H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR试剂盒及其应用转让专利
申请号 : CN201410057223.1
文献号 : CN103805720B
文献日 : 2016-03-09
发明人 : 谢芝勋 , 谢志勤 , 刘加波 , 庞耀珊 , 邓显文 , 谢丽基 , 范晴 , 罗思思
申请人 : 广西壮族自治区兽医研究所
摘要 :
本发明公开了一种H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒的二重RT-PCR试剂盒及其应用。该试剂盒中含有用于鉴定或辅助鉴定AIVH9和APV的引物对组，组成如下：序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1，和由序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2。实验证明，本发明仅需一次PCR就能同时检测和鉴别AIVH9和APV两种病原体，具有特异性强、灵敏度高、低成本、高效率等优点；且本发明在引物设计上利用扩增片段长度的不同可直接判定扩增结果，更简便、直观和实用。本发明最低能同时检出10pg AIVH9RNA和10pg APV RNA，其敏感性为由这两种病毒引起的早期发病提供了快速准确的诊断结果，对预防和控制这两种病具有重要意义，对养鸡业可持续健康发展有重要的现实意义。
权利要求 :
1.用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒的引物对组，其特征在于：所述引物对组由两个引物对组成，一个引物对是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的用于鉴定或辅助鉴定所述H9亚型禽流感病毒的引物对1，另一个引物对是由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的用于鉴定或辅助鉴定所述禽肺炎病毒的引物对2；
所述引物对组中的所述引物对1和所述引物对2在PCR反应体系中的摩尔比为1:1；
所述引物对1和所述引物对2中各引物对的两条引物均等摩尔。
2.用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒的试剂，由权利要求1所述的引物对组和RT-PCR扩增缓冲液组成。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述RT-PCR扩增缓冲液中含有dNTPs、
2+
Mg 、反转录随机引物、反转录酶、RNA酶抑制剂和DNA聚合酶。
4.用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒的试剂盒，含有下述a)和b)：a)作为阳性对照的H9亚型禽流感病毒cDNA和禽肺炎病毒cDNA；
b)权利要求1所述引物对组，或权利要求2或3所述的试剂。
5.权利要求1所述引物对组的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括将权利要求1所述引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
6.如下c)或d)的应用：
c)权利要求1所述引物对组在制备权利要求2或3所述试剂或权利要求4所述试剂盒中的应用；
d)权利要求1所述引物对组或权利要求2或3所述试剂或权利要求4所述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有H9亚型禽流感病毒和/或禽肺炎病毒的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：d)所述应用中，所述检测或辅助检测待测样品中是否含有H9亚型禽流感病毒和/或禽肺炎病毒为用权利要求1所述的引物对组或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒对所述待测样品进行RT-PCR反应，根据PCR产物的大小确定所述待测样品中是否含有H9亚型禽流感病毒和/或禽肺炎病毒；
所述进行RT-PCR反应的退火温度为50℃-60℃。
说明书 :
H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR试剂盒及其
应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒的二重RT-PCR试剂盒及其应用。
背景技术
[0002] H9亚型禽流感病毒（Avian Influence virus subtype H9，AIV H9）和禽肺炎病毒（Avian pneumovirus，APV）是危害养鸡业的两种主要病毒。禽肺炎病毒属于副黏病毒科，主要引起上呼吸道的症状，以喷嚏，眼结膜潮红，泪腺肿，头部出现皮下水肿，俗称肿头；产蛋鸡感染主要引起产蛋下降2%-40%，孵化率降低；随着病情的发展，还表现出神经症状。
而H9亚型禽流感病毒是A型流感病毒，属正粘病毒科流感病毒属，病毒基因组为分节段的单股负链RNA，包含8个基因。H9亚型禽流感病毒感染的鸡也会引起上呼吸道的症状，以咳嗽、呼吸啰音为特征，支气管堵塞，严重时可引起鸡大批死亡。这两种病毒引起鸡的呼吸道症状在临床上很相似，有时很难区分，容易混淆，主要表现在咳嗽，有呼吸啰音，有些鸡头部出现肿胀，流眼泪。
