基于核酸嵌合染料荧光淬灭的赭曲霉毒素A均相快速检测方法

摘要

本发明公开了一种基于核酸嵌合染料荧光淬灭的赭曲霉毒素A均相快速检测方法，包括以下步骤：（1）赭曲霉毒素A核酸适配体与核酸嵌合染料荧光复合物的形成；（2）赭曲霉毒素A核酸适配体对赭曲霉毒素A的特异性识别。本发明采用赭曲霉毒素A核酸适配体作为分子识别元件，核酸嵌合染料作为报告分子构建的OTA检测方法，大大降低了检测OTA真菌毒素的成本，重现性好，特异性高，操作简单方便且可实现大量样品的平行检测；本发明基于核酸嵌合染料荧光淬灭的赭曲霉毒素A均相快速检测方法，在赭曲霉毒素A核酸适配体与核酸嵌合染料荧光复合物预先形成后，仅需5-10min即可实现对OTA的检测。

权利要求

1.一种基于核酸嵌合染料荧光淬灭的赭曲霉毒素A均相快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）赭曲霉毒素A核酸适配体与核酸嵌合染料荧光复合物的形成；

（2）赭曲霉毒素A核酸适配体对赭曲霉毒素A的特异性识别，

所述方法的具体操作步骤如下：

（1）赭曲霉毒素A核酸适配体与核酸嵌合染料荧光复合物的形成

首先将赭曲霉毒素A核酸适配体进行预处理：95℃变性5min，4℃冷却5min，然后取50μL10mMTris-HCl反应缓冲溶液，pH8.5，其中赭曲霉毒素A核酸适配体的浓度为50nM，GeneFinder核酸嵌合染料的稀释比为8:10000，室温反应30min，以使核酸嵌合染料与赭曲霉毒素A核酸适配体充分结合，形成赭曲霉毒素A核酸适配体与核酸嵌合染料荧光复合物；

（2）赭曲霉毒素A核酸适配体对赭曲霉毒素A的特异性识别

往上述步骤（1）反应后的溶液中加入适量的赭曲霉毒素A溶液，用10mMTris-HCl反应缓冲液，pH8.5，调整溶液体积为100μL，其中其中赭曲霉毒素A核酸适配体的浓度为25nM，GeneFinder核酸嵌合染料的稀释比为4:10000，室温反应5-10min，以使赭曲霉毒素A核酸适配体与赭曲霉毒素A充分结合，形成赭曲霉毒素A核酸适配体与赭曲霉毒素A复合物，从而导致赭曲霉毒素A核酸适配体与核酸嵌合染料荧光复合物的解离，产生荧光强度的变化，将反应后的溶液放入荧光光谱仪，以490nm为激发波长、525nm为发射波长，测定其荧光信号强度并记录荧光强度的变化：空白对照的荧光强度I0最大，随着OTA浓度的增加荧光强度（I）逐渐减弱；

按上述（1）、（2）步骤对配制的不同浓度赭曲霉毒素A标准液进行检测，记录各标准溶液样品所产生的荧光强度的变化值（ΔI=I0-I）；用ΔI对标准溶液中赭曲霉毒素A浓度作图获得标准曲线，未知样品中赭曲霉毒素A所产生的荧光强度的变化值与标注曲线对照确定其浓度。

2.根据权利要求1所述的基于核酸嵌合染料荧光淬灭的赭曲霉毒素A均相快速检测方法，其特征在于：赭曲霉毒素A核酸适配体为单链DNA探针，序列为

5’-CTTCGGGTGTGGGTGGCATTCCGGTAGGCTCTG-3’。

说明书

基于核酸嵌合染料荧光淬灭的赭曲霉毒素A均相快速检测

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及利用核酸嵌合染料的荧光淬灭对赭曲霉毒素A进行检测，特点在于赭曲霉毒素A核酸适配体和核酸嵌合染料的应用，以及该方法的检测速度快、检测通量高及操作性强，属于属于荧光检测技术领域。

背景技术

[0002] 赭曲霉毒素A（OchratoxinA，OTA）主要由曲霉和靑霉等产生，在自然界中广泛存在，其中以粮食（小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等）、花生、蔬菜（豆类）等农作物上居多，具有肝肾毒性以及很强的致畸、致癌和致突变作用等多中毒性，对动物和人体健康具有很大的潜在危害。鉴于此，世界各国均重视对OTA的检测和控制，纷纷制定出了粮食和饲料中OTA相关限量标准，如欧盟规定谷物原料OTA最大限量5μg/kg，谷物加工制品最大限量3μg/kg；我国规定谷类、豆类中OTA最大限量5μg/kg，以保护人民健康和调控进出口粮食。

[0003] 目前检测OTA的主要方法是薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）等。TLC法简单，检测成本低，但是灵敏度较差、重现性不好且无法实现自动化；HPLC法灵敏度高，但所需仪器昂贵、前处理复杂、检测成本高，不适合大量样品的快速筛查。ELISA法灵敏度高、特异性好，但所依赖的高质量抗体的制备周期很长且存在交叉反应的问题。

