促进间充质干细胞体外增殖及延缓衰老的活性基质胶

摘要

本发明提供促进间充质干细胞体外增殖及延缓衰老的活性基质胶，其是通过以下方法制得：（1）将切除的脐带置于保存液内，所述保存液为磷酸盐缓冲液含双抗，在4℃下保存直至处理；（2）在无菌条件下用磷酸盐缓冲液冲洗脐带，以75%乙醇浸泡20秒，取出后分解成小段，去除血管及外膜，剪碎至呈0.5-1.5mm3的小块；（3）转移至无菌离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液置4℃下48秒，间或震荡，溶胀组织；（4）用高速匀浆机4℃下匀浆打碎，再用玻璃匀浆器4℃匀浆后，再次用高速匀浆机4℃下尽量将匀浆打碎；（5）以12000转离心30分钟，取上清，即得到所述活性基质胶成品。

权利要求

1.一种促进间充质干细胞体外增殖及延缓衰老的活性基质胶，其特征在于，其是通过以下方法制得：(1)将切除的脐带置于保存液内，所述保存液为含100u的青霉素及100μg的链霉素的

0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，在4℃下保存直至处理；

(2)在无菌条件下用磷酸盐缓冲液冲洗脐带，以75％乙醇浸泡20秒，取出后分解成小3

段，去除血管及外膜，剪碎至呈0.5-1.5mm的小块；

(3)转移至无菌离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液置4℃下48小时，间或震荡，溶胀组织；

(4)用高速匀浆机4℃下匀浆打碎，再用玻璃匀浆器4℃匀浆后，再次用高速匀浆机4℃下尽量将匀浆打碎；

(5)以12000转离心30分钟，取上清，即得到所述活性基质胶成品；

其中，步骤(1)中，所述脐带在4℃下保存不超过24小时。

2.如权利要求1所述的活性基质胶，其特征在于，步骤(2)中，所述用磷酸盐缓冲液冲洗脐带为冲洗3次。

3.如权利要求1或2中所述的活性基质胶在促进间充质干细胞体外增殖及延缓衰老中的用途，其特征性在于，所述的用途是将来源于动物或人体的间充质干细胞体外培养于所述活性基质胶，从而促进间充质干细胞体外增殖及延缓其复制性衰老。

4.一种促进间充质干细胞体外增殖及延缓衰老的活性基质胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：(1)将切除的脐带置于保存液内，所述保存液为含100u的青霉素及100μg的链霉素的

0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，在4℃下保存直至处理；

(2)在无菌条件下用磷酸盐缓冲液冲洗脐带，以75％乙醇浸泡20秒，取出后分解成小3

段，去除血管及外膜，剪碎至呈0.5-1.5mm的小块；

(3)转移至无菌离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液置4℃下48小时，间或震荡，溶胀组织；

(4)用高速匀浆机4℃下匀浆打碎，再用玻璃匀浆器4℃匀浆后，再次用高速匀浆机4℃下尽量将匀浆打碎；

(5)以12000转离心30分钟，取上清，即得到所述活性基质胶成品；

其中，步骤(1)中，所述脐带在4℃下保存不超过24小时。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述用磷酸盐缓冲液冲洗脐带为冲洗3次。

说明书

促进间充质干细胞体外增殖及延缓衰老的活性基质胶

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于体外培养，可以延缓间充质干细胞（mesenchymal stemcells，MSCs）的复制性衰老、促进细胞增殖并维持MSCs的“干性”的活性基质胶。

背景技术

[0002] 间充质干细胞MSCs是来源于中胚层的一类成体干细胞，可从骨髓、脐带、胎盘、肌肉、脂肪等多种组织中分离出来。MSCs具有自我更新以及多向分化的潜能，在体内整个生命周期、以及疾病与创伤条件下参与组织器官的更新与修复。间充质干细胞具有免疫调节特性及分泌丰富的营养因子，且具极低的免疫原性，因此具有广泛的临床应用研究的潜能，已被应用于缺血性心脏病、免疫系统疾病、神经系统疾病、糖尿病、GVHD等临床基础与应用研究。但是，原始存在于骨髓、脂肪的MSCs的数目较少，难以满足临床治疗和研究方面的需求，因此需要在体外对间充质干细胞进行大量扩增。然而，像人体其它体细胞一样，间充质干细胞的体外的扩增培养，由于体外失去体内干细胞生存的微环境，在体外培养中从开始就存在着复制性衰老的特性，使MSCs的分化能力及自我更新能力以及相关的特性随着衰老的逐渐加重而丢失。使得人们很难获得既能满足数量上的需求又保持干细胞的特性的细胞，因此严重制约了间充质干细胞的基础与应用研究。