而H9亚型禽流感病毒是A型流感病毒，属正粘病毒科流感病毒属，病毒基因组为分节段的单股负链RNA，包含8个基因。H9亚型禽流感病毒感染的鸡也会引起上呼吸道的症状，以咳嗽、呼吸啰音为特征，支气管堵塞，严重时可引起鸡大批死亡。这两种病毒引起鸡的呼吸道症状在临床上很相似，有时很难区分，容易混淆，主要表现在咳嗽，有呼吸啰音，有些鸡头部出现肿胀，流眼泪。
[0003] PCR技术由于具有敏感性高、特异性好、快速简便等特点，已经走进临床诊断实验室并广泛应用于各种禽病病原体的检测，包括用于AIV和APV的检测。二重PCR是一种特殊的PCR形式，其突出特点是，一次PCR反应，能同时检测并鉴别出两种病原体，在临床上具有很高的应用价值。
发明内容
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒的引物对组。
[0005] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒的引物对组，由两个引物对组成，一个引物对是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的用于鉴定或辅助鉴定所述H9亚型禽流感病毒的引物对1，另一个引物对是由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的用于鉴定或辅助鉴定所述禽肺炎病毒的引物对2。
[0006] 其中，序列1由24个核苷酸组成；序列2由23个核苷酸组成；序列3由20个核苷酸组成；序列4由23个核苷酸组成。
[0007] 所述引物对组中的所述引物对1和所述引物对2在PCR反应体系中的摩尔比为1:1；所述引物对1和所述引物对2中各引物对的两条引物均等摩尔。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒的试剂。
[0009] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒的试剂，由所述引物对组和RT-PCR扩增缓冲液组成。
[0010] 所述RT-PCR扩增缓冲液中含有dNTPs、Mg2+、反转录随机引物（如大连宝生物工程有限公司产品，产品目录号：D3802）、反转录酶（如AMV反转录酶）、RNA酶抑制剂（如大连宝生物工程有限公司产品，产品目录号：D2313A）和DNA聚合酶（如Ex Taq HS）。
[0011] 所述RT-PCR扩增缓冲液，具体由反转录缓冲液和PCR缓冲液组成。
[0012] 其中，所述反转录缓冲液中含有所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录随机引物、所述2+
反转录酶和所述RNA酶抑制剂；所述dNTPs、所述Mg 、所述反转录随机引物、所述反转录酶和所述RNA酶抑制剂的配比为20nmol：100nmol：25μmol：2.5U：20U。更加具体的，所述反转录缓冲液由10mM dNTPs Mix（四种碱基，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：
2+
D4030RA），5×RT buffer（含25mM Mg ，AMV反转录酶中包含有该buffer，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2620），反转录随机引物（50μmol/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D3802），AMV反转录酶（5U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：
D2620），RNA酶抑制剂（40U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2313A），按照体积比为2：4：0.5：0.5：0.5的比例混合后所得溶液。当然，使用其他公司的类似产品也可以。
反转录酶和所述RNA酶抑制剂；所述dNTPs、所述Mg 、所述反转录随机引物、所述反转录酶和所述RNA酶抑制剂的配比为20nmol：100nmol：25μmol：2.5U：20U。更加具体的，所述反转录缓冲液由10mM dNTPs Mix（四种碱基，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：
2+
D4030RA），5×RT buffer（含25mM Mg ，AMV反转录酶中包含有该buffer，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2620），反转录随机引物（50μmol/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D3802），AMV反转录酶（5U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：
D2620），RNA酶抑制剂（40U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2313A），按照体积比为2：4：0.5：0.5：0.5的比例混合后所得溶液。当然，使用其他公司的类似产品也可以。
[0013] 所述PCR缓冲液中含有所述dNTPs、所述Mg2+和所述DNA聚合酶；所述dNTPs、所2+
述Mg 和所述DNA聚合酶的配比为10nmol：25nmol：5U。更加具体的，所述的PCR缓冲液，
2+
