一种液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-烷化腺嘌呤的应用

摘要

一种液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-烷化腺嘌呤的应用，其特征在于：其测试过程是24小时尿液在室温下解冻，混合均匀离心过滤，通过OasisMCX固相萃取小柱净化富集，混匀后引入LC-MS/MS系统分析，可准确检测出尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤，3-MeA；3-乙基腺嘌呤，3-EtA；3-羟乙基腺嘌呤，3-HOEtA)的含量水平。本发明采用氘代标准品作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差、串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。

权利要求

1.一种液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-烷化腺嘌呤的应用，即监测3-甲基腺嘌呤（3-MeA）、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）的应用，其特征在于：包括以下具体过程：取样，招募吸烟者、非吸烟者志愿者，对志愿者进行筛选，采集入选志愿者24小时排泄的全部尿液收集存放于5L的聚丙烯桶中，每一志愿者尿液分别存放于-80℃超低温冰箱中保存；

逐一对志愿者尿液进行处理、测定，得到每一个志愿者尿液样品中3-甲基腺嘌呤（3-MeA）、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）的含量；

将每一志愿者尿液样品的测定数据输入数据分析软件进行分析处理，找出吸烟者尿液中3-甲基腺嘌呤（3-MeA）、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）的含量规律；

对志愿者尿液进行处理、测定的具体步骤如下：

a、样品前处理：尿液在室温状态下解冻并混合均匀，取4 mL尿液，加入4mL超纯水，加入100 μL混合内标，用水浴锅调节温度到75-85℃，取超纯水稀释至8 mL后的尿液置于固相萃取柱中；

固相萃取用Waters Oasis MCX固相萃取柱，预先用2 mL甲醇、5 mL水溶液活化，上样量为8 mL，用2 mL 10％甲醇/水溶液淋洗，然后用1 mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液洗脱，收集洗脱液并于60 ℃下用氮气吹至干，然后用100 μL水溶液溶解，供LC-MS/MS分离分析；

b、标准工作液的配制：用乙腈配制不同浓度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)标准工作溶液、

3-乙基腺嘌呤（3-EtA）标准工作溶液和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）标准工作溶液；

c、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)标准工作溶液、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）标准工作溶液和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量；

选取Waters HILIC色谱柱，规格150 mm x 2.1 mm，2.5 µm，流动相体系及洗脱条件为：流动相A：乙腈溶液，pH 4.0，流动相B：10mM的甲酸铵/水溶液，pH 4.0，A:B=95:5；流速0.25 mL/min；柱温25℃；进样量3 µL，洗脱时间：0 ~ 20 min；质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描方式；喷雾电压为5500 V；雾化气压力为344.5 kPa；气帘气压力为206.7 kPa；辅助雾化气压力为310.0 kPa；离子源温度为500℃；去蔟电压为100 eV；碰撞能为30 eV；驻留时间为100 ms，监测离子对为3-MeA：150→123定量离子对，150→108定性离子对；内标d3-3-MeA为153→126；3-EtA：164→136定量离子对，164→119定性离子对；内标d5-3-EtA为169→137；3-HOEtA：180→136定量离子对，180→119定性离子对；内标d5-3-EtA为169→137。

2.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测

3-烷化腺嘌呤的应用，其特征在于：所述混合内标为d3-3-MeA和 d5-3-EtA混合溶液，其中d3-3-MeA为100 ng/ml, d5-3-EtA为2ng/ml。

3.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测

3-烷化腺嘌呤的应用，其特征在于：所述甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液的具体配比为47.5:

47.5: 5。

4.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测

3-烷化腺嘌呤的应用，其特征在于：所述的数据分析软件为Office excel或SPSS统计分析软件。

说明书

一种液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监

测3-烷化腺嘌呤的应用

技术领域

[0001] 本发明属于尿液样本的理化检验技术应用领域，主要涉及尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)的测定技术应用领域，具体说是一种采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪（LC-ESI-MS/MS）测定尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)的方法的应用。

背景技术

[0002] 3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)是外源性化合物体内代谢生成的自由基与腺嘌呤结合后的产物。由于尿中内源性3-烷化腺嘌呤本底值低，又能较为准确的反映原型化合物的特性，因此作为生物监测指标广泛用于环境烷基化污染物的生物监测。据报道，尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤
3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)与吸烟者烟气接触水平有较强的相关性，能够用于评价烟气中有害成分亚硝胺的接触水平。

