其他的放在4℃中。

[0123] 2)检测完后，若酶切效果可以，将DNA于75℃水浴中灭活10min，然后置于4℃中备用。

[0124] 3)电泳前于56℃水浴中，2～3min，使重新粘连的片段断开。

[0125] 4)制0.8％（m/V）的琼脂糖凝胶，胶厚度10mm，360ml胶，梳孔宽7mm。胶倒好后，检查一下孔里是否有气泡。

[0126] 5)DNA样品中加入0.1倍体积10×Loading Buffer。混合均匀后，缓慢的点入孔内，使DNA沉入底部。

[0127] 6)先在100V的电压下进样10min，然后在30V的电压下电泳20h，使溴酚兰到点样孔的距离为15cm左右。

[0128] 7)电泳结束后用一个荧光标尺标记Marker各条带与点样孔间的距离。

[0129] 转膜：

[0130] 1)用刀片切去胶的无用部分，但是要留下一半的点样孔，便于将其标示在杂交膜上。

[0131] 2)在胶的左下角（第一个样品的末端）切一个小三角，用于标记电泳的方向。

[0132] 3)将Marker泳道切去。

[0133] 4)将胶浸入盛有0.2M HCl的塑料盘中，至溴酚兰变为黄色，立即将胶转入蒸馏水中反复漂洗约10min。

[0134] 5)将胶在0.4M NaOH/1M NaCl溶液中浸泡胶25min，并反复的摇动；

[0135] 6)裁一块四周都比胶大2mm的杂交膜，及两块与膜同样大小的厚滤纸。

[0136] 7)将裁好的杂交膜漂在蒸馏水中，直至从上到下都被浸湿，将其转入碱转移液中浸5min，然后用干净的剪刀剪去膜的一角，正好与胶上切出的角对应。

[0137] 8)DNA变性过程的同时，在塑料盘中加入合适量的转移液，并在盘上放一块合适大小的玻璃板。裁两块比较大的滤纸条（用作盐桥），将其中间浸湿搭于玻璃板上，两头浸在转移液中，使滤纸完全浸湿，并用玻璃棒将可能的气泡赶去。

[0138] 9)将第5步中变性好的胶点样孔方向向下置于盐桥的中央，胶与滤纸之间不能有气泡，用塑料片将胶的四周围起来，以免转印短路。

[0139] 10)将适量没过胶面的转移液洒于胶上，将膜缓慢的盖在胶上，避免气泡，膜的一边应该稍稍超出胶的点样孔线。放好后就不能再移动。

[0140] 11)用转移液浸湿两张厚滤纸，然后将其放在膜上。用玻璃棒赶出气泡。

[0141] 12)将5～8cm厚的吸水纸（与步骤6的印迹滤纸同样大小）放置在印迹滤纸上，上面放一块玻璃板，并放约500g的重物。

[0142] 13)随时更换浸湿的吸水纸，同时注意补加转移液，转移24h。

[0143] 14)转移完毕后，将吸水纸和印迹滤纸揭去，将膜置于干燥的滤纸上。

[0144] 15)把膜放在中和缓冲液（0.5M Tris-Cl(pH7.2)，1M NaCl）中浸泡10min。用两张滤纸包住膜，在室温下干燥膜30min，然后置于80℃的干燥箱中，干燥1.5h。杂交膜如果不直接用于杂交，可用滤纸包起来，在4℃中保存。

[0145] 预杂交：

[0146] 1)根据表3.2配制预杂交液。

[0147] 2)将膜浸入6×SSC或6×SSPE使膜充分的浸湿约2min。

[0148] 3)将Salmon Sperm DNA在沸水中煮8min。冰水浴中充分冷却(10min)。加入65℃预热的杂交液中。

[0149] 4)轻柔的将浸湿的杂交膜卷成圆柱形，放入杂交管中，加入65℃预热的预杂交液，旋转杂交管，去除气泡，拧紧杂交管。

[0150] 5)将杂交管放入65℃的杂交炉中，预杂交15h左右。

[0151] （预）杂交液组成（10ml）

[0152]