为Premix Ex Taq Hot Start Version（2×）（内含10mM dNTP Mixture，25mMMg ，5U/μL Takara Ex Taq HS，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：R028A）。当然，使用其他公司的类似产品也可以。
述Mg 和所述DNA聚合酶的配比为10nmol：25nmol：5U。更加具体的，所述的PCR缓冲液，
2+
为Premix Ex Taq Hot Start Version（2×）（内含10mM dNTP Mixture，25mMMg ，5U/μL Takara Ex Taq HS，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：R028A）。当然，使用其他公司的类似产品也可以。
[0014] 本发明的第三个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒的试剂盒。
[0015] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒的试剂盒，具体可含有下述a）和b）：
[0016] a）作为阳性对照的H9亚型禽流感病毒cDNA和禽肺炎病毒cDNA；
[0017] b）所述引物对组，或所述试剂。
[0018] 所述试剂盒中还可以包括作为阴性对照的无RNA酶的水。
[0019] 本发明的第四个目的是提供所述引物对组的制备方法。
[0020] 本发明所提供的所述制备方法，包括将所述引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
[0021] 本发明的第五个目的是提供如下c）或d）的应用：
[0022] c）所述引物对组在制备所述试剂，或所述试剂盒中的应用；
[0023] d）所述引物对组、或所述试剂，或所述试剂盒，在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有H9亚型禽流感病毒和/或禽肺炎病毒的产品中的应用。
[0024] 在d）所述应用中，所述检测或辅助检测待测样品中是否含有H9亚型禽流感病毒和/或禽肺炎病毒为：用所述引物对组，或所述试剂，或所述试剂盒对所述待测样品进行RT-PCR反应，根据PCR产物的大小确定所述待测样品中是否含有H9亚型禽流感病毒和/或禽肺炎病毒。
[0025] 所述进行RT-PCR反应的退火温度可为50℃-60℃，最佳退火温度为55℃。
[0026] 进一步，进行所述RT-PCR反应的程序具体可为：首先进行反转录：42℃60min；95℃5min，4℃结束反应；然后进行PCR扩增：95℃变性5min；95℃1min，55℃1min，
72℃1min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min，于8℃结束反应。
72℃1min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min，于8℃结束反应。
[0027] 在d）所述应用中，所述检测或辅助检测待测样品中是否含有H9亚型禽流感病毒和/或禽肺炎病毒时，所述引物对组中的四条引物在反应体系中的终浓度均可为
0.5μmol/μL。
0.5μmol/μL。
[0028] 在本发明中，进行所述的RT-PCR反应的体系，具体为如下反转录体系和PCR扩增体系：
[0029] 反转录体系（20μL）：AMV反转录酶（5U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2620）0.5μL；RNA酶抑制剂（40U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2313A）0.5μL；随机引物（50μM/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D3802）
0.5μL；10mM dNTPs Mix（四种碱基，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D4030RA）
2+
2μL；5×RT buffer（含25mM Mg ，AMV反转录酶中包含有该buffer，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2620）4μL；模板（RNA）2μL（约20μg）；DEPC水补足20μL。
0.5μL；10mM dNTPs Mix（四种碱基，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D4030RA）
2+
2μL；5×RT buffer（含25mM Mg ，AMV反转录酶中包含有该buffer，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2620）4μL；模板（RNA）2μL（约20μg）；DEPC水补足20μL。
[0030] PCR扩增体系（25μL）：Premix Ex Taq Hot Start Version（2×）（内含10mM2+
dNTP Mixture，25mM Mg ，5U/μL Takara Ex Taq HS，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：R028A）12.5μL；模板（反转录所得的cDNA或DNA）2μL（约20μg）；所述引物对组中的四条引物在反应体系中的终浓度均为0.5μmol/μL；超纯水补足25μL。