[0003] 目前，关于尿液中DNA加合物的分析检测方法应用的报道较多，但是大规模采集中国吸烟者尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)进行分析的未见报导。

发明内容

[0004] 本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提出的一种采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术应用于分析大规模尿液样品中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)的方法。该方法具有快速、准确，可靠等特点，可用于大规模吸烟者尿液中3-烷化腺嘌呤的定性定量分析。

[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

[0006] 一种液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测3-烷化腺嘌呤的应用，即监测3-甲基腺嘌呤（3-MeA）、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）的应用，包括以下具体过程：

[0007] (1)取样，招募吸烟者、非吸烟者志愿者，对志愿者进行筛选，采集入选志愿者24小时排泄的全部尿液收集存放于5L的聚丙烯桶中，每一志愿者尿液分别存放于-80℃超低温冰箱中保存；

[0008] (2)逐一对志愿者尿液进行处理、测定，得到每一个志愿者尿液样品中3-甲基腺嘌呤（3-MeA）、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）的含量，对志愿者尿液进行处理、测定的具体步骤如下：

[0009] a、样品前处理：尿液在室温状态下解冻并混合均匀，取4 mL尿液，加入4mL超纯水，加入100 μL混合内标，用水浴锅调节温度到75-85℃，取超纯水稀释至8 mL后的尿液置于固相萃取柱中；所述混合内标为d3-3-MeA和 d5-3-EtA混合溶液，其中d3-3-MeA浓度为100 ng/ml, d5-3-EtA浓度为2ng/ml。

[0010] 固相萃取用Waters Oasis MCX固相萃取柱，预先用2 mL甲醇、5 mL水溶液活化，上样量为8 mL，用2 mL 10％甲醇/水溶液淋洗，然后用1 mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液（47.5: 47.5: 5）洗脱，收集洗脱液并于60 ℃下用氮气吹至干，然后用100 μL水溶液溶解，供LC-MS/MS分离分析；

[0011] b、标准工作液的配制：用乙腈配制不同浓度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)标准工作溶液、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）标准工作溶液和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）标准工作溶液；

[0012] c、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)标准工作溶液、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）标准工作溶液和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

[0013] 在色谱测定中，选取了Waters HILIC色谱柱，规格150 mm x 2.1 mm，2.5 µm流动相体系选取A:乙腈和B: 10m mol/L甲酸铵/水溶液，A:B为95:5，色谱测定中的洗脱条件：流动相A:乙腈和B: 10m mol/L甲酸铵/水溶液，A:B为95:5；流速0.25 mL/min；柱温25 °C；进样量3 µL，洗脱时间：0 ~ 20 min。

[0014] 质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式；喷雾(IS)电压为5500 V；雾化气(Gasl)压力为344.5 kPa(50 psi)；气帘气(CUR)压力为206.7 kPa(30 psi)；辅助雾化气(Gas2)压力为310.0 kPa(45 psi)；离子源温度(TEM)为500℃；去蔟电压(DP)为100 eV；碰撞能(CE)为30 eV；驻留时间为100 ms，监测离子对为3-MeA：150→123（定量离子对），150→108（定性离子对）；内标d3-3-MeA为153→126；3-EtA：164→136（定量离子对），164→119（定性离子对）；内标d5-3-EtA为169→137；3-HOEtA：180→136（定量离子对），180→119（定性离子对）；内标d5-3-EtA为169→137。 (3)将每一志愿者尿液样品的测定数据输入数据分析软件进行分析处理，找出吸烟者尿液中3-甲基腺嘌呤（3-MeA）、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）的含量规律, 所述的数据分析软件为Office excel或SPSS统计分析软件。

[0015] 本发明通过对大规模志愿者的招募，大量尿液样品的保存条件的优化，建立了分析、检测中国吸烟者尿液中3-烷化腺嘌呤的含量水平的应用方法，适合于分析大量的吸烟人群尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)水平。每个样本在20 min内就可完成3-烷化腺嘌呤的检测，并使用Excel和SPSS软件对大规模检测样品进行分析

[0016] 本发明具体的工艺过程进一步详述如下：

[0017] 1、样品前处理

[0018] 样品前处理：尿液在室温状态下解冻并混合均匀，取4 mL尿液，加入4mL超纯水，加入100 μL内标（100ng/mL），用水浴锅调节温度到80℃。取超纯水稀释后的尿液置于10 mL固相萃取柱中。固相萃取选取Waters Oasis MCX（6 mL, 500 mg）小柱，预先用2 mL的甲醇，5 mL的水活化柱子，上样量为8 mL，用2 mL的10%的甲醇淋洗，然后1 mL乙酸乙酯溶液淋洗，然后用1 mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水（47.5: 47.5: 5）洗脱，收集洗脱液并于60 ℃下用氮气吹至干，然后用100 μL水溶液溶解，供LC-MS/MS分离分析。

