一种Th17免疫相关因子与IgG4抗体组合物及其应用

摘要

本发明公开了Th17免疫相关因子及IgG4抗体组合物及其应用。本发明因子及抗体组合物，含有前炎症因子TNF家族、IL-1β等以及Th17免疫相关因子中一种或多种的组合，与血浆IgG4抗体，用于IgG4综合征类疾病的检测试剂盒的研制，临床诊断以及预测。联合应用的生物标志物是蛋白水平TNF家族因子，IL-1β，Th17免疫相关因子，并联合血清学IgG4抗体含量。试剂盒检测的实现为免疫学检测，比如酶联免疫吸附测定方法（ELISA）、Western Blot、基于微珠或孔板的多因子检测等。本发明提供的组合检测试剂盒，在IgG4综合征类疾病的检测、诊断及预测中具有广阔的应用前景。

权利要求

1.Th17免疫相关因子及IgG4抗体组合物，其特征在于包括前炎症因子、Th17免疫相关因子结合血清学IgG4抗体；所述前炎症因子是sCD40L或IL-1β。

2.根据权利要求1所述Th 17免疫相关因子及IgG4抗体组合物，其特征在于分别含有前炎症因子一种或多种、以及Th17免疫相关因子一种或多种。

3.根据权利要求1所述Th 17免疫相关因子及IgG4抗体组合物，其特征在于所述血清学IgG4抗体含量是血浆或血清中IgG4抗体浓度、IgG4浓度占总IgG浓度比例或组织学中免疫组化IgG4阳性浆细胞占总淋巴细胞比例的一种或多种的组合。

4.根据权利要求1所述Th 17免疫相关因子及IgG4抗体组合物，其特征在于：所述Th17免疫相关因子是IL-17A、IL-31或IL-4。

5.根据权利要求1-4任意一项所述Th 17免疫相关因子及IgG4抗体组合物的抗体在特发性眼眶炎性假瘤检测试剂中的应用。

6.一种含有权利要求1-4所述任意一项所述Th 17免疫相关因子及IgG4抗体组合物的试剂盒。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒是采用ELISA、放射免疫分析、自动化免疫分析、免疫沉淀、流式微珠测定或液态芯片技术平台制备或测定的。

说明书

一种Th17免疫相关因子与IgG4抗体组合物及其应用

技术领域：

[0001] 本发明属于分子医学领域。本发明涉及一种IgG4综合征类疾病检测的组合物，具体涉及一种Th17免疫相关因子联合IgG4抗体含量组合的的组合物及其应用。

背景技术

[0002] 自从自身免疫胰腺炎（AIP）的提出，已经有越来越多的AIP病例在西方国家和日本被报道出来。在AIP众多患者免疫组织化学和组织形态学检测的基础上，随着研究的不断深入，Kamisawa等于2003年首次引入IgG4系统性病概念，即IgG4相关性疾病（IgG4Related Disease，IgG4RD），又称为lgG4多器官淋巴细胞增生综合征，即IgG4综合征。IgG4RD是一种全身性多发疾病，以多器官内IgG4阳性浆细胞及T细胞浸润为特征表现。临床上已经发现IgG4综合征在胰腺、胆管、胆囊、唾液腺、腹膜后腔、肾、肺、前列腺中表现，其中组织纤维化与闭塞的静脉炎为主要的特征。目前为止IgG4相关性疾病尚没有统一的治疗标准，但在治疗过程中发现该类疾病普遍对糖皮质激素治疗反应敏感。但长期激素治疗的不良反应会增多，且停药后多有复发。临床研究中发现，有大量患者虽然血清IgG4抗体含量并未升高，但临床表现仍为全身或部分器官、脏器的纤维化、炎症浸润，我们将这类IgG4血清抗体含量升高或者抗体含量不升高，但临床表现为IgG4综合征的疾病称为IgG4综合征类疾病。这类疾病属于自身免疫性疾病，与某些机体免疫反应或免疫平衡的打乱有关。