dNTP Mixture，25mM Mg ，5U/μL Takara Ex Taq HS，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：R028A）12.5μL；模板（反转录所得的cDNA或DNA）2μL（约20μg）；所述引物对组中的四条引物在反应体系中的终浓度均为0.5μmol/μL；超纯水补足25μL。
[0031] 在d）所述应用中，所述根据PCR产物的大小确定所述待测样品中是否含有H9亚型禽流感病毒和/或禽肺炎病毒，具体如下：若所述PCR产物中含有大小为569bp（序列表中序列5的第518-1086位）的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有H9亚型禽流感病毒，反之则所述待测样品中不含有或候选不含有H9亚型禽流感病毒；若所述PCR产物中含有大小为424bp（序列表中序列6的第753-1176位）的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有禽肺炎病毒，反之则所述待测样品中不含有或候选不含有禽肺炎病毒。
[0032] 在d）所述应用中，所述待测样品可来自健康的动物或死亡的动物，可为RNA和/或DNA。
[0033] 本发明的第六个目的是提供用于鉴定或辅助鉴定禽肺炎病毒的引物对2。
[0034] 所述用于鉴定或辅助鉴定禽肺炎病毒的引物对2，由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成。
[0035] 所述引物对2中的两条引物等摩尔。
[0036] 本发明的第七个目的是提供如下应用：所述引物对2在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中是否含有禽肺炎病毒的产品中的应用。
[0037] 在所述应用中，所述待测样品可来自健康的动物或死亡的动物，可为RNA和/或DNA。
[0038] 在本发明中，以上所有的所述H9亚型禽流感病毒均具体可为H9N2亚型禽流感病毒；所述H9N2亚型禽流感病毒具体可为A/Chicken/Guangxi/LF/2007(H9N2)、A/
Duck/Guangxi/RX/2009(H9N2)、A/Chicken/Guangxi/067C4/2010(H9N2) 或 A/Chicken/Guangxi/066C10/2010(H9N2)。以上所有的所述禽肺炎病毒均具体可为禽肺炎病毒APV/MN株。
Duck/Guangxi/RX/2009(H9N2)、A/Chicken/Guangxi/067C4/2010(H9N2) 或 A/Chicken/Guangxi/066C10/2010(H9N2)。以上所有的所述禽肺炎病毒均具体可为禽肺炎病毒APV/MN株。
[0039] 本发明具有如下优点：
[0040] 针对目前缺乏同时对H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒进行区分鉴别检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究设计了两对特异性引物，据此建立了H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒的的二重RT-PCR检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，应用本发明所提供的试剂盒仅需一次PCR反应就能同时检测和鉴别H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒两种病原体，具有特异性强、灵敏度高、低成本、高效率等优点；而且本发明在引物设计上利用扩增片段长度的不同可直接判定扩增结果，更简便、直观和实用。本发明的待测样品可来自健康动物或死亡动物，可为RNA和/或DNA，最低能同时检出10pgH9亚型禽流感病毒的RNA、10pg禽肺炎病毒RNA，这为由这两种病毒引起鸡的疾病（尤其是发病早期）提供了准确的诊断结果，对切断其传播途径有重要意义，具有广阔的应用前景，对养鸡业可持续发展有着重要的现实意义。
附图说明
[0041] 图1为二重RT-PCR的灵敏度试验结果电泳图。图中：M为分子量标准100bp DNA ladder；1为100ng AIV H9和100ng APV RNA；2为10ng AIV H9和10ng APV RNA；3为1ng AIV H9和1ng APV RNA；4为100pg AIV H9和100pg APV RNA；5为10pg AIV H9和10pgAPV RNA；6为1pg AIV H9和1pg APV RNA；7为100fg AIV H9和100fg APV RNA。
[0042] 图2为二重RT-PCR的特异性试验结果电泳图。图中：M为分子量标准100bpDNA ladder；1为 APV RNA；2为 AIV H9N2（A/Chicken/Guangxi/LF/2007）RNA；3为 AIV H9N2（A/Chicken/Guangxi/LF/2007）RNA和APV RNA的混合模板（模板摩尔比1；1）；4为AIV H9N2（A/Duck/Guangxi/RX/2009）RNA和APV RNA的混合模板；5为AIV H9N2（A/