[0019] 2、LC-MS/MS测定

[0020] （1）LC-MS/MS条件

[0021] 色谱条件：Waters HILIC (150 mm x 2.1 mm，2.5 µm)色谱柱，流动相A：乙腈溶液，pH 4.0（体积分数），流动相B：10mM的甲酸铵/水溶液，pH 4.0；流速0.25 mL/min；柱温25 °C；进样量3 µL。洗脱时间：0 ~ 20 min。

[0022] 质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式；喷雾(IS)电压为5500 V；雾化气(Gasl)压力为344.5 kPa(50 psi)；气帘气(CUR)压力为206.7 kPa(30 psi)；辅助雾化气(Gas2)压力为310.0 kPa(45 psi)；离子源温度(TEM)为500℃；去蔟电压(DP)为100 eV；碰撞能(CE)为30 eV；驻留时间为40 ms。监测离子对及其相应的碰撞能量(CE)见表1。

[0023] 表 1 多反应监测模式下3-烷化腺嘌呤及其氘代内标的部分质谱参数

[0024]分析物 母离子(amu) 子离子(amu) 扫描时间(ms) 去蔟电压(eV) 碰撞能(eV)
3-MeA 150.0 123.0* 40 100 30
150.0 108.0 40 100 30
d3-3-MeA 153.1 126.1 40 100 30
3-EtA 164.2 136.1* 40 85 26
164.2 119.1 40 85 26
d5-3-EtA 168.9 137.1 40 120 26
3-HOEtA 180.2 136.1* 40 100 25
180.2 119.1 40 100 25

[0025] * 定量离子对．

[0026] （2）3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)含量的测定

[0027] 吸取配制好的不同浓度的3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)标准工作溶液3 µL，注入LC-ESI-MS/MS。得到3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)的线性回归方程。同样的方法检测实际样本，求得实际样本中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；
3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)的含量。

[0028] （3）本发明方法的线性范围和检出限：

[0029] 用乙腈配制系列标准曲线，3-甲基腺嘌呤(3-MeA)的标准曲线的点为10，20，40，60，100，120，150和180 ng/mL，线性相关系数为0.9993，3-乙基腺嘌呤标准曲线的点为
0.1，0.2，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5和5 ng/mL，3-乙基腺嘌呤的线性相关系数为0.9999，
3-羟乙基腺嘌呤标准曲线的点为0.1，0.2，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5 ng/mL，线性相关系数为0.9995。利用加标稀释得到方法的定量限和检出限，目标峰十倍信噪比对应的浓度为定量限，三倍信噪比对应的浓度为检出限，3-甲基腺嘌呤(3-MeA)，3-乙基腺嘌呤（3-EtA）,3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）的检出限分别为0.04 ng/mL，0.019 ng/mL，0.023 ng/mL。。

[0030] （4）本发明方法加标回收率和稳定性：

[0031] 采取样品加标的方法获得方法的加标回收率，总共选取了三个添加水平，每个添加水平重复测定5次，得到的方法的回收率和稳定性，结果见表2，表3。方法的回收率范围83.3-110.0%，日内/日间稳定性均低于10%,证明方法的准确性和稳定性结果较好。

[0032] 表2 尿液中3-烷化腺嘌呤回收率（n = 5）

[0033]

[0034] 表3 日间/日内稳定性

[0035]

[0036] 本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)的色谱条件进行了优化，并对LC -MS/MS的相关检测条件进行了优化。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

[0037] ①与传统的液相色谱方法比较，由于选取了串联质谱，使得方法的选择性和灵敏度提高，更有利于低含量的尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)的测定。

[0038] ②本方法具有操作简便、快速、可靠及稳定性好的优点。

[0039] ③本发明采用氘代标准品作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。

附图说明

[0040] 图1尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)的总离子流图。

[0041] 图2、吸烟者尿液中3-甲基腺嘌呤含量水平（●温和离群值，★离群值）。

[0042] 图3、吸烟者尿液中3-乙基腺嘌呤含量水平（●温和离群值，★离群值）。

[0043] 图4、吸烟者尿液中3-羟乙基腺嘌呤含量水平（●温和离群值，★离群值）。

具体实施方式

[0044] 本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。

[0045] 一种液相色谱串联质谱方法在大规模吸烟人群样本生物监测（3-甲基腺嘌呤，3-MeA；3-乙基腺嘌呤，3-EtA；3-羟乙基腺嘌呤，3-HOEtA）应用，其测试过程是24小时尿液在室温下解冻，混合均匀离心过滤，通过C18固相萃取小柱净化富集，混匀后引入LC-MS/MS系统分析。

[0046] 实例1：

[0047] 1.仪器与试剂：

[0048] 安捷伦1200 液相色谱（美国安捷伦公司），配有G1367D 自动进样器，G 1312B 二元混合泵和G1316B 柱温箱；API 5500三重四级杆串联质谱仪（美国应用生物系统公司），配有电喷雾离子源（ESI）和Analyst 1.5软件数据处理系统。

[0049] 氨水为分析纯；甲酸铵、乙酸乙酯、甲醇均为色谱纯（美国TEDIA公司）；Oasis MCX 固相萃取柱（6 mL，美国Waters公司）。

[0050] 3-甲基腺嘌呤，3-乙基腺嘌呤，3-羟乙基腺嘌呤购自加拿大TRC公司，氘代-3-甲基腺嘌呤，氘代-3-乙基腺嘌呤内标购自美国CIL实验室。

[0051] 2．志愿者招募/样品采集

[0052] 召集261（193个吸烟者，58个非吸烟者）名健康志愿者，对志愿者进行体检，并签订知情同意书。全部试验在郑州大学伦理学委员会监督下进行。志愿者采用限制性抽吸模式，每名吸烟者每天固定抽吸指定品牌卷烟15支，搜集志愿者24小时排泄的全部尿液，存储于-80℃冰箱中。

[0053] 3．样品处理：

[0054] 尿液在室温状态下解冻并混合均匀，取4 mL尿液，加入4mL超纯水，加入100 μL内标（100ng/mL），用水浴锅调节温度到80℃。取超纯水稀释后的尿液置于10 mL固相萃取柱中。固相萃取选取Waters Oasis MCX（6 mL, 500 mg）小柱，预先用2 mL的甲醇，5 mL的水活化柱子，上样量为8 mL，用2 mL的10%的甲醇淋洗，然后1 mL乙酸乙酯溶液淋洗，然后用1 mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水（47.5: 47.5: 5）洗脱，收集洗脱液并于60 ℃下用氮气吹至干，然后用100 μL水溶液溶解，供LC-MS/MS分离分析。

[0055] 4．测定方法：吸取3-甲基腺嘌呤10，20，40，60，100，120，150和180 ng/mL，3-乙基腺嘌呤0.1，0.2，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5 和5 ng/mL，3-羟乙基腺嘌呤0.1，0.2，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5 ng/mL三种化合物的标准溶液和净化后的样品各3 µL，注入LC-MS/MS系统进行分离分析，测得样本中3-甲基腺嘌呤，3-MeA；3-乙基腺嘌呤，3-EtA；3-羟乙基腺嘌呤，3-HOEtA的含量。

[0056] 5. 使用Excel和SPSS软件对261个尿液样品进行分析。

[0057] 实例1：如实施例1所述，利用本研究建立的方法对261个尿液中的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)含量进行了检测,尿液中3-甲基腺嘌呤，3-MeA；3-乙基腺嘌呤，3-EtA；3-羟乙基腺嘌呤，3-HOEtA的含量见图2，3，4。由图2，3，4可知，吸烟者尿液中3-甲基腺嘌呤，3-乙基腺嘌呤，3-羟乙基腺嘌呤明显高于非吸烟者。本专利建立了一种使用固相萃取结合同位素内标技术同时分析3种烷基化DNA加合物的LC-MSMS方法，并应用所建立的方法分析了58名非吸烟者和193个限制性抽吸志愿者的24小时尿液中烷基化腺嘌呤的含量。研究表明，吸烟者体内的3-甲基腺嘌呤，3-乙基腺嘌呤，3-羟乙基腺嘌呤显著高于非吸烟者。我们认为在烟气烷基化试剂，以及致癌物的暴露的生物监测中尿液中3-甲基腺嘌呤，3-乙基腺嘌呤和3-羟乙基腺嘌呤都是有用的生物标志物。