[0003] Th17细胞被定义为一种CD4阳性的T细胞的亚型，并且与传统的Th1，Th2，Treg等不同。Th17免疫代表了前炎症反应，并且可以导致各种严重的自身免疫性疾病。前炎症因子如TNF-α，IL-6，IL-1β等都与Th17免疫的激活和形成有关。Th17免疫功能的实现主要与其相关的细胞因子的释放有关，比如IL-17，IL-21，IL-23等。最近，有研究表明Th17某些相关因子对IgG4抗体的升高有促进作用，所以，IgG4综合征很有可能是一种Th17导致的自身免疫疾病，但目前为止尚未有明确的定论。

[0004] 许多病例报道指出，特发性眼眶炎性假瘤（IOIP）病人血清中IgG4滴度有明显提高，这暗示了IOIP很有可能是一种IgG4相关眼部疾病表现。而有关IgG4相关疾病如何致使炎症浸润和硬化的机理和病因并没有明确结论。本发明人对21例IOIP患者血浆及组织蛋白样品进行IgG4抗体和前炎性因子、Th17相关因子组合物蛋白水平测定，利用基于微珠的多因子测定技术，对比对照组样品，IgG4综合征类疾病的检出率可达100%。

[0005] 综上所述，寻找免疫上游因子与其可能诱导激活的Th17免疫反应，以及最终产生的IgG4综合征有很重要的意义。这条通路的验证与生物靶点的确定能够对今后IOIP以及其他IgG4相关疾病的诊断和治疗均有指导性作用。我们针对这一设计思路进行了试验研究。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种TNF家族，IL-1β和Th17激活相关因子等生物分子标志物与血清学IgG4抗体含量检测联合应用的组合物，用于IgG4相关疾病诊断试剂盒的研制。本发明的另一目的是提供该因子及抗体组合物的应用。本发明的又一目的是提供制备含有该抗体组合物的试剂盒的方法。

[0007] Th17免疫相关因子及IgG4抗体组合物，其特征在于包括前炎症因子、Th17免疫相关因子结合血清学IgG4抗体。

[0008] 进一步，分别含有前炎症因子一种或多种、以及Th17免疫相关因子一种或多种。

[0009] 进一步，其特征在于所述血清学IgG4抗体含量是血浆或血清中IgG4抗体浓度、IgG4浓度占总IgG浓度比例或组织学中免疫组化IgG4阳性浆细胞占总淋巴细胞比例的一种或多种的组合。

[0010] 进一步，其特征在于：所述前炎症因子是TNF-α、sCD40L或IL-1β。

[0011] 进一步，其特征在于：所述Th17免疫相关因子是IL-17A、IL-31或IL-4。

[0012] 还包括所述Th17免疫相关因子及IgG4抗体组合物在IgG4综合征类疾病检测试剂中的应用。

[0013] 还包括所述Th17免疫相关因子及IgG4抗体组合物组合物的试剂盒。

[0014] 其特征在于所述的试剂盒是采用ELISA、放射免疫分析、自动化免疫分析、免疫沉淀、流式微珠测定或液态芯片技术平台制备或测定的。

[0015] 本发明的技术方案是：通过蛋白水平上TNF家族因子、IL-1β、IL-6、IL-4等前炎症因子及下游Th17激活相关因子中一种或多种的组合与血清学和/或组织学IgG4抗体的组合，作为检测IgG4综合征类疾病的试剂盒的检测试剂，并采用ELISA、放射免疫分析、自动化免疫分析、免疫沉淀、流式微珠测定或液态芯片技(LΜMINEX)平台制备和测定[0016] 所述血清学检测方法包括但不限于：ELISA方法、免疫印迹方法、多因子检测方法等免疫学手段。

[0017] 所述ELISA及其他免疫学方法中可以为直接检测或间接检测，抗体是特异抗体。所述特异抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。

[0018] 所述特异抗体可带有标记物，标记物可以是辣根过氧化物酶、荧光素酶、荧光标记、生物素等。

[0019] 所述多因子检测方法载体可以是基于蛋白亲和的膜、流式微珠测定或液态芯片技术等。

[0020] 所述IgG4抗体检测包含血清学检测和组织学检测。其中，血清学检测又可包括血清或血浆中实际IgG4抗体浓度检测，以及IgG4抗体占总IgG抗体的百分比。依据判断标准，IgG4浓度>135mg/dL或者IgG4/总IgG比值>8%即为IgG4阳性。IgG4组织学检测是指免疫组化方法检测组织切片中IgG4阳性细胞占浆细胞的百分比，组织学检测作为血清学检测的辅助手段，比值高于50%可视为IgG4相关疾病。