[0004] 核酸适配体作为一类单链寡核苷酸，与靶分子发生特异性相互作用前后空间构象会发生相应的变化，与抗体相比具有可体外筛选获得、热稳定性好、易于化学合成和修饰等优点，甚至能区分单抗无法实现的单个取代基差别的靶分子；核酸嵌合染料具有如下特点：游离状态下无荧光或者具有很弱的荧光，嵌合到DNA双链中发生荧光增强，因此基于核酸嵌合染料染料的均相荧光检测方法具有灵敏度高、操作简单且可进行大量样品的平行检测等特点。所以，将核酸适配体的高特异性、高亲和力与核酸嵌合染料相结合的均相荧光检测方法，能够很好地克服目前OTA主要检测方法的缺点，有望成为一种有潜力的快速筛查方法。

发明内容

[0005] 为了解决目前OTA检测方法的方案复杂、操作反锁、成本过高、检测时间过长的缺点，本发明提供了一种基于核酸嵌合染料荧光淬灭的赭曲霉毒素A均相快速检测方法。

[0006] 本发明的技术方案是，基于核酸嵌合染料荧光淬灭的赭曲霉毒素A均相快速检测方法，包括以下步骤：

[0007] （1）赭曲霉毒素A核酸适配体与核酸嵌合染料荧光复合物的形成；

[0008] （2）赭曲霉毒素A核酸适配体对赭曲霉毒素A的特异性识别。

[0009] 本发明基于核酸嵌合染料荧光淬灭实现的赭曲霉毒素A均相快速检测方法的具体操作步骤如下：

[0010] 赭曲霉毒素A核酸适配体与核酸嵌合染料荧光复合物的形成

[0011] 首先将赭曲霉毒素A核酸适配体进行预处理：95℃变性5min，4℃冷却5min。然后取50μL10mM Tris-HCl反应缓冲液（pH8.5)，其中赭曲霉毒素A核酸适配体的浓度为50nM，GeneFinder核酸嵌合染料的稀释比为8:10000，室温反应30min，以使核酸嵌合染料与赭曲霉毒素A核酸适配体充分结合，形成赭曲霉毒素A核酸适配体与核酸嵌合染料荧光复合物；
赭 曲 霉 毒 素 A 核 酸 适 配 体 为 单 链 D N A 探 针 ，序 列 为 5 ’-CTTCGGGTGTGGGTGGCATTCCGGTAGGCTCTG-3’。

[0012] 赭曲霉毒素A核酸适配体对赭曲霉毒素A的特异性识别

[0013] 往上述步骤（1）反应后的溶液中加入适量的赭曲霉毒素A溶液，用10mM Tris-HCl反应缓冲液（pH8.5)调整溶液体积为100μL，其中赭曲霉毒素A核酸适配体的浓度为25nM，GeneFinder核酸嵌合染料的稀释比为4:10000，室温反应5-10min，以使赭曲霉毒素A核酸适配体与赭曲霉毒素A充分结合，形成赭曲霉毒素A核酸适配体与赭曲霉毒素A复合物，从而导致赭曲霉毒素A核酸适配体与核酸嵌合染料荧光复合物的解离，产生荧光强度的变化。将反应后的溶液转移至微量荧光比色杯中放入荧光光谱仪，或者将反应后的溶液转移微孔板中放入具有微孔板阅读模块的荧光光谱仪中，以490nm为激发波长、525nm为发射波长，测定其荧光信号强度并记录荧光强度的变化：空白对照的荧光强度（I0）最大，随着OTA浓度的增加荧光强度（I）逐渐减弱。

[0014] 按上述（1）、（2）步骤对配制的不同浓度赭曲霉毒素A标准液进行检测，记录各标准溶液样品所产生的荧光强度的变化值（ΔI=I0-I）。用ΔI对标准溶液中赭曲霉毒素A浓度作图获得标准曲线，未知样品中赭曲霉毒素A所产生的荧光强度的变化值与标注曲线对照确定其浓度。

[0015] 综上所述本发明的有益效果具体体现在以下方面：

[0016] 1）本发明采用赭曲霉毒素A核酸适配体作为分子识别元件，核酸嵌合染料作为报告分子构建的OTA检测方法，大大降低了检测OTA真菌毒素的成本，重现性好，特异性高，操作简单方便且可实现大量样品的平行检测；

[0017] 2）本发明基于核酸嵌合染料荧光淬灭的赭曲霉毒素A均相快速检测方法，在赭曲霉毒素A核酸适配体与核酸嵌合染料荧光复合物预先形成后，仅需5-10min即可实现对OTA的检测。

附图说明

[0018] 图1：基于核酸嵌合染料荧光淬灭的赭曲霉毒素A均相快速检测方法的现象图：其中（a）为GeneFinder+Aptamer+AFB1，（b）为GeneFinder+Aptamer，（c）为GeneFinder+Aptamer+OTA，（d）为GeneFinder，（e）为OTA aptamer。[OTA aptamer]=25nM,[OTA]=[AFB1]=50nM，Dilution ratio of GeneFinder=4:10000。AFB1为黄曲霉毒素B1。