[0153] 杂交：

[0154] 1)补加300μl杂交液于标记好的探针液中，100℃煮沸5min，放在冰水浴中冷却，离心。

[0155] 2)倒掉预杂交液，将65℃预热的杂交液加入杂交管中，再将变性的探针加入杂交管中，杂交36h左右。

[0156] 洗膜：

[0157] 1)将杂交膜从杂交管中取出，将杂交液倒入放射性废液桶中。

[0158] 2)将膜放入盛有300ml的1x SSC和0.5%SDS洗膜液的塑料盘中，室温下摇动10min。

[0159] 3)将第一次的洗膜液倒入放射性废液桶中，加入300ml的1x SSC和0.1%SDS洗膜液，45℃，摇动2min。

[0160] 放射自显影：

[0161] 1)将膜从洗膜液中取出，放置在干净的滤纸上，除去大部分的液体。

[0162] 2)然后用保鲜膜包住，放在曝光夹中，将磷屏压上。压片15h左右。

[0163] 3)将磷屏取出，在富士公司的磷屏显像仪上照相。

[0164] 杂交膜的回收利用：

[0165] 1)将0.1%SDS煮沸。

[0166] 2)将其倒入放有膜的塑料盒中，反复摇动15min。

[0167] 3)用2×SSC漂洗。

[0168] PSG719最多为2号泳道有多达6个条带，UCB在4号泳道有6个条带。由此推知PSG719、UCB在六倍体小麦中有6个定位位点,2个拷贝。

[0169] D、物种特异性检测：

[0170] PCR反应体系：

[0171] 10X EasyTaq Buffer(Transgene Co.Ltd,China),

[0172] 2U EasyTaq Polymerase,

[0173] 120μM dNTPs,

[0174] 1μL模板DNA（不同物种叶片提取DNA,约100ng/μL）

[0175] 200μM上、下游引物,

[0176] ddH2O补足至25μL;

[0177] PCR反应条件

[0178] （ABI2720ThermoCycler,Applied Biosystem Co.Ltd,USA）

[0179] 预变性：95℃5min;

[0180] 扩增：94℃40s,

[0181] Ta40s,

[0182] 72℃20s40Cycle;

[0183] 再延伸：72℃10min;

[0184] 保温：10℃10min

[0185] E、不同小麦品种间稳定性检测：

[0186] PCR反应体系：

[0187] 10X EasyTaq Buffer(Transgene Co.Ltd,China),

[0188] 2U EasyTaq Polymerase,

[0189] 120μM dNTPs,

[0190] 1μL模板DNA（不同品种小麦叶片提取DNA,约100ng/μL）

[0191] 200μM上、下游引物,

[0192] ddH2O补足至25μL;

[0193] PCR反应条件

[0194] （ABI2720ThermoCycler,Applied Biosystem Co.Ltd,USA）

[0195] 预变性：95℃5min;

[0196] 扩增：94℃40s,

[0197] Ta40s,

[0198] 72℃20s40Cycle;

[0199] 再延伸：72℃10min;

[0200] 保温：10℃10min

[0201] 通过以上实验可以确定两对候选引物均具有良好的物种特异性，优异的品种间稳定性。适合做转基因小麦检测时的定性或定量检测的两对内标准基因引物。

[0202] 两对内标准基因引物及信息见下表:

[0203]

[0204] 实施例2：

[0205] 一种转基因小麦定量的内标准基因引物在小麦转基因定量检测中的应用，其步骤是：

[0206] A、普通PCR确定检测极限：

[0207] PCR反应体系：

[0208] 10X EasyTaq Buffer(Transgene Co.Ltd,China),

[0209] 2U EasyTaq Polymerase,

[0210] 120μM dNTPs,

[0211] 1μL模板DNA（小麦提取DNA，NanoDrop测定浓度，并梯度稀释，浓度依次为：1.82.33ng;2.16.5ng;3.8.233ng;4.1.65ng;5.823pg;6.165pg;7.82.3pg;8.16.5pg;9.8.2
3pg;10.4.1pg;11.1.65pg）