[0021] 所述IL-1β，TNF家族因子检测为血清学/局部组织中细胞因子蛋白水平浓度检测及其蛋白或受体基因水平的表达检测。TFN家族因子包括但不限于TNF-α，TNF-β，sCD40L。所检测的血清学或组织中因子为TNF-α，IL-1β，sCD40L等。各因子的选择可以是包含但不限于以上任意基因或因子在内的一种或多种的组合。

[0022] 所述Th17相关因子是指蛋白水平血清学或局部组织中IL-21，IL-6，IL-17，IL-31，IL-33等。

[0023] 所述特异抗体是针对前炎性因子及Th17相关因子的抗体。

[0024] 所述前炎性因子特异抗体为TNF-α，sCD40L，IL-1β。

[0025] 所述Th17相关因子特异抗体为IL-21，IL-17，IL-31，IL-33，IL-4。

[0026] 所述含有针对前炎性因子及Th17相关因子抗体和IgG4抗体的组合物在IOIP诊断试剂中的应用。

[0027] 检测各蛋白水平包括血清学和组织学因子的阳性判断标准规定为：病理样品数值/对照组平均数值>1.5，推荐比值为大于2判断为阳性，但由于具体实验中各样品差异较大，可适当放宽检测标准。成组检验中，T检验P值在P<0.05范围内视为结果可信。IgG4综合征类疾病阳性的判断标准为：IgG4抗体检测为阳性，并且中至少各有一种来自前炎性因子、Th17相关因子的指标为阳性。

[0028] 本发明的有益效果：

[0029] 本发明联合IgG4抗体，前炎性因子（TNF-α，sCD40L，IL-1β），Th17免疫相关因子（IL-17A，IL-31，IL-4），对21例由北京同仁医院已确诊的IOIP病人（IOIP患者被临床上认定属于IgG4综合征患者）血浆及蛋白样品和9例对照组海绵状血管瘤样品进行蛋白水平测定分析，可用于实验室判断IgG4综合征类疾病，其准确性可达100%。大样本量及准确性结果说明本发明的技术方案达到了临床诊断的要求，可进一步用于制备IgG4综合征诊断试剂。

[0030] 本发明还提供了制备试剂盒的方法，可以采用ELISA(酶联免疫吸附测定)、放射免疫分析、自动化免疫分析、免疫沉淀、流式微珠测定或液态芯片技术(Bio-rad)平台制备和测定。优选液态芯片技术平台制备。多因子检测液态芯片技术(Bio-plex)是一种新型生物分子高通量检测技术，也是目前唯一得到权威机构和FDA共同认可用于临床诊断应用的生物芯片平台，具有比传统ELISA更高的灵敏度和高通量的优势，本发明的抗体组合物运用液态芯片技术平台制备成试剂盒可进一步提高其敏感度和特异度。

附图说明

[0031] 附图1：免疫组化检测IOIP患者（上排）与对照组（下排）IgG4阳性淋巴细胞（物镜为40倍放大）

[0032] 附图2：IOIP与对照组局部病灶组织蛋白样品多因子检测

[0033] 附图3：IOIP与对照组血浆样品多因子检测具体实施方式：

[0034] 附表1试剂盒检测组织蛋白和血浆各因子及IgG4抗体

[0035]

[0036]

[0037] 注：“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果。

[0038] 实施例1：21例IOIP患者IgG4、前炎性因子、Th17相关因子的蛋白水平检测及试剂盒的制备

[0039] 在本发明的实施例中，我们以一种IgG4相关疾病IOIP的检测为例，包含IgG4抗体血清学检测、组织学检测，前炎性因子与Th17相关因子中代表性因子蛋白水平检测。并使用如下策略：

[0040] 选取21例已由北京同仁医院确诊的IOIP患者（病理组）和9例海绵状血管瘤（对照组）患者，样品包含血浆样品、组织蛋白提取物、组织石蜡切片。1.免疫组织化学（IHC）方法检测石蜡切片中IgG4阳性浆细胞情况。2.采用悬浮芯片技术检测各血浆样品、组织蛋白样品中的IgG4抗体、总IgG抗体、TNF-α、IL-1β、Th17相关因子等表达量。