Chicken/Guangxi/067C4/2010）RNA和APV RNA的混合模板；6为AIV H9N2（A/Chicken/Guangxi/066C10/2010）RNA和APV RNA的混合模板；7为鸡新城疫病毒（Lasota）RNA；8为鸡传染性支气管炎病毒（Mass41）RNA；9为禽脑脊髓炎病毒（AE Van）RNA；10为禽呼肠孤病毒（Reo S1133）RNA；11为鸡传染性喉气管炎病毒（北京株）DNA；12为鸡马立克氏病（MDV）疫苗毒DNA；13为鸡毒霉形体（MG）DNA；14为禽大肠杆菌（E.coli O2）DNA。
Chicken/Guangxi/067C4/2010）RNA和APV RNA的混合模板；6为AIV H9N2（A/Chicken/Guangxi/066C10/2010）RNA和APV RNA的混合模板；7为鸡新城疫病毒（Lasota）RNA；8为鸡传染性支气管炎病毒（Mass41）RNA；9为禽脑脊髓炎病毒（AE Van）RNA；10为禽呼肠孤病毒（Reo S1133）RNA；11为鸡传染性喉气管炎病毒（北京株）DNA；12为鸡马立克氏病（MDV）疫苗毒DNA；13为鸡毒霉形体（MG）DNA；14为禽大肠杆菌（E.coli O2）DNA。
[0043] 图3为二重RT-PCR对临床样品检测结果电泳图。图中：M为分子量标准100bpDNA ladder；1为APV RNA；2为AIV H9N2（A/Chicken/Guangxi/LF/2007）RNA；3为APV RNA和AIVH9N2（A/Chicken/Guangxi/LF/2007）RNA的混合模板（模板摩尔比1:1）；4为阴性对照（正常鸡肺、气管组织RNA）；5为临床样品C20120427RNA；6为临床样品C20120314RNA；7为临床样品C20130201RNA；8为临床样品C20130417RNA；9为临床样品C20130618RNA；10为临床样品C20130707RNA；11为临床样品C20130821RNA；12为临床样品C20130911RNA；13为临床样品C20130928RNA；14为临床样品C20131012RNA；15为临床样品C20131016RNA；16为临床样品C20131018RNA。
具体实施方式
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] 下述实施例中所用一些材料和试剂如下：
[0047] PCR仪为Bio-rad公司产品；DNA片断胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司；RT-PCR试剂、pMD18-T试剂盒购自大连宝生物工程（TaKaRa）公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。
[0048] 禽肺炎病毒APV/MN株：记载于“谢志勤等，环介导等温可视扩增（LAMP）检测禽肺炎病毒方法的建立.中国动物检疫，2013，30（3）：48-51”一文，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0049] 鸡新城疫病毒（Lasota）：记载于“谢芝勋等，新城疫植物油乳剂苗的研究.中国预防兽医学报，2000，(04)：23-27”一文，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0050] H9亚型禽流感病毒的四种分离株，即A/Chicken/Guangxi/LF/2007(H9N2)、
[0051] A/Duck/Guangxi/RX/2009(H9N2)、A/Chicken/Guangxi/067C4/2010(H9N2)、
[0052] A/Chicken/Guangxi/066C10/2010(H9N2)：均 记 载 在“Peng Yi(彭 宜 ) 等，Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay,Virology Journal，2011Jul5;8:337”一文，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0053] 禽脑脊髓炎病毒（AE Van）、鸡传染性支气管炎病毒（Mass41）、鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV，北京株）、禽呼肠孤病毒（Reo S1133）、禽大肠杆菌（E.coli O2）、鸡毒霉形体（MG）：记载于“Zhiqin Xie（谢志勤）等，Reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect avian Encephalomyelitis virus.Avian Disease(美国禽病杂志)，2005,49:227-230”、“谢志勤等，应用二温式多重PCR技术鉴别鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒.广西科学，2001,8（2）：152-153”和“何士军，黄烨，唐顺发.鸡毒霉形体病(MG)免疫防治对策.2005年23期”中，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0054] 鸡马立克氏病（MDV）疫苗毒：购自南京梅里亚动物保健品公司。
[0055] 实施例1、引物的设计与合成
[0056] 根据GenBank中H9亚型禽流感病毒HA基因（GenBank：JF715045.1，序列表中序列5）和禽肺炎病毒F基因（GenBank：AF187154，序列表中序列6）的保守序列，应用DNAStar引物设计软件进行引物设计，设计的引物在GenBank中通过Blast比对进行验证，最后确定并合成了2对分别扩增AIV H9和APV的特异性引物（表1）。