[0019] 图2：对赭曲霉毒素A标准品溶液进行检测的工作曲线图。

具体实施方式

[0020] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

[0021] （1）赭曲霉毒素A核酸适配体与核酸嵌合染料荧光复合物的形成

[0022] 首先将赭曲霉毒素A核酸适配体进行预处理：95℃变性5min，4℃冷却5min。然后取50μL10mM Tris-HCl反应缓冲液（pH8.5)，其中赭曲霉毒素A核酸适配体的浓度为50nM，GeneFinder核酸嵌合染料的稀释比为8:10000，室温反应30min，以使核酸嵌合染料与赭曲霉毒素A核酸适配体充分结合，形成赭曲霉毒素A核酸适配体与核酸嵌合染料荧光复合物；
赭 曲 霉 毒 素 A 核 酸 适 配 体 为 单 链 D N A 探 针 ，序 列 为 5 ’-CTTCGGGTGTGGGTGGCATTCCGGTAGGCTCTG-3’。

[0023] 一种赭曲霉毒素A核酸适配体的筛选制备：将赭曲霉毒素A分子通过偶联剂EDC和NHS偶联于羧基修饰的磁珠上，与含有初始文库的反应缓冲溶液反应将初始文库固定到磁珠上。分别以羧基修饰的磁珠为反筛选靶标，以N-乙酰基-L-苯丙氨酸（N-acetyl-L-phenylalanine）、法华令（warfarin）和赭曲霉毒素B分子为负筛选靶标，以赭曲霉毒素A为正筛选分子进行筛选。在赭曲霉毒素A存在的情况下，与其有结合能力的寡核苷酸序列从磁珠上解离下来，经PCR扩增后，采用链亲和素磁珠分离法制备次级文库，重复筛选15轮，然后进行克隆测序，最后进行序列分析、活性检测以及序列截短与优化，从而获得赭曲霉毒素A的特异性核酸适配体。

[0024] （2）赭曲霉毒素A核酸适配体对赭曲霉毒素A的特异性识别

[0025] 往上述步骤（1）反应后的溶液中加入适量的赭曲霉毒素A溶液，用10mM Tris-HCl反应缓冲液（pH8.5)调整溶液体积为100μL，其中其中赭曲霉毒素A核酸适配体的浓度为25nM，GeneFinder核酸嵌合染料的稀释比为4:10000，室温反应5-10min，以使赭曲霉毒素A核酸适配体与赭曲霉毒素A充分结合，形成赭曲霉毒素A核酸适配体与赭曲霉毒素A复合物，从而导致赭曲霉毒素A核酸适配体与核酸嵌合染料荧光复合物的解离，产生荧光强度的变化。将反应后的溶液转移至微量荧光比色杯中放入荧光光谱仪，或者将反应后的溶液转移微孔板中放入具有微孔板阅读模块的荧光光谱仪中，以490nm为激发波长、525nm为发射波长，激发狭缝宽度设定为10nm，发射狭缝宽度设定为5nm，测定其荧光信号强度并记录荧光强度的变化：空白对照的荧光强度（I0）最大，随着OTA浓度的增加荧光强度（I）逐渐减弱。

[0026] 如图1所示，核酸嵌合染料（GeneFinder）自身荧光很弱，可以忽略不计；OTA核酸适配体（aptamer）自身没有荧光；二者共同存在的情况下，形成aptamer/GeneFinder荧光复合物，具有很强的荧光，荧光增强10多倍。在OTA存在的情况下，aptamer与OTA充分结合，形成aptamer/OTA复合物，从而导致aptamer/GeneFinder荧光复合物的解离，产生荧光淬灭，导致荧光强度降低；而在黄曲霉毒素B1（AFB1）存在的情况下，aptamer不识别AFB1，因此aptamer/GeneFinder荧光复合物不会解离，所以不能产生荧光淬灭，荧光强度不会降低。

[0027] 按上述（1）、（2）步骤对配制的不同浓度赭曲霉毒素A标准液（0nM，1nM，2.5nM，5.0nM，7.5nM，10nM，15nM，20nM，25nM，35nM，50nM，75nM）进行检测，并记录各标准溶液样品所产生的荧光强度的变化值（ΔI=I0-I）。用ΔI对标准溶液中赭曲霉毒素A浓度作图获得工作曲线（图2），未知样品中赭曲霉毒素A所产生的荧光强度的变化值与工作曲线对照确定其浓度。

[0028] 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

[0029] SEQUENCE LISTING

[0030] <110>申请人河南省农业科学院

[0031] <120>基于核酸嵌合染料荧光淬灭的赭曲霉毒素A均相快速检测方法

[0032] <130>

[0033] <160>1

[0034] <170>PatentIn version3.5

[0035] <210>1

[0036] <211>33

[0037] <212>DNA

[0038] <213>赭曲霉毒素A核酸适配体

[0039] <400>1

[0040] cttcgggtgt gggtggcatt ccggtaggct ctg

[0041] 33