[0041] 本发明的优势在于：1.多种细胞因子包括TNF-α、IL-1β及Th17激活相关因子与IgG4抗体检测联合应用检测、诊断与预测IOIP等IgG4综合征类疾病，检测了更广泛的一种自身免疫疾病，使检测结果更准确全面，减少漏诊误诊。2.TNF-α，sCD40L，IL-1β，IL-17A，，IL-4，IL-31，等因子以及IgG4抗体可直接检测血清、血浆样品，可实现微创检测效果。3.实施例中，IOIP表现为部分患者IgG4抗体血清学含量升高，可以作为IgG4综合征类疾病的一种眼部模型，具有发现早，敏感度高的特点，及时确诊有利于该类疾病的早期发现。4.可以制定针对各上游因子或受体的相应IgG4治疗方案，对IgG4综合征类疾病的治疗有重要意义。5.本发明的抗体组合物运用液态芯片技术(Bio-plex)平台制备成试剂盒可实现多因子同时检测并提高检测特异性。

[0042] 以21例IOIP患者的诊断试剂盒的制备为例说明本发明，用于对照的样品为9例海绵状血管瘤患者样品。本实施例不用来限制本发明的范围，若为特别指出，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售产品。

[0043] 1.IgG4抗体IHC检测石蜡切片

[0044] 对21例IOIP病理组和20例海绵状血管瘤对照组样品进行了酶联免疫吸附试验（ELISA），测试了血清中IgG4和总IgG的含量，步骤严格按照试剂盒说明书（eBioscience company，USA）。病人血浆取得过程：术中取血，全血在抗凝管中4℃保存2小时以内，2000rpm水平离心机中离心20分钟，吸取上层血浆。IgG4阳性判断标准依据血清学浓度大于135mg/dL或IgG4/总IgG比值大于8%。21例IOIP样品中，52.4%（11/21）为血清学阳性。病理组与对照组间有显著性差异（P<0.0001）。免疫组化方法检测病理组与对照组中IgG4抗体的表达情况，依据以下步骤：

[0045] 1）烤片：取石蜡切片，70℃加热30min。2）脱蜡：新鲜二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡15min脱蜡。3）水化：将切片依次在质量体积比100%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸馏水中浸泡5min。4）消除内源性过氧化物酶：3%H2O2浸泡10min。5）抗原修复：微波炉中1×CB抗原修复10min。6）封闭：正常山羊血清37℃封闭30min。7）加入一抗：去封闭液，加PBS1:1000稀释好的小鼠抗人IgG4抗体，放湿盒中4℃过夜。8）清洗：1×PBS清洗3min×3次，滴加HRP标记山羊抗小鼠抗体，37℃孵育30min。9）DAB显色：1×PBS清洗3min×3次。加新鲜配制的DAB溶液显色5-10min。10）染核：去离子水清洗后用苏木素复染核3-5min，自来水冲洗反蓝。11）分化：1%盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗。置于去离子水中10min。12）脱水：将切片依次在75%乙醇、85%乙醇、无水乙醇中梯度脱水。13）透明：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡5min。14）滴一滴中性树胶封片，显微镜观察、拍照。免疫组化结果如附图1所示，作为IgG4血清学诊断结果的辅助判断手段。

[0046] 2.悬浮芯片方法检测蛋白水平血浆和组织蛋白各21例IOIP及对照组各9例样品中IgG4抗体、IgG总抗体、前炎症因子（TNF-α,sCD40L，IL-1β）和Th17相关因子（组织中为IL-17A，IL-31；血浆中为IL-17A，IL-4）的含量

[0047] 试剂盒中抗体微珠的制备：(各种抗体均购于Bio rad公司，也可由其他生物制剂公司购得。试剂盒中各组分皆可由商业化途径购买或用常规技术配置)

[0048] 1）清洗微珠(BioPlex bead，Bio-rad)，(涡旋，真空超声30s)；

[0049] 2）取48种不同微珠各约5×106个微珠(约400μl)到离心管中；

[0050] 3)8000-10000g离心2min；

[0051] 4）弃上清，加100μl ddH2O，涡旋，真空超声30s；

[0052] 5)8000g离心2min；

[0053] 6)弃 上 清，加 80μl100mM NaH2PO4，10μl50mg/ml Sulfo-NHS，10μl50mg/ml EDC，涡旋，真空超声30s；

[0054] 7)避光室温放置20min(每隔10min涡旋一次)；

[0055] 8)8000-10000g离心2min；

[0056] 9）250μl50mM MES缓冲液清洗两次；

[0057] 10）弃上清，加100μl50mM MES缓冲液，加入相应10μl小鼠抗人IgG4抗体，10μl小鼠抗人总IgG抗体，10μl小鼠抗人TNF-α、sCD40L、IL-1β、IL-17A、IL-31或IL-4抗体。

[0058] 11）在震荡器上震荡(500-600rpm)，避光室温放置2h；

[0059] 12）8000-10000g离心2min；

[0060] 13）弃上清，加入500μl PBS-TBN，涡旋，真空超声30s；

[0061] 14）8000-10000g离心2min；

[0062] 15）弃上清，加入1ml PBS-TBN，涡旋，真空超声30s；

[0063] 16）8000-10000g离心2min；

[0064] 17）弃上清，加1ml PBS，1％BSA，0.05％叠氮钠；

[0065] 18）每孔加100μl洗液，轻轻混匀；

[0066] 19）每孔吸50μl，在Bio-rad悬浮芯片系统上检测。

[0067] 检测结果导入Bio-plex分析软件，按软件说明书操作，确定血浆或组织蛋白匀浆中各因子的含量(Bio-plex给出的结果是各因子的含量)，再利用SPSS统计分析，判断结果。

[0068] 对IOIP病理组与海绵状血管瘤对照组血浆和组织蛋白样品进行了多因子检测，实验步骤严格按照Bio-plex Protein Assay Protocol。局部组织蛋白样品和血浆样品检测了部分前炎症因子和Th17免疫相关因子：包括试剂盒中IgG4和总IgG抗体含量；前炎症因子TNF-α,sCD40L，IL-1β；Th17相关因子IL-17A,IL-31，IL-4。分析得出，如附图2、3所示，血浆和局部病理组织中各因子的表达，其中各因子对比与对照组的表达量均有显著提高（P<0.05）。IgG4血清学或组织学阳性的样品，组合物中其他因子的检测结果为，各样品浓度与对照组样品组浓度比值大于2，判断为阳性；对于IgG4血清学和组织学均为阴性的样品，组合中其他因子符合阳性判断标准，所以仍判断为IgG4综合征类疾病（表1）。

[0069] 其他因子与抗体组合检测准确性分析：

[0070] 1）组织蛋白因子与血浆IgG4抗体：TNF-α，IL-17A，IgG4：准确率100%；TFN-α，IL-31，IgG4：准确率95.23%；sCD40L，IL-17A，IgG4：准确率100%；sCD40L，IL-31，IgG4：准确率95.23%；IL-1β，IL-17A，IgG4：准确率100%；IL-1β，IL-31，IgG4：准确率95.23%。

[0071] 2）血浆因子与IgG4抗体：TNF-α，IL-17A，IgG4：准确率100%；TFN-α，IL-4，IgG4：准确率100%；sCD40L，IL-17A，IgG4：准确率100%；sCD40L，IL-4，IgG4：准确率100%；IL-1β，IL-17A，IgG4：准确率100%；IL-1β，IL-4，IgG4：准确率100%。

[0072] 综上所述，包括IgG4抗体与至少前炎症因子、Th17相关因子中各一种的组合均可用于IgG4综合征类疾病检测试剂的制备。

[0073] 本发明提供了IgG4综合征类疾病的检测标志物组合，与传统仅依靠IgG4血清学和组织学检测相比，提高了该类疾病的检出效率。本实验说明血浆中和局部病灶组织中包含但不限于以上因子和抗体的组合可以作为与IgG4联合的分子标记物进行IgG4综合征类疾病的实验室检测，并为该类疾病试剂盒的研制提供了科研基础。

[0074] 应当指出，对于经充分说明的本发明来说，还可具有多种变换及改型的实施方案，并不局限于上述实施方式的具体实施例。上述实施例仅仅作为本发明的说明，而不是限制。总之，本发明的保护范围应包括那些对于本领域普通技术人员来说显而易见的变换或替代以及改型。