[0057] 表1鉴定AIV H9和APV的引物寡核苷酸序列
[0058]
[0059] 实施例2、二重RT-PCR鉴定H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒
[0060] 一、二重RT-PCR体系的建立
[0061] 1、待测样本的制备
[0062] 参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取禽肺炎病毒APV/MN株、A/Chicken/Guangxi/LF/2007(H9N2)、A/Duck/Guangxi/RX/2009(H9N2)、A/Chicken/Guangxi/067C4/2010(H9N2)、A/Chicken/Guangxi/066C10/2010(H9N2)、鸡新城疫病毒（Lasota）、鸡传染性支气管炎病毒（Mass41）、禽脑脊髓炎病毒（AE Van）、禽呼肠孤病毒（Reo S1133）的RNA；提取鸡传染性喉气管炎病毒（北京株）、鸡马立克氏病（MDV）疫苗毒、鸡毒霉形体（MG）和禽大肠杆菌（E.coli O2）的DNA。参照Sambrook方法测定核酸的浓度和纯度，保存于-70℃备用。
[0063] 2、二重RT-PCR反应条件的优化及RT-PCR体系的建立
[0064] 第一步：RNA的反转录
[0065] 将步骤1所得禽肺炎病毒APV/MN RNA、A/Chicken/Guangxi/LF/2007(H9N2)RNA及其它病毒RNA反转录合成cDNA，具体如下：针对每种病毒均建立如下反转录体系，总反应体积为20μL，禽肺炎病毒APV/MN RNA、A/Chicken/Guangxi/LF/2007(H9N2)RNA或其它病毒RNA2μL（约20μg，模板），AMV反转录酶（5U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2620）0.5μL，RNA酶抑制剂（40U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2313A）
0.5μL，随机引物（50μmol/μL，大连宝生物工程有限公司Takara产品，产品目录号：
D3802）0.5μL，10mM dNTPs Mix（大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D4030RA）2μL，
2+
5×RT buffer（含25mM Mg ，AMV反转录酶中有该buffer，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2620）4μL，DEPC水补足20μL，瞬时离心，置PCR仪于42℃60min，95℃5min，4℃结束，得到各病毒的cDNA。
0.5μL，随机引物（50μmol/μL，大连宝生物工程有限公司Takara产品，产品目录号：
D3802）0.5μL，10mM dNTPs Mix（大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D4030RA）2μL，
2+
5×RT buffer（含25mM Mg ，AMV反转录酶中有该buffer，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2620）4μL，DEPC水补足20μL，瞬时离心，置PCR仪于42℃60min，95℃5min，4℃结束，得到各病毒的cDNA。
[0066] 第二步：PCR扩增
[0067] 反 应 体 系（25μL）：Premix Ex Taq Hot Start Version（2×）（内 含 10mM2+
dNTPMixture，25mM Mg ，5U/μL Takara Ex Taq HS，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：R028A）12.5μL；模板（第一步反转录所得的cDNA或步骤1得到的病毒DNA）2μL（约
20μg）；AIVH9上游引物和下游引物（表1中的AIVH9569-1和AIVH9569-2）、APV上游引物和下游引物（表1中的APV424-1和APV424-2）在反应体系中的终浓度均为0.5μmol/μL；灭菌超纯水补足25μL。瞬时离心，置PCR仪于95℃变性5min；然后进入95℃1min，55℃1min，
72℃1min，共进行35个循环；最后经72℃延伸10min，于8℃结束反应。
dNTPMixture，25mM Mg ，5U/μL Takara Ex Taq HS，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：R028A）12.5μL；模板（第一步反转录所得的cDNA或步骤1得到的病毒DNA）2μL（约
20μg）；AIVH9上游引物和下游引物（表1中的AIVH9569-1和AIVH9569-2）、APV上游引物和下游引物（表1中的APV424-1和APV424-2）在反应体系中的终浓度均为0.5μmol/μL；灭菌超纯水补足25μL。瞬时离心，置PCR仪于95℃变性5min；然后进入95℃1min，55℃1min，
72℃1min，共进行35个循环；最后经72℃延伸10min，于8℃结束反应。
[0068] 3、结果检测
