一种食品工业喜盐菌种的低盐亚低温冷藏方法

摘要

本发明公开了一种食品工业喜盐菌种的低盐亚低温冷藏方法，涉及微生物领域。本发明是将喜盐菌种和含有2%的NaCl（即100ml液体中含有NaCl的量为2g）的保藏液放入安瓿瓶中混合均匀，然后置于-60℃冷冻1d，使保存液充分冷冻凝固，再将冷冻后的含菌种的安瓿瓶放入低温冷冻干燥机内抽真空，待安瓿瓶内的保藏液完全干燥，在强火焰下迅速封口，置于8℃条件下保存。本发明的方法操作简单，使用便捷，节能环保，菌种保藏时间久。

权利要求

1.一种食品工业喜盐菌种的低盐亚低温冷藏方法，其特征是，其步骤如下：(1)用移液枪无菌条件下取保藏液400μl移入2ml无菌安瓿瓶中，用棉塞塞住瓶口，置于高温灭菌锅内灭菌，灭菌温度为105℃，时间为15min；

(2)将(1)中灭菌后的安瓿瓶置于无菌操作室内冷却，然后在无菌条件下接入喜盐菌，

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其量为10-10 个；然后将其置于-60℃冷冻1d，使保藏液充分冷冻凝固；

(3)将(2)中冷冻后的含菌种的安瓿瓶放入低温冷冻干燥机内抽真空，干燥时间为

12h，至安瓿瓶内的保藏液完全干燥；然后在强火焰下迅速封口，置于8℃条件下保存；所述保藏液为20g脱脂奶粉、0.2g脯氨酸和2g NaCl用常规饮用水定容到100ml，混合均匀制得。

说明书

一种食品工业喜盐菌种的低盐亚低温冷藏方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物领域，尤其涉及的是一种食品工业喜盐菌种的低盐亚低温冷藏方法。

背景技术

[0002] 工业微生物菌种是未来工业发展的重要生物资源，因此工业菌种的保藏已成为一种重要的微生物常规工作。菌种保藏就是利用一切条件降低菌种的生命活动。菌种保藏的方法很多，都是为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境，如干燥、低温、缺乏氧气和养料等，使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不能使菌种死亡，从而达到保藏的目的。一般菌种的保藏常见的有冷冻保藏、斜面保藏、液体石蜡保藏。冷冻保藏是将微生物置于-20℃、-80℃或液氮（-196℃）中冷冻，优点是微生物变异频率低，缺点是设备投入高、运行成本高，比较适合专业保藏单位使用。另外，大多数中小型食品企业远离市区，甚至位于比较偏远的农村，对于液氮的获取不是很便利。斜面保藏通常是采用装棉塞的玻璃试管，用少于1/3管的无菌的固体培养基摆成斜面，中央划线接种，在28-30℃培养2-3天后，置于冰箱内4℃保藏，优点是操作简单，缺点是斜面培养基与空气接触面大，脱水较快，一般在半年内就会干缩；斜面保藏的菌种仍有一定的代谢活动，可进行繁殖，为了防止菌种死亡，通常3-4个月就应该传代转管，加大了菌种保藏的工作量，且由于菌种传代频繁，菌种变异频率较高。液体石蜡保藏法是把液体石蜡注入已长好菌的斜面上并高出斜面顶端1cm，使菌种与空气隔绝，此法优点是保藏时间长，一般2-10年，缺点是菌种保藏时必须用试管架竖直摆放，占用空间大，且只适应于对液体石蜡不敏感的微生物菌种的保藏。

[0003] 当前很多的工业菌种都要使用喜盐菌，这是因为很多的食品发酵都需要使用很高的盐浓度，如四川郫县豆瓣发酵中要使用约17%的NaCl，中国的许多工业腌制菜中要使用约13%的NaCl等等，这些发酵的工业菌种需要耐受一定的NaCl才能保持更好的发酵和产生良好的食品风味。中国很多的食品企业，尤其是一些中小型企业对菌种保藏的意思淡薄，保藏技术简陋，加上有些保藏方法不得当造成工业菌种的污染和退化，甚至造成一些优良的食品发酵工业菌种的死亡，丢失。喜盐菌作为一类特殊的微生物类群，它们要在一定的盐+ +环境下生存，Na对维持细胞膜、细胞壁构造和功能有特别重要的作用。Na 与细胞膜成分发生特异作用而增强了膜的机械强度，有利于维持细胞膜的构造，对阻止喜盐菌的溶菌起着重要作用。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在保藏喜盐菌中存在的不足，提供了一种食品工业喜盐菌种的低盐亚低温冷藏方法。

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 一种食品工业喜盐菌种的低盐亚低温冷藏方法，其步骤如下：

[0007] （1）用移液枪无菌条件下取保藏液400μl移入2ml无菌安瓿瓶中，用棉塞塞住瓶口，置于高温灭菌锅内灭菌，灭菌温度为105℃，时间为15min；

[0008] （2）将（1）中灭菌后的安瓿瓶置于无菌操作室内冷却，然后在无菌条件下接入喜盐8 10
菌，其量为10-10 个；然后将其置于-60℃冷冻1d，使保存液充分冷冻凝固；

[0009] （3）将（2）中冷冻后的含菌种的安瓿瓶放入低温冷冻干燥机内抽真空，干燥时间为12h，至安瓿瓶内的保藏液完全干燥；然后在强火焰下迅速封口，置于8℃条件下保存。

[0010] 所述保藏液为20g脱脂奶粉、0.2g脯氨酸和2gNaCl用常规饮用水定容到100ml，混合均匀制得。

[0011] 本发明的有益效果是：（1）菌种保藏时间长久，与液氮保藏效果基本一致。（2）菌种保藏以脱脂牛奶和脯氨酸混合作为保护剂，同时添加2%的氯化钠，避免了停电时菌种因渗透压造成死亡和菌种退化，同时低盐保藏也比高盐保藏起来更加节省资源成本。（3）采用安瓿瓶小剂量保藏，方便一次性随取随用，操作简单，降低了斜面多次取种污染以及保藏转接带来的风险，为中小型企业及其远离市区的各类企业菌种保藏提供了一种简便有效途径。（4）本发明采用非常规低温的8℃保藏技术，而不是冷冻保藏，能减少电量的使用，节能环保，与冷冻保藏相比可以大大降低菌种保藏成本。除此之外，8℃保藏对于突发的停电情况可以有效缓解菌种因温差变化带来的变异，大大提高菌种的存活率。

具体实施方式

[0012] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

[0013] 实施例1

[0014] 1、豆瓣发酵菌种的低盐亚低温冷藏方法

[0015] （1）豆瓣发酵过程中存在的微生物菌种：WeissellahalotoleransCICC10646、AspergillusoryzaeCICC2355、Halobacillussp.CICC10447、CandidautilisCICC1422、AspergillusflavusCICC40875、LactobacillusplantarumCICC23138、Saccharomyces cerevisiaeCICC31443、TetragenococcushalophilusCICC10469、BacillussubtilisCICC21377均购自 于中国工 业微生物 菌种保 藏管理中 心，HalomonasalkaliphilaCGMCC1.7449购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。每株菌保存
20支安瓿瓶。

[0016] （2）称取40g脱脂奶粉溶解于200ml温水中，并加入4g氯化钠和0.4g脯氨酸，使其完全溶解，混合均匀，配成保藏液。

[0017] （3）用移液枪吸取400μl（2）中制得的保藏液于2ml安瓿瓶中，加完后用棉塞塞住，高压灭菌锅灭菌15min，温度设定为105℃；将灭菌后的安瓿瓶置于无菌操作室内冷却，8 10
然后在无菌条件下往安瓿瓶中移入待保藏的菌体，每管的菌体量为10-10 个，并与保存液均匀混合；然后将其放在-60℃冷冻24h，再置于冷冻干燥机的冷阱中抽真空，冷阱的温度为-60℃，干燥时间为12h，干燥后的保存液为干粉状态。

[0018] （4）将（3）中真空干燥后的安瓿瓶用酒精喷灯封口，封口后的安瓿瓶放置于8℃下保藏。

[0019] 2、对冷冻保藏（-20℃），液氮保藏（-196℃），以及本发明的低盐亚低温冷藏的保藏效果进行菌种存活率的比较。菌种采用上述3种方式保存3年，其菌种的存活率验证结果如表1所示。

[0020] 表1不同保藏方法的菌种存活率

[0021]第一年 第二年 第三年
冷冻保藏 97% 92% 83%
低盐亚低温冷藏 100% 100% 99%
液氮保藏 100% 99% 97%

[0022] 实施例2

[0023] 1、腌制菜发酵菌种的低盐亚低温冷藏方法

[0024] （1）腌制菜发酵过程中存在的微生物菌种：TetragenococcushalophilusCICC10286、BacillussubtilisCICC21376、LactobacillussakeiCICC21858、Zygosaccharomycesrouxii CICC1378、SalimicrobiumhalophilumCICC10482、Lactobacillusplantarumsubsp.plantarumCICC20718、AspergillusoryzaeCGMCC3.04382、Leuconostocmesenteroides subsp.mesenteroidesCICC22184、BacillusmethylotrophicusCICC21984、Lactobacillus plantarumCICC20766、BacillusamyloliquefaciensCICC10036、Lactobacilluscoryniformis subsp.coryniformisCICC21795均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，Weissella hellenicaCGMCC1.2513和PediococcuspentosaceusCGMCC1.2441购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。每株菌保存20支安瓿瓶。

[0025] （2）称取40g脱脂奶粉溶解于200ml温水中，并加入4g氯化钠和0.4g脯氨酸，使其完全溶解，混合均匀，配成保藏液。

[0026] （3）用移液枪吸取400μl（2）中制得的保藏液于2ml大小的安瓿瓶中，加完后用棉塞塞住，高压灭菌锅灭菌15min，温度设定为105℃；将灭菌后的安瓿瓶置于无菌操作室内冷却，然后在无菌条件下往安瓿瓶中移入待保藏的菌体，每管的菌体量为108-1010个，并与保存液均匀混合；然后将其放在-60℃冷冻24h，再置于冷冻干燥机的冷阱中抽真空，冷阱的温度为-60℃，干燥时间为12h，干燥后的保存液为干粉状态。

[0027] （4）将（3）中真空干燥后的安瓿瓶用酒精喷灯封口，封口后的安瓿瓶放置于8℃下保藏。

[0028] 2、对冷冻保藏（-20℃），液氮保藏（-196℃），以及本发明的低盐亚低温冷藏的保藏效果进行菌种存活率的比较。菌种采用上述3种方式保存3年，其菌种的存活率验证结果如表2所示。

[0029] 表2不同保藏方法的菌种存活率

[0030]第一年 第二年 第三年
冷冻保藏 98% 94% 85%
低盐亚低温冷藏 100% 99% 97%