[0212] 200μM上、下游引物,

[0213] ddH2O补足至25μL;

[0214] PCR反应条件：

[0215] （ABI2720ThermoCycler,Applied Biosystem Co.Ltd,USA）

[0216] 预变性：95℃5min;

[0217] 扩增：94℃15s,

[0218] Ta20s,

[0219] 72℃20s40Cycle;

[0220] 再延伸：72℃10min;

[0221] 保温：10℃10min

[0222] 如图6所示，UCB在小麦中的检测极限为16.5pg或者0.95个基因组。

[0223] B、定量PCR确定定量检测极限

[0224] Real-time PCR体系

[0225] 2X SsoFast Eva SYBR GreenI mixture（Bio-Rad Co.Ltd,USA）,[0226] 125μM上、下游引物,

[0227] 1μL DNA模板(梯度稀释),

[0228] ddH2O补足至20μL;

[0229] Real-time PCR条件

[0230] （Roche LightCycler480III,Roche Co.Ltd,Switzerland）

[0231] Pre-Denaturation：98℃2min；

[0232] Quantitative：98℃5s，

[0233] Ta20s，

[0234] 72℃20s(single)45Cycele；

[0235] Melting Curve：95℃10s，

[0236] 65℃1min，

[0237] 95℃(continuous)；

[0238] Cooling：40℃2min

[0239] 定量检测极限，PCR体系中模板逐级稀释，浓度及计算结果见下表[0240] PSG719定量检测极限:

[0241]

[0242]

[0243] UCB定量检测极限:

[0244]

[0245] C、Real-time PCR检测CT值与DNA起始浓度之间的线性相关性

[0246] 为了鉴定内标准基因引物在定量检测线性相关性，每个PCR体系中模板[0247] Real-time PCR体系

[0248] 2X SsoFast Eva SYBR GreenI mixture（Bio-Rad Co.Ltd,USA）,[0249] 125μM正向/反向引物,

[0250] 1μL DNA模板(梯度稀释，基因组拷贝数量依次为：9990,4995,2497.5,1248.8,624.4,312.2,78.0,39.0),

[0251] ddH2O补足至20μL;

[0252] Real-time PCR条件

[0253] （Roche LightCycler480III,Roche Co.Ltd,Switzerland）

[0254] Pre-Denaturation：98℃2min；

[0255] Quantitative：98℃5s，

[0256] Ta20s，

[0257] 72℃20s(single)45Cycele；

[0258] Melting Curve：95℃10s，

[0259] 65℃1min，

[0260] 95℃(continuous)；

[0261] Cooling：40℃2min

[0262] Real-time PCR条件

[0263] Real-time PCR（LightCycler480III,Roche Co.Ltd.Switzerland）[0264] Pre-Denaturation:98℃2min;

[0265] Amplification,Quantitative:98℃5S,62℃20S,72℃20S(Single)45Cycle[0266] 如图7、8、9所示，溶解峰值、扩增曲线、标准曲线均很好，线性相关性很好。

[0267]

[0268]

[0269] n/N＝Transgenic%…………………………………(3)

[0270]

[0271]

[0272] EF、EF=外源基因，内标基因扩增效率；CTF、CTR=外源基因，内标基因扩增循环阈值；n=外源基因插入位点数与内标准基因定位位点数比值，N=单倍体基因组中外源基因插入位点数与内标准基因位点数比值，当样品为100%转基因时，n=N。

[0273] 通过利用公式（1），100%转基因材料可以检测外源基因插入位点数，当EF=EF=1时，可以通过公式（2）快速计算得知；

[0274] 公式（4）可以定量检测小麦基因组拷贝数；

[0275] 当已知一种转基因小麦外源插入位点数时，利用公式（3）计算转基因成分所占百分比。