[0069] 反应结束后，取20μl RT-PCR产物（PCR扩增试剂中混合有加样溴酚兰，如没有，则加2μl加样溴酚兰混合），在15g/L琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后，在紫外光下观察拍照，与DNA标准分子量作比较，分析并记录结果。
[0070] 结果判定方法：若所述PCR产物中含有大小为569bp（序列表中序列5的第518-1086位）的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有H9亚型禽流感病毒，反之则所述待测样品中不含有或候选不含有H9亚型禽流感病毒；若所述PCR产物中含有大小为
424bp（序列表中序列6的第753-1176位）的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有禽肺炎病毒，反之则所述待测样品中不含有或候选不含有禽肺炎病毒。
424bp（序列表中序列6的第753-1176位）的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有禽肺炎病毒，反之则所述待测样品中不含有或候选不含有禽肺炎病毒。
[0071] 二、二重RT-PCR的灵敏度试验
[0072] 参试的毒株模板为A/Chicken/Guangxi/LF/2007(H9N2)RNA和禽肺炎病毒APV/MN株RNA（见步骤一1）。测定OD260/OD280的值，然后根据OD260的值计算RNA的浓度，根据浓度用DEPC水调整使其终浓度一致，然后进行10倍比梯度稀释，按照步骤一2中优化后建立的RT-PCR反应条件进行扩增，检测其敏感性。
[0073] 按照步骤一3进行结果检测，分析并记录结果。在紫外灯下用刀片切割所需的片段，然后用DNA片断胶回收试剂盒纯化回收。分别取适量纯化回收的PCR产物，与pMD18-T质粒（来自pMD18-T试剂盒）于16℃连接4小时，转化DH5α大肠埃希氏菌。挑取在含氨苄青霉素的选择培养基上长出的白色菌落于LB培养基中37℃培养，分别提取质粒DNA，用PCR方法进行快速鉴定，阳性克隆菌送大连宝生生物技术有限公司进行测序，测序结果与GenBank中序列进行Blast比对分析。
[0074] 实验重复三次。
[0075] 琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，该二重RT-PCR最低能检出10pgA/Chicken/Guangxi/LF/2007(H9N2)RNA和10pg禽肺炎病毒RNA。最低检测线以上各浓度的模板中H9亚型禽流感病毒均扩增出大小约为569bp的条带，禽肺炎病毒均扩增出大小约为424bp的条带，且测序结果进一步证实了H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒RT-PCR扩增产物，大小分别为569bp和424bp，与实验设计大小相符，且PCR产物的核酸序列与引物设计模板的基因对应片段的同源性一致，即大小为569bp的DNA片段的核苷酸序列正为序列表中序列5的第518-1086位，大小为424bp的DNA片段的核苷酸序列正为序列表中序列6的第753-1176位。以上结果表明利用该二重RT-PCR同时检测H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒具有较高的灵敏度。
[0076] 三、二重RT-PCR的特异性试验
[0077] 1、待测样品的制备
[0078] 参试的毒株模板为：A/Chicken/Guangxi/LF/2007(H9N2)RNA、A/Duck/Guangxi/RX/2009(H9N2)RNA、A/Chicken/Guangxi/067C4/2010(H9N2)RNA、A/Chicken/Guangxi/066C10/2010(H9N2)RNA、禽肺炎病毒APV/MN株RNA、鸡新城疫病毒（Lasota）RNA、鸡传染性支气管炎病毒（Mass41）RNA、禽脑脊髓炎病毒（AEVan）RNA、禽呼肠孤病毒（Reo S1133）RNA，以及鸡传染性喉气管炎病毒（北京株）DNA、鸡马立克氏病（MDV）疫苗毒DNA、鸡毒霉形体（MG）DNA和禽大肠杆菌（E.coli O2）DNA（见步骤一1）。参照Sambrook方法测定核酸的浓度和纯度，保存于-70℃备用。
[0079] 2、二重RT-PCR扩增
[0080] 按照步骤一2中优化后的PCR反应条件进行扩增，实验设计14个不同处理，模板分别如下：A/Chicken/Guangxi/LF/2007(H9N2)RNA；禽肺炎病毒APV/MN株RNA；A/Chicken/Guangxi/LF/2007(H9N2)RNA和禽肺炎病毒APV/MN株RNA的混合模板（模板摩尔比
1：1）；A/Duck/Guangxi/RX/2009(H9N2)RNA和禽肺炎病毒APV/MN株RNA的混合模板（模板摩尔比1：1）；A/Chicken/Guangxi/067C4/2010(H9N2)RNA和禽肺炎病毒APV/MN株RNA的混合模板（模板摩尔比1：1）；A/Chicken/Guangxi/066C10/2010(H9N2)RNA和禽肺炎病毒APV/MN株RNA的混合模板（模板摩尔比1：1）；鸡新城疫病毒（Lasota）RNA；鸡传染性支气管炎病毒（Mass41）RNA；禽脑脊髓炎病毒（AE Van）RNA；禽呼肠孤病毒（Reo S1133）RNA；鸡传染性喉气管炎病毒（北京株）DNA；鸡马立克氏病（MDV）疫苗毒DNA；鸡毒霉形体（MG）DNA；禽大肠杆菌（E.coli O2）DNA。