[0003] 间充质干细胞在体内能保持自我更新及复制能力是取决于所处的干细胞微环境的缘故。研究表明，干细胞生存的微环境，包含了包括细胞外基质（ECM）成分及众多的细胞因子的适宜调控因素，调节着干细胞的特性包括自我更新及多向分化的能力。因此，人们试图体外模拟体内干细胞微环境解决体外培养扩增存在的复制性衰老的难题。模拟微环境含有的主要成分是胶原蛋白，在一定程度上促进了间充质干细胞的增殖及延缓了衰老的出现。同时使用MSCs特异的ECM，即用来源于骨髓间充质干细胞的ECM为自然的成分模拟体内微环境，在体外明显促进了间充质干细胞的增殖，抵抗复制性衰老的过早出现。体外利用ECM成分模拟体内微环境，在一定程度解决了复制性衰老的问题。但是，由于参与干细胞微环境调控的既有ECM成分又包括了细胞因子成分，是个复杂的有机体，现有的合成的方法很难再现其复制性。利用MSCs的ECM构建的干细胞的微环境，由于MSCs本身存在的衰老的及无法大量制备等缺陷更限制了其大量制备，限制了其在临床及基础研究中的应用。因此，随着MSCs大量的临床及基础研究的开展，亟待解决其在体外培养过程中存在的复制性衰老的的问题。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于，提供一种能在体外包被培养皿的表面模拟体内微环境，延缓MSCs的衰老的发生、促进MSCs增殖的制品。

[0005] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0006] 一种促进间充质干细胞体外增殖及延缓衰老的活性基质胶，其特征在于，其是通过以下方法制得：

[0007] （1）将切除的脐带置于保存液内，所述保存液为含100u的青霉素及100μg的链霉素的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，在4℃下保存直至处理；

[0008] （2）在无菌条件下用磷酸盐缓冲液冲洗脐带，以75%乙醇浸泡20秒，取出后分解成3
小段，去除血管及外膜，剪碎至呈0.5-1.5mm的小块；

[0009] （3）转移至无菌离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液置4℃下48小时，间或震荡，溶胀组织；

[0010] （4）用高速匀浆机4℃下匀浆打碎，再用玻璃匀浆器4℃匀浆后，再次用高速匀浆机4℃下尽量将匀浆打碎；

[0011] （5）以12000转离心30分钟，取上清，即得到所述活性基质胶成品。

[0012] 如上所述的活性基质胶，优选地，步骤（1）中，所述脐带在4℃下保存不超过24小时。

[0013] 如上所述的活性基质胶，优选地，步骤（2）中，所述用磷酸盐缓冲液冲洗脐带为冲洗3次。

[0014] 如上所述的活性基质胶在促进间充质干细胞体外增殖及延缓衰老中的用途，其特征性在于，所述的用途是将来源于动物或人体的间充质干细胞体外培养于所述活性基质胶，从而促进间充质干细胞体外增殖及延缓其复制性衰老。

[0015] 如上所述的用途，优选地，将所述活性基质胶以磷酸盐缓冲液0.05-10%g/mL的浓度，于培养容器中37℃下包被2小时，或4℃下包被16-24小时后，用于所述间充质干细胞的体外培养。

[0016] 一种促进间充质干细胞体外增殖及延缓衰老的活性基质胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：

[0017] （1）将切除的脐带置于保存液内，所述保存液为含100u的青霉素及100μg的链霉素的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，在4℃下保存直至处理；

[0018] （2）在无菌条件下用磷酸盐缓冲液冲洗脐带，以75%乙醇浸泡20秒，取出后分解成3
小段，去除血管及外膜，剪碎至呈0.5-1.5mm的小块；

[0019] （3）转移至无菌离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液置4℃下48小时，间或震荡，溶胀组织；

[0020] （4）用高速匀浆机4℃下匀浆打碎，再用玻璃匀浆器4℃匀浆后，再次用高速匀浆机4℃下尽量将匀浆打碎；

[0021] （5）以12000转离心30分钟，取上清，即得到所述活性基质胶成品。

[0022] 如上所述的制备方法，优选地，步骤（1）中，所述脐带在4℃下保存不超过24小时。

[0023] 如上所述的制备方法，优选地，步骤（2）中，所述用磷酸盐缓冲液冲洗脐带为冲洗3次。

[0024] 本发明的有益效果为：

[0025] 本发明采用剪碎、溶胀、冻融、高速破碎、组织匀浆等物理提取技术，较完整的保留了华通基质胶组份。这些成份在体内构成了MSCs生存的微环境，在这样的微环境中，间充质干细胞维持着自我更新、自我复制以及多项分化潜能，维持着干细胞的特性。利用本发明活性基质胶提取物包被培养皿，体外模拟体内微环境培养MSCs，可以比普通培养方法延缓至少30PDs以上出现衰老。得到的干细胞具有较高的成骨与成脂分化的能力，为MSCs基础与临床研究提供了更多、更稳定的种子细胞。

[0026] 下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。

附图说明

[0027] 图1为本发明活性基质胶在培养皿表面的形态特点，其中a为相差显微镜下形态，b为扫描电子显微镜下形态。

[0028] 图2为UC-MSCs形态变化示意照片，其中a为在正常对照培养皿中的照片，b为在本发明活性基质胶中的照片。

[0029] 图3为UC-MSCs生长动力学曲线，其中a和b为培养早期MTT测定UC-MSCs增殖能力的曲线，a为10PD，b为20PB，c为长期培养的UC-MSCs生长曲线。

[0030] 图4为UC-MSCs免疫表型的变化，其中a为30PD，b为50PD。

[0031] 图5为UC-MSCs成脂分化能力的变化示意照片，其中a为在正常对照培养皿中的照片，b为在本发明活性基质胶中的照片。

[0032] 图6为SA-β-gal活性示意图，其中a和b为普通光镜下SA-β-gal活性示意照片，且a为在正常对照培养皿中的照片，b为在本发明活性基质胶中的照片，c为SA-β-gal染色阳性率统计图。

具体实施方式

[0033] 本发明经过优化组合，选取了去除脐带外膜、血管，剪碎后溶胀再匀浆加超速及超声破碎的物理萃取的方案，得到了脐带华通胶提取物。提取物中既含有细胞外基质的主要成分包括胶原蛋白、纤连蛋白等，也包含了丰富的包括碱性成纤维细胞生长因子、血小板样生长因子等生长因子。这些成分构成的混合物曾液态胶状，是MSCs良好的微环境，MSCs在此物质包被的培养环境中，复制性衰老被延迟出现。本发明优化了混合物包被的的浓度，培养得到的细胞数目明显增多。采用本发明的混合物用于促进间充质干细胞体外增殖及延缓复制性衰老，为基于基础及临床研究的为目的的MSCs的体外培养提供新的生物材料与技术。

[0034] 下面以具体实施例对本发明作进一步详细说明如下：

[0035] 实施例1 本发明活性基质胶的制备

[0036] 本发明活性基质胶制备的材料来自脐带。脐带可以来自医院中新生儿的废弃脐带或从实验动物小型猪上切除的脐带。若处理来自医院中新生儿的废弃脐带时，在收取脐带前必须与新生儿父母签署知情同意书。

[0037] （1）将切除的脐带置于保存液内，所述保存液为含100u的青霉素及100μg的链霉素的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，4℃保存直至处理，一般不超过24小时。

[0038] （2）在无菌条件下用磷酸盐缓冲液冲洗脐带三次，去除红细胞；75%乙醇浸泡203
秒，取出，分解成小段，去除血管及外膜，用无菌剪刀剪碎至呈约1mm的小块。

[0039] （3）转移至无菌离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液置4℃下48小时，间或震荡，溶胀组织。

[0040] （4）用高速匀浆机4℃下匀浆打碎，再用玻璃匀浆器4℃匀浆后，再次用高速匀浆机4℃下尽量将匀浆打碎。

[0041] （5）12000转下离心30分钟，取上清，即得到本发明活性基质胶成品，测定蛋白含量。

[0042] 实施例2 本发明活性基质胶的包被及形态特点

[0043] （1）以磷酸盐缓冲液稀释活性基质胶成品至0.1～10%g/mL，4℃过夜或37℃2小时包被培养皿。

[0044] （2）弃去多余的基质胶，用磷酸盐缓冲液浸洗2次，待用。

[0045] （3）如图1a所示，在光学相差显微镜下观察，包被在培养皿表面的本发明活性基质胶呈均匀的颗粒状。

[0046] （4）将包被好的培养皿用2.5%多聚甲醛4℃固定24h后，用体积百分比70、75、80、85、90、95和100%的乙醇依次脱水，每个浓度脱水2次，每次15分钟，之后真空干燥。喷金后用扫描电子显微镜检测。包被于培养皿表面的活性基质胶呈直径为2-5μm的颗粒状排列，其照片如图1b所示。

[0047] 实施例3 利用本发明活性基质胶进行UC-MSCs分离、培养和扩增[0048] （1）UC-MSCs分离、培养和扩增

[0049] A.脐带切除后于保存液内，所述保存液为含100u的青霉素及100μg的链霉素的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，一般不超过24小时。

[0050] B.在无菌条件下用磷酸盐缓冲液冲洗脐带三次，去除红细胞；75%乙醇浸泡20秒，3
取出，分解成小段，去除血管及外膜，用无菌剪刀剪碎至呈约1mm的小块。

[0051] C.转移到100mL三角烧瓶中，按每厘米脐带加入1mL消化液，所述消化液含终浓度为0.2mg/mL的胶原酶Ⅱ及1μg/mL的透明质酸酶，37℃磁力搅拌器作用下消化14～20h。消化液变粘稠，直至全部消化。

[0052] D.加5倍体积的磷酸盐缓冲液稀释，2000转离心30分钟，弃上清液，沉淀用磷酸6
盐缓冲液清洗、离心，用含10%胎牛血清的完全培养基稀释培养。以5×10/mL个细胞接种
2 2
于25cm承装有上述培养基的培养瓶中。37℃、5%CO 、饱和湿度下培养，5天全量换液去除非贴壁细胞，以后每3-4天换液一次。

[0053] E.当细胞达60-70%融合时，以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化细胞传代培养。

[0054] （2）UC-MSCs的衰老相关的监测指标

[0055] A.与衰老相关的细胞形态的变化

[0056] MSCs形态的改变直接反映细胞衰老的变化。我们在普通光学显微镜下连续观察了UC-MSCs形态学的改变。在早期即10PD（即群体倍增指数）时，无论是培养在本发明活性基质胶上还是正常培养皿上，细胞均呈现正常的细长成纤维细胞状的形态，在中晚期30PD或50PD，仍能大部分保持这种形态特点，如图2a和b所示。

[0057] B.细胞生长曲线

[0058] 分别取相对于10PD、20PD的培养细胞，制备单细胞悬液，计数，用完全培养基调整3
细胞浓度为5×10/mL，接种于96孔细胞培养板中。分别从1-6天，每天取3孔加入终浓度
0.25mg/mL二苯基四氮唑溴盐37℃20分钟，然后换用0.2mL的二甲基亚砜。使用酶联仪测定OD540nm的值，以时间（天）为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制生长曲线，如图3a所示。

[0059] 结果证实，UC-MSCs培养在本发明活性基质胶包被的培养皿中与正常对照相比未见明显差别，本发明活性基质胶并不影响UC-MSCs的增殖能力。

[0060] C.群体倍增指数（PD）

[0061] UC MSCs从第一次传代开始定义为培养起始浓度，以2000/cm2密度接种T75培养瓶，融合度达70%传代并计数重复接种同样的细胞数，直到复制性衰老的迹象出现，细胞停止生长。计算PDs的公式为：

[0062] PD=log2(D/D0)，其中D0= 接种的细胞数，D= 收获的细胞总数。

[0063] 结果显示，本发明活性基质胶明显提高了细胞的增殖能力，大约提高约30PD，如图3b所示。

[0064] D.表型检测

[0065] 分别取细胞悬液1mL（1×106细胞/mL），在每一管中分别加入2mL磷酸盐缓冲液缓冲液，并充分混匀，室温中静置5分钟。1000转/分钟离心5分钟，用磷酸盐缓冲液缓冲液冲洗重悬。加入连接有荧光素的单克隆抗体及其同型对照进行免疫标记反应，暗箱室温下孵育30分钟。1000转/分钟离心10分钟。用磷酸盐缓冲液缓冲液冲洗重悬，重复冲洗一次，上机检测。结果如图4a和b所示，CD34、CD45、HLA-DR呈阴性；CD73、CD90、CD105呈阳性，且30PD和50PD检测的结果基本一致。

[0066] E.向脂肪细胞诱导分化

[0067] 分别收集消化后的10、30、50PD的MSCs，按2×104/cm2接种于6孔板，待细胞融合达50%以上后，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液，加入脂肪诱导体系，所述体系为：地塞米松1μmol/L、人胰岛素5mg/L、IBMX 0.5mmol/L、消炎痛100μmol/L。每3天全量换液，维持3周。细胞经油红O染色，镜下观察细胞内脂肪小滴形成情况。结果如图5a和b所示，本发明活性基质胶明显抑制了MSCs随着体外培养的不断进行而出现的脂肪分化能力的下降。

[0068] F.SA-β-gal活性

[0069] 与衰老相关的β-gal活性直接显示细胞的状态。分别检测了MSCs在30PD、50PD时SA-β-gal活性，结果如图6a、b和c所示，本发明活性基质胶明显抑制了MSCs的SA-β-gal的活性。