1：1）；A/Duck/Guangxi/RX/2009(H9N2)RNA和禽肺炎病毒APV/MN株RNA的混合模板（模板摩尔比1：1）；A/Chicken/Guangxi/067C4/2010(H9N2)RNA和禽肺炎病毒APV/MN株RNA的混合模板（模板摩尔比1：1）；A/Chicken/Guangxi/066C10/2010(H9N2)RNA和禽肺炎病毒APV/MN株RNA的混合模板（模板摩尔比1：1）；鸡新城疫病毒（Lasota）RNA；鸡传染性支气管炎病毒（Mass41）RNA；禽脑脊髓炎病毒（AE Van）RNA；禽呼肠孤病毒（Reo S1133）RNA；鸡传染性喉气管炎病毒（北京株）DNA；鸡马立克氏病（MDV）疫苗毒DNA；鸡毒霉形体（MG）DNA；禽大肠杆菌（E.coli O2）DNA。
[0081] 按照步骤一3进行结果检测，分析并记录结果。在紫外灯下用刀片切割所需的片段，然后用DNA片断胶回收试剂盒纯化回收。分别取适量纯化回收的PCR产物，与pMD18-T质粒（来自pMD18-T试剂盒）于16℃连接4小时，转化DH5α大肠埃希氏菌。分别挑取在含氨苄青霉素的选择培养基上长出的单个白色菌落37℃培养，用PCR方法进行快速鉴定，阳性克隆菌送大连宝生生物技术有限公司进行测序，测序结果进行Blast比对分析。
[0082] 实验重复三次。
[0083] 琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，所有含有H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒模板的样品均能扩增出与试验设计大小相符的扩增条带，即H9亚型禽流感病毒扩增得到大小约为569bp的目的条带，禽肺炎病毒扩增得到大小约为424bp的目的条带；而其它对照病原体在相同位置却无任何扩增条带。测序结果进一步证实了H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒RT-PCR扩增产物，大小分别为569bp和424bp，与实验设计大小相符，且PCR产物的核酸序列与引物设计模板的基因对应片段的同源性一致，即大小为569bp的DNA片段的核苷酸序列正为序列表中序列5的第518-1086位，大小为424bp的DNA片段的核苷酸序列正为序列表中序列6的第753-1176位。这一结果表明利用该二重RT-PCR检测H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒具有较强的特异性。
[0084] 实施例3、二重RT-PCR鉴定H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒试剂盒对临床样品准确率检测
[0085] 一、临床组织样品中RNA的提取
[0086] 分别取保存在-70℃临床患病鸡（25-60日龄的三黄鸡，出现头部皮下水肿，喷嚏，眼结膜潮红，有呼呼道症状，出现神经症状）肺和气管组织5g，编号分别为C20120427、C20120314、C20130201、C20130417、C20130618、C20130707、C20130821、C20130911、C20130928、C20131012、C20131016、C20131018，放入研磨钵进行研磨，磨碎后加入灭菌的PBS溶液10mL混匀，反复冻融3次，10000转离心5分钟，收集上清液，存-70℃备用或按实例2步骤一1方法提取样品RNA，同时按实例2步骤一1方法提取禽肺炎病毒APV/MN和A/Chicken/Guangxi/LF/2007(H9N2)的RNA。
[0087] 二、H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR检测试剂盒对临床样品的检测[0088] 分 别以 提 取 的 临 床 样品 C20120427、C20120314、C20130201、C20130417、C20130618、C20130707、C20130821、C20130911、C20130928、C20131012、C20131016、C20131018RNA为模板，按照实施例2步骤一2中优化后的PCR反应条件和程序进行扩增，同时以禽肺炎病毒APV/MN RNA和A/Chicken/Guangxi/LF/2007(H9N2)的RNA为阳性对照，以正常鸡（健康未患病的三黄鸡）肺、气管组织的RNA为阴性对照。
[0089] 按照步骤一3进行结果检测，实验重复三次，分析并记录结果。
[0090] 琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，临床样品C20120314RNA、C20130821RNA扩增出424bp的条带，为禽肺炎病毒阳性；临床样品C20130417RNA、C20130618RNA、C20130928RNA、C20130821RNA扩增出569bp的条带，为AIV H9阳性；临床样品C20130821RNA为禽肺炎病毒和AIV H9混合感染；其它样品检测结果与阴性对照一样为阴性。
[0091] 进一步，PCR产物经过测序，AIV H9阳性样品符合序列表中序列5的第518-1086位，禽肺炎病毒阳性样品符合序列表中序列6的第753-1176位。
[0092] 上述结果表明，本发明所提供的H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR检测试剂盒可准确检出H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒。