赛葵总黄酮提取物及其制备方法和用途

摘要

本发明提供了赛葵总黄酮提取物，总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于1%。本发明还提供了该提取物的制备方法和用途。本发明赛葵总黄酮提取物质量稳定，可控，提取工艺简便可行，不污染环境，适合大规模提取。赛葵总黄酮提取物用于治疗前列腺疾病，尤其是治疗前列腺增生、前列腺炎或前列腺癌以及非细菌性前列腺炎，药效明确，安全，为临床提供了一种新的用药选择。

权利要求

1.赛葵总黄酮提取物在制备治疗前列腺增生的药物中的用途，其中，所述的赛葵总黄酮提取物中总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于20％。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的赛葵总黄酮提取物中总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于55％，以杨梅素重量百分含量计不少于50％。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的赛葵总黄酮提取物是由水或有机溶剂提取制备而成。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的有机溶剂是70％以上的乙醇。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的用途，其特征在于：所述赛葵总黄酮提取物的制备方法包括以下步骤：a、称取赛葵，加水或有机溶剂浸泡；

b、采用水浴加热回流提取、索氏提取、超声提取、微波提取、超临界CO2萃取、浸渍或渗漉提取方法；残渣用相应溶剂洗涤，合并滤液，过滤，即得赛葵总黄酮提取物。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的有机溶剂为70％以上的乙醇。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：还包括步骤c：纯化，具体纯化方法如下：①用乙醇浸泡生药量的AB-8型大孔树脂后，上柱进行预处理，用体积分数95％乙醇流动清洗，至流出的乙醇液至乙醇液与水1：5混合不呈白色混浊为止，然后以蒸馏水冲洗至水洗液无醇味；

②取b步骤的赛葵提取液上样，先用4倍柱体积的水洗脱，弃去洗脱液；继用4倍柱体积

10％的乙醇洗脱，弃去洗脱液；然后用8倍40％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至干，即得赛葵总黄酮。

说明书

赛葵总黄酮提取物及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及赛葵提取物，属药物领域。

背景技术

[0002] 赛葵Malvastrum coromandelianum(L.)Garcke为锦葵科亚灌木植物，别名黄花草或黄花棉。为多年生锦葵目草本，原产于美洲，现以广布于全球的热带区域。我国主要分布于台湾、福建、广东、香港、海南、广西、云南。赛葵以全草入药,性苦、淡，凉。具有清热利湿，解毒散瘀之功效。主治湿热泻痢、黄疸、肺热咳嗽、咽喉肿痛、痔疮、痈肿疮毒、跌打损伤、前列腺炎。民间常用来治疗黄疸型肝炎,药理实验有报道证明赛葵具有解热镇痛抗炎作用（田辉，等，赛葵的生药学研究，中药材第29卷第8期2006年8月）。

[0003] 目前针对赛葵中的活性成分或有效部位尚无相关文献报道。

发明内容

[0004] 本发明的技术方案是提供了一种赛葵提取物。本发明的另一技术方案是提供了该提取物的制备方法和用途。

[0005] 本发明提供了一种赛葵总黄酮提取物，总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于1%。进一步的，总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于3%；进一步优选地，总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于20%；更进一步优选地，总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于
55%，以杨梅素含量计不少于50%。

[0006] 它是由水或有机溶剂提取制备而成。

[0007] 进一步优选地，所述的有机溶剂是浓度为70%以上的乙醇。

[0008] 本发明赛葵总黄酮提取物是由由水或有机溶剂，采用回流提取、索氏提取、超声提取、微波提取、超临界CO2萃取、浸渍或渗漉提取方法制备而成。

[0009] 本发明还提供了一种制备所述的赛葵总黄酮提取物的方法，它包括如下步骤：

[0010] a、称取赛葵，加水或有机溶剂浸泡；

[0011] b、采用水浴加热回流提取、索氏提取、超声提取、微波提取、超临界CO2萃取、浸渍或渗漉提取方法；残渣用相应溶剂洗涤，合同滤液，过滤，即得本发明赛葵总黄酮提取物。

[0012] 其中，所述的有机溶剂为70%以上的乙醇。

[0013] 其中，还包括步骤c：纯化，具体纯化方法如下：

[0014] ①用乙醇浸泡生药量的AB-8型大孔树脂后，上柱进行预处理，用体积分数95％乙醇流动清洗，至流出的乙醇液至乙醇液与水1：5混合不呈白色混浊为止，然后以蒸馏水冲洗至水洗液无醇味；

[0015] ②取b步骤的赛葵提取液上样，先用4倍柱体积的水洗脱，弃去洗脱液；继用4倍柱体积10%的乙醇洗脱，弃去洗脱液；然后用8倍40%的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至干，即得赛葵总黄酮；总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于55%，以杨梅素含量计不少于50%。

[0016] 本发明还提供了所述的赛葵总黄酮提取物在制备治疗前列腺疾病的药物中的用途。

[0017] 其中，所述的药物是治疗前列腺增生、前列腺炎或前列腺癌的药物。

[0018] 本发明还提供了所述的药物是治疗非细菌性前列腺炎的药物。

[0019] 本发明赛葵总黄酮提取物质量稳定，可控，提取工艺简便可行，不污染环境，适合大规模提取。赛葵总黄酮提取物用于治疗前列腺疾病，尤其是治疗前列腺增生、前列腺炎或前列腺癌以及非细菌性前列腺炎，药效明确，安全，为临床提供了一种新的用药选择。

附图说明

[0020] 图1各组大鼠前列腺组织的病理变化

[0021] 图2各组大鼠前列腺组织病理变化

具体实施方式

[0022] 实施例1赛葵提取物的制备（回流提取法）

[0023] 称取赛葵20g，分别加入200ml的70%乙醇浸泡30min后，在水浴上加热回流提取2次.每次1h，趁热过滤，残渣洗涤2～3次，合并滤液回收至无醇味，加水溶解至每1mL含0.5g生药，离心(4000r／min)15min，过滤，备用。取1.0mL取置于25mL量瓶中，加水6.0mL；加入5％(质量分数)亚硝酸钠溶液1.0mL，使混匀，放置6min；加入10％(质量分数)硝酸铝1.0mL，摇匀，放置6min；再加入4％(质量分数)NaOH溶液l0.0mL，加水至刻度，摇匀，放置15min；照分光光度法(中国药典2010版一部附录VB)于500nm的波长处测定吸光度A。样品溶液中总黄酮的提取率(总黄酮提取率=总黄酮质量／赛葵质量×100％)。赛葵总提取物质量约为3.0g,总黄酮的含量以芦丁计为0.526g,占总提取物的17.5%，总黄酮提取率为2.63％。

[0024] 实施例2赛葵提取物的制备（索氏提取法）

[0025] 称取赛葵5g，分别加入50ml的70%乙醇浸泡30min后,将温度控制在85℃,提取4h,趁热抽滤。残渣用相应溶剂洗涤2～3次，合并滤液回收至无醇味，加水溶解至每1mL含0.5g生药，离心(4000r/min)15min，过滤，备用。按上述分光光度法测定总黄酮，此法提取得到的赛葵总提取物质量约为0.9g，总黄酮的含量以芦丁计为0.140g,占总提取物16%，总黄酮提取率为2.79％。

[0026] 实施例3赛葵提取物的制备（超声提取法）

[0027] 称取赛葵20g，分别加入200ml的70%乙醇浸泡30min后，超声（300W）提取2次，每次30min，趁热抽滤。残渣用相应溶剂洗涤2～3次，合并滤液回收至无醇味，加水溶解至每1mL含0.5g生药，离心(4000r／min)15min，过滤，备用。按上述分光光度法测定总黄酮，此法提取得到的赛葵总提取物质量约为3.5g，总黄酮的含量以芦丁计为0.716g,占总提取物20%，总黄酮提取率为3.58％。

[0028] 实施例4赛葵提取物的制备（微波提取法）

[0029] 称取赛葵5g，分别加入200ml的70%乙醇浸泡30min后，微波（400W）提取5min，趁热抽滤，残渣用相应溶剂洗涤2～3次，合并滤液回收至无醇味，加水溶解至每1mL含0.5g生药，离心(4000r/min)15min，过滤，备用。按上述分光光度法测定总黄酮，此法提取得到的赛葵总提取物质量约为2.0g，总黄酮的含量以芦丁计为0.149g,占总提取物7%，总黄酮提取率为2.97％。

[0030] 实施例5赛葵提取物的制备（超临界CO2萃取法）

[0031] 称取赛葵5g，装入萃取釜中，在以1mL/g的无水乙醇为夹带剂,萃取温度60℃,萃取压力35MPa,萃取时间1h,CO2流量30kg/h-1的CO2超临界萃取系统中萃取,收集萃取液,回收至无醇味，加水溶解至每1mL含0.5g生药，离心(4000r／min)15min，过滤，备用。按上述分光光度法测定总黄酮，此法提取得到的赛葵总提取物质量约为2.0g，总黄酮的含量以芦丁计为0.099g,占总提取物5%，总黄酮提取率为1.97％。

[0032] 实施例6赛葵提取物的制备（浸渍法）

[0033] 称取赛葵5g,于70%乙醇、料液比1∶20、浸渍6h、室温条件下浸渍提取,抽滤，残渣用相应溶剂洗涤2～3次，合并滤液回收至无醇味，加水溶解至每1mL含0.5g生药，离心(4000r／min)15min，过滤，备用。按上述分光光度法测定总黄酮，此法提取得到的赛葵总提取物质量约为2.0g，总黄酮的含量以芦丁计为0.066g,占总提取物3%，总黄酮提取率为1.31％。

[0034] 实施例7赛葵提取物的制备（渗漉提取法）

[0035] 称取赛葵20g,用80%乙醇润湿后装入渗漉柱中,加溶剂浸泡24h后开始渗漉，控制流速3mL/min，收集渗漉液，回收至无醇味，加水溶解至每1mL含0.5g生药，离心(4000r／min)15min，过滤，备用。按上述分光光度法测定总黄酮，此法提取得到的赛葵总提取物质量约为
2.5g，总黄酮的含量以芦丁计为0.414g,占总提取物17%，总黄酮提取率为2.07％。

[0036] 实施例8赛葵总黄酮的纯化

[0037] 用乙醇浸泡4倍生药量的AB-8型大孔树脂24h后，上柱进行预处理，用体积分数95％乙醇流动清洗，至流出的乙醇液至乙醇液与水1：5混合不呈白色混浊为止，然后以蒸馏水冲洗至水洗液无醇味。取赛葵提取液40mL(每1mL含0.5g生药,总黄酮含量不得少于1%)上样，先用4倍柱体积的水洗脱，弃去洗脱液；继用4倍柱体积10%的乙醇洗脱，弃去洗脱液；然后用8倍40%的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至干，即得总黄酮。纯化得到的总黄酮的提取率约为3％，从提取液中的转移率为84％。

[0038] 其中，实施例1-7中提取方法得到的都是粗黄酮，经过实施例8的纯化，得到本发明赛葵总黄酮，所述的赛葵总黄酮中总黄酮的百分含量，以芦丁计，不少于55%,以杨梅素计不得少于50%。

[0039] 具体含量测定方法及检测数据为：

[0040] 以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法测定赛葵总黄酮含量。即精密称取芦丁对照品23.0mg,置50mL量瓶中，加95%乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。精密吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分别置于25mL量瓶中，加水至6.0mL；加入5%亚硝酸钠溶液1.0mL，使混匀，放置6min；加入10%硝酸铝1.0mL，摇匀，放置6min；再加入4％氢氧化钠溶液10.0mL，加水至刻度，摇匀，放置15min；照分光光度法(中国药典2010版一部附录VB)于500nm的波长处测定吸光度A，计算得出回归方程。精密吸取样品溶液1.0mL置10mL量瓶中，再精密吸取溶液1.0mL，按以上方法，自“加水至6.0mL”起依法测定吸光度，代入回归方程计算出样品溶液中总黄酮的百分含量。（总黄酮的百分含量=总黄酮的含量/总提取物）[0041] 经三次实验，纯化得到赛葵总黄酮百分含量分别为58%、54%、61%，结果得赛葵总黄酮平均百分含量约为58%。

[0042] 以杨梅素为对照品，采用紫外分光光度法测定赛葵总黄酮含量。取杨梅素对照品14.18m g,置于25mL容量瓶中,加入甲醇溶解,定容于25mL,制得浓度为0.1592mg/mL的标准品储备液,精密量取杨梅素标准品储备液适量0、4、8、12、16、20μL,分别置于1mL容量瓶中。
分别加入5%氯化铝3mL,用甲醇定容于10mL,放置20min,随行试剂为空白,在270nm波长处测定吸光度,计算得出回归方程。精密吸取样品溶液1.0mL置10mL量瓶中，再精密吸取溶液
1.0mL，按以上方法，测定吸光度，代入回归方程计算出样品溶液中总黄酮的百分含量。（总黄酮的百分含量=总黄酮的含量/总提取物）

[0043] 经三次实验，纯化得到的赛葵总黄酮百分含量分别49%、53%、51%，结果得赛葵总黄酮平均百分含量为51%。

[0044] 以下通过具体药效学试验或体外实验证明本发明的有益效果。

[0045] 试验例1赛葵提取物对非细菌性前列腺炎的保护作用

[0046] 1材料

[0047] 1.1动物SD大鼠，清洁级，雄性，180～220g；KM小鼠，清洁级，雄性，体重18～22g，均由福建中医药大学实验动物中心提供。

[0048] 1.2药品与试剂赛葵提取物（实施例3制得）；舍尼通由南京美瑞制药有限公司生产，批号20070514；消痔灵注射液由北京双鹤高科天然药物有限责任公司生产，批号061212；角叉菜胶购自Sigma公司；速尿注射液(SN)购自常州康普药业有限公司，ELISA试剂盒均由Uscn Life Science Inc.公司提供。

[0049] 2方法

[0050] 2.1赛葵提取物对慢性非细菌性前列腺炎的保护作用将SD大鼠麻醉后剪除下腹部被毛，在无菌条件下腹部切口深入腹腔，暴露前列腺，以25%消痔灵注射液注射至2个前列腺侧叶，缝合腹壁。术后第7天将大鼠随机分成6组，即空白组，模型组，赛葵提取物低、中、高剂量组(8、4、2g·kg-1)，阳性药舍尼通组(60mg·kg-1)，每组10只，按体重连续灌胃给药30d，每天给药1次，空白组和模型组给予等量生理盐水。末次给药后处死大鼠，腹主动脉取血，离心，取血清，采用ELISA法检测大鼠血清IL-1β，IL-2及TNF-α的含量各组大鼠腹主动脉取血，2000×g离心10min，取血清。操作严格按照试剂盒说明书进行。剖取前列腺组织，肉眼观察前列腺病变状态并称湿重，计算前列腺指数；取前列腺按摩液10μL放入白细胞稀释液中，光学显微镜下观察，计数白细胞总数；另取一滴前列腺液涂片，镜下观察卵磷脂小体密度，评分标准为:卵磷脂小体满视野(+++)为4分，1/2视野(++)为3分，1/4视野(+)为2分，低倍镜下仅见数个为1分。取另一侧前列腺侧叶，置于10%福尔马林溶液中固定，常规脱水透明，石蜡切片一部分HE染色，于光学显微镜下观察组织形态变化。

[0051] 2.2角叉菜胶致大鼠急性前列腺炎试验将SD大鼠(350～400g)随机分成6组，即空白组、模型组、赛葵提取物低剂量组(2g/kg)、赛葵提取物中剂量组(4g/kg)、赛葵提取物高剂量组(8g/kg)、阳性药舍尼通组(60mg/kg)，每组10只。按体重预先连续灌胃给药7d，每天给药一次，空白组和模型组给予等量生理盐水。第6天给药后30min，将大鼠麻醉，下腹部正中切口，暴露前列腺,在前列腺侧叶上的精液囊注入0.1%无菌角叉菜胶生理盐水溶液,然后缝合腹壁。24h后称重，处死大鼠,剖取前列腺称湿重，计算前列腺指数；取前列腺按摩液10μL放入白细胞稀释液中，光学显微镜下观察，计数白细胞总数(WBC)；另取一滴前列腺液涂片，镜下观察卵磷脂小体密度，评分标准为：卵磷脂小体满视野(+++)为4分，1/2视野(++)为3分，1/4视野(+)为2分，低倍镜下仅见数个为1分。

[0052] 2.3二甲苯致小鼠耳肿胀试验将KM小鼠随机分为6组，即空白组、模型组、赛葵提取物低剂量组(2g/kg)、赛葵提取物中剂量组(4g/kg)、赛葵提取物高剂量组(8g/kg)、阳性药舍尼通组(60mg/kg)，每组10只。每鼠左耳两面涂致炎液0.05mL，右耳作空白对照。分别灌胃给药7d，每天给药一次，空白组和模型组给予等量生理盐水。最后一天给药0.5h后处死小鼠，分别在同一部位打孔，分析天平称重，计算肿胀率。

[0053] 2.4小鼠棉球肉芽肿试验将KM小鼠随机分为6组，即空白组、模型组、赛葵提取物低剂量组(2g/kg)、赛葵提取物中剂量组(4g/kg)、赛葵提取物高剂量组(8g/kg)、阳性药舍尼通组(60mg/kg)，每组10只。除空白组外，小鼠腋窝皮下手术植入灭菌棉球(10.0±0.5)mg。连续灌胃给药7d，每天给药一次，空白组和模型组给予等量生理盐水。7d后称重，处死小鼠。
剥离肉芽组织，于60℃烘箱中烘干，称重，计算肉芽肿重量。

[0054] 2.5对雌性小鼠热板致痛的影响取体重20±2g的雌性小鼠，按热板法于试验前在热板测痛仪上测定痛阈值在5s-30s内的小鼠60只，按体重随机分为6组，即空白组、模型组、赛葵提取物低剂量组(2g/kg)、赛葵提取物中剂量组(4g/kg)、赛葵提取物高剂量组(8g/kg)、阳性药舍尼通组(60mg/kg)，每组10只。以出现舔后足反应为观察指标。分别于每鼠灌胃以上药物，0.2mL/只。0.5h后按上法测定痛阈值，然后按前法给药，测定1h、1.5h、2h的痛阈值。比较给药前后痛阈的变化，并按(用药后-用药前平均痛阈值)/用药前平均痛阈值×100％计算痛阈提高百分率。

[0055] 2.6水负荷大鼠排尿量试验将健康SD雄性大鼠(180～220g)预先放置于代谢笼中1～2d适应环境，选取自由饮水条件下尿量稳定的大鼠50只，随机分为正常对照组、阳性对照组(速尿注射液10mg/kg)和赛葵提取物低、中、高剂量组,每组10只。连续灌胃给药7d，最后一天给药前18h禁食不禁水，给药前各组按2mL/100g体重剂量腹腔注射生理盐水，然后灌胃给药，对照组给予等量蒸馏水。给药后立即将大鼠放入代谢笼中，每笼一只，1、2，4h后分别测量各组动物的尿量。

[0056] 2.7统计学处理采用SPSS统计软件进行统计学处理。数据以 表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

[0057] 3结果

[0058] 3.1赛葵提取物对消痔灵诱导的慢性非细菌性前列腺炎的影响肉眼所见前列腺组织外观:空白组大鼠前列腺组织呈粉红色，质软、有光泽，与周围组织无粘连；模型组大鼠前列腺腺体呈暗红色或棕黄色，普遍与周围组织粘连，质硬，有明显的硬结，并有水肿；舍尼通组大鼠前列腺腺体与周围组织粘连较轻，部分腺体质硬，有结节，色棕黄；赛葵提取物8、4g·kg-1剂量组前列腺腺体与周围组织粘连轻，硬结小，部分腺体呈棕黄色，有轻度水肿，个别腺体柔软、红润、有光泽，外观与正常前列腺组织相似。

[0059] 赛葵提取物的抗炎作用:模型组与空白组比较，前列腺液中WBC数增加、卵磷脂小体密度减少，呈现慢性前列腺炎的病理变化，表明造模成功。赛葵提取物8g·kg-1剂量组与模型组比较，WBC数减少、卵磷脂小体密度增加，表明该药对消痔灵诱导的慢性前列腺炎有一定的抗炎作用，见表1。

[0060] 表1赛葵提取物对消痔灵诱导的大鼠慢性非细菌性前列腺炎的影响

[0061]

[0062] 注:与空白组比较1)P<0.01；与模型组比较2)P<0.05，3)P<0.01。

[0063] 前列腺组织的病理变化:空白组大鼠前列腺大部分腺腔较大，腔内有大量粉染分泌物，间质无炎症，未见明显纤维增生；模型组大鼠腺腔减小，腔内分泌物减少，间质可见大量炎症细胞浸润，纤维组织增生明显；舍尼通组大鼠大部分前列腺腺腔较大，腔内有大量粉染分泌物，个别动物分泌物减少，间质无炎症，未见明显纤维组织增生；赛葵提取物各剂量组大鼠大部分前列腺腺腔较大，腺腔内有大量粉染分泌物，间质炎症明显减轻，未见明显纤维组织增生；个别动物腺腔缩小，部分炎症细胞浸润，可见纤维组织轻度增生，见图1。

[0064] 赛葵提取物对前列腺炎大鼠血清IL-1β、TNF-α及IL-2的影响：赛葵提取物对慢性前列腺炎大鼠血清中的IL-1β及TNF-α有明显的抑制作用，150mg·kg-1时对IL-1β和TNF-α的生成抑制率分别为43.88%，47.49%；同时能明显提高血清中IL-2的水平，150mg·kg-1时对IL-2的生成增加率为31.19%，与模型组比较差别具有统计学意义，见表2。

[0065] 表2赛葵提取物对前列腺炎大鼠血清IL-1β，TNF-α及IL-2的影响

[0066]

[0067] 注:与空白组比较1)P<0.01；与模型组比较2)P<0.05，3)P<0.01。

[0068] 3.2赛葵提取物对角叉菜胶致大鼠急性前列腺炎的影响赛葵提取物高剂量组与模型组比较,光学显微镜下见腺腔内炎症细胞浸润程度明显减轻,前列腺液中卵磷脂小体密度明显增加,提示赛葵提取物具有良好的控制前列腺急性炎症的作用(表3)。

[0069] 表3赛葵提取物对角叉菜胶诱导的大鼠急性前列腺炎的影响

[0070]

[0071] 注:与空白组比较*P<0.05；与模型组比较#P<0.05，##P<0.01。

[0072] 3.3赛葵提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀及小鼠棉球肉芽肿的影响赛葵提取物高剂量与空白组比较,对二甲苯导致的炎症有明显的抑制作用；赛葵提取物高剂量与模型组比较,对肉芽肿的形成具有显著的抑制作用(表4)。

[0073] 表4赛葵提取物对二甲苯致耳肿胀及棉球肉芽肿的影响

[0074]

[0075] 注:与空白组比较*P<0.05；与模型组比较#P<0.05。

[0076] 3.4赛葵提取物的镇痛作用赛葵提取物高剂量与空白组比较,对热刺激致痛试验中的小鼠痛阈有明显的提高作用(表5)。

[0077] 表5赛葵提取物对热刺激的影响

[0078]

[0079] 注:与空白组比较*P<0.01；与模型组比较#P<0.05。

[0080] 3.5赛葵提取物对水负荷大鼠尿量的影响赛葵提取物能明显增加水负荷大鼠4个时间段的尿量,与空白组比较差别具有统计学意义,提示赛葵提取物对水负荷大鼠有显著的利尿作用(表6)。

[0081] 表6赛葵提取物对热刺激的影响

[0082]

[0083] 注:与空白组比较*P<0.05,**P<0.01。

[0084] 试验例2赛葵提取物治疗非细菌性前列腺炎的临床观察

[0085] 一、临床资料

[0086] 1.一般资料：120例患者均来自门诊，随机分为治疗组和对照组各60例。其中治疗组平均年龄(34.73±8.14)岁，病程(2.18±1.61)年，症状评分(20.05±4.60)分，体征评分(4.27±1.54)分；对照组平均年龄(36.71±11.34)岁，病程(2.20±1.52)年，症状评分(19.75±3.98)分，体征评分(4.22±1.44)分。经检验，两组在年龄、病程和病情比较上均无明显差异(各项P>0.05)，具有可比性。并排除前列腺增生、前列腺癌，就诊前一月内未接受过其他药物治疗。

[0087] 2.诊断标准：参照美国国立卫生研究院(NIH)前列腺炎分类定义和《泌尿外科》制定。患者前列腺液(EPS)白细胞数>10个/HP，均有不同程度下腰、少腹、会阴、龟头等部位的疼痛，尿频、尿不尽感，神疲腰酸，阳痿早泄，以及前列腺硬结硬化等改变，前列腺液细菌培养(Meares-Stamey法)阴性，支原体、衣原体培养阴性。中医诊断及排除标准参照中华人民共和国卫生部制定的《中药新药临床研究指导原则》。

[0088] 二、治疗方法

[0089] 1.药物

[0090] 治疗组用赛葵，水煎服（水煎约2h，水提取物中总黄酮含量以芦丁计平均为41%）。对照组口服舍尼通片(Prostat，瑞典PHARMACIA ALLERGON AB生产)，每日2次，每次1片。两组均以1个月为1疗程，连续治疗2个疗程后进行疗效评价。

[0091] 2.观察项目

[0092] (1)症状评分：参照NIH-CPSI(美国国立卫生研究院慢性前列腺炎症状评分)标准设定。分疼痛指数、排尿指数、生活质量指数三方面共9项指标分别记分，疼痛指数0～21分，排尿指数0～10分，生活质量指数0～12分，共计43分，总积分越高病情越重。

[0093] (2)体征评分：参照《中药新药临床研究指导原则》记录EPS、直肠指检和B超检查结果，根据程度不同以轻、中、重(1～3分)表示，正常为0分。(见表7)

[0094]

[0095] (3)不良反应：通过检查血常规、肝肾功能，观察用药后不良反应和药物的毒副作用。

[0096] 3.统计学方法

[0097] 根据资料的具体情况，分别采用t检验、秩和检验。

[0098] 三、治疗结果

[0099] 1.疗效评定标准

[0100] 参考《中药新药临床研究指导原则》制定。痊愈:治疗后总分(症状评分+体征评分)为0；显效:治疗后总分下降≥70%；有效:治疗后总分值下降在30%～69%之间；无效:治疗后总分值下降<30%。

[0101] 2.临床总有效率比较

[0102] 治疗组痊愈14例，显效25例，有效16例，无效5例，总有效率91.7%；对照组痊愈6例，显效19例，有效22例，无效13例，总有效率78.3%。Ridit分析显示，两组总疗效比较P<0.01，治疗组疗效优于对照组。

[0103] 3.两组治疗前后症状评分比较

[0104] 赛葵水煎剂在疼痛指数、排尿指数、生活质量指数和总分等各项指标治疗后均有明显下降，和对照组比，下降程度有显著差异。

[0105] 赛葵组和舍尼通组NIH-CPSI评分变化

[0106]

[0107] 注:治疗前后自身比较，*P<0.01；与对照组治疗后比较，ΔP<0.01。

[0108] 4.两组治疗前后体征积分比较

[0109] 结果显示，赛葵组治疗后各项积分均有明显下降；和对照组比，在B超积分和总分上有显著差异。

[0110] 赛葵组和舍尼通组体征积分变化

[0111]

[0112] 注:治疗前后自身比较，*P<0.01；与对照组治疗后比较，ΔP<0.01。

[0113] 5.毒副反应

[0114] 两组观察均无严重不良反应。

[0115] 试验例3赛葵提取物对大鼠前列腺增生的影响

[0116] 1材料与方法

[0117] 1.1动物：清洁级雄性SD大鼠60只，体重210～230g，上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK2007－0005。

[0118] 1.2药物：50mg／m1丙酸睾酮注射液（上海第九制药厂，批号：991203）；保列治5mg（杭州默沙东制药公司，批号：BH20020304）；赛葵提取物（实施例3制得），分别配制成50mg／ml、100mg／ml、200mg／ml3个浓度；睾酮、雌二醇放射免疫分析药盒（北京北方生物技术研究所，批号：S10940093）。

[0119] 1.3仪器：电子分析天平（上海天平仪器厂）；双目光学显微镜（日本Olympus公司）。

[0120] 1.4实验分组及处理

[0121] 1.4.1前列腺增生大鼠动物模型的制备：雄性SD大鼠60只，戊巴比妥钠40mg／kg腹腔注射麻醉，经阴囊行无菌手术，摘除双侧睾丸，恢复1周后，每只皮下注射丙酸睾酮4mg／kg，连续30d，每周称体重1次。

[0122] 1.4.2给药与处理：造模前适应性饲养1周，按随机数字表分为6组，即正常组、模型组、保列治组、赛葵提取物低、中、高剂量治疗组，每组10只。正常组皮下注射生理盐水，其余5组皮下注射丙酸睾丸酮。正常组和模型组给10ml／kg生理盐水；保列治组给药量为0.8mg／kg溶于10ml／kg生理盐水，以上均采用灌胃给药，每日1次，连续30d。末次灌胃后次日，眼球采血处死，剥离前列腺周围组织，电子分析天平称前列腺湿重，取出前列腺腹叶组织，剪取相同重量，10％福尔马林固定。

[0123] 1.5观察指标及检测方法

[0124] 1.5.1观测指标：以分析天平测量前列腺组织湿重；容积法测量体积；计算前列腺指数（PI）。PI=前列腺湿重／体重，大鼠体重增加值=处死前大鼠体重-造模前体重。

[0125] 1.5.2前列腺组织病理变化：取前列腺腹叶相同部位前列腺组织，10％福尔马林固定，常规苏木素伊红（HE）染色，光镜下观察前列腺组织切片的病理形态学改变。

[0126] 1.5.3生化检查：给药结束时，眼球采血，按试剂盒说明书的步骤检测大鼠血清睾酮、雌二醇水平。

[0127] 1.6统计学处理：数据用x±s表示，采用t检验，用SPSS16.0统计软件处理数据[0128] 2结果

[0129] 2.1实验结果：见表8、表9。

[0130] 表86组大鼠增加体重、前列腺湿重、体积、指数和体积指数的比较

[0131]

[0132] 注：与正常组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与模型组比较，##P＜0.01，#P＜0.05[0133] 表96组大鼠血清T、E2含量的比较（x±s）

[0134]

[0135] 注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

[0136] 2.2病理检查：正常组腺体排列清楚，腺腔无扩张，腺上皮呈单层柱状。模型组腺体排列密集，腺腔变大，部分腺体扩张，腺上皮明显增生，部分区域层次增加，排列紊乱，多数腺上皮呈乳头状突向腔内，间质纤维组织及平滑肌组织增多。前列宁低剂量组见腺腔明显减少，管腔细胞多为单层柱状排列，细胞皱缩，间质少而疏松。赛葵提取物中、高剂量组与保列治组管腔细胞单复层均有出现，上皮细胞多呈高柱状或立方状，乳头状结构明显减少。见图2。

[0137] 试验例4赛葵提取物对治疗良性前列腺增生症的临床研究

[0138] 1资料与方法

[0139] 1.1病例来源

[0140] 病人均为福建中医药大学男科门诊就诊患者，经询问病史、直肠指检、B超检查、尿流率测定等检查确诊为良胜前列腺增生症(BPH)。共80例，随机分为两组，治疗组与对照组各40例。

[0141] 1.2诊断标准与病例入选标准

[0142] 1.2.1纳入标准

[0143] 西医诊断标准参照2006年中华医学会泌尿外科学会颁布的《良性前列腺增生诊断治疗指南》。中医诊断及辨证标准参考我国《中药新药临床研究指导原则)}(1997)中“中药新药治疗良胜前列腺增生症临床指导原则”制定的标准，本研究所选病例为肾虚血癖证。凡符合本病诊断及中医辨证标准，年龄50～80岁男性者；停止相关用药1个月以上，可纳入试验病例。

[0144] 1.2.2排除标准

[0145] (1)尿道结石，前列腺癌，急慢性肾功能不全，肾功（Cr）异常者。(2)神经源性膀胱，膀胱新生物，膀胱颈纤维化，尿道狭窄引起的排尿困难者。(3)合并造血系统严重原发疾病，肝功能（ALT）超过正常值1倍以上者，精神病患者；有出血倾向者。(4)过敏体质者(5)有盆腔手术或损伤者。(6)不符合纳入标准，未按规定用药，无法判断疗效，或资料不全等影响疗效或安全性判断者。

[0146] 1.2.4剔除，脱落和终止实验的标准

[0147] (1)剔除：不应入组但已入组的受试者应予剔除，包括：误纳、误诊、一次药未用、无任何检测记录者。剔除的病例应说明原因，不作疗效统计分析，但至少接受一次治疗，且有至少一次安全记录者，可参加不良反应分析。(2)脱落:已入组但未完成临床方案的病例，在下列情况应视为脱落，包括病人自行退出、失访、依从性差、夹杂症由医师令其退出脱落的病例应说明原因，如有基线药效数据，可将其最后一次的主要疗效指标结果转接为最终结果进行统计分析。

[0148] 1.3药物、给药方法、治疗时间

[0149] （1）治疗组用药：赛葵（实施例3制得）；

[0150] （2）对照组用药：癃闭舒（由石家庄市科迪药业有限公司生产），用法：每次3粒，每日2次。药物组成：补骨脂、山慈菇、海金沙、金钱草、琥珀、益母草等组成。疗程1个月为1个疗程，两组均治疗1个疗程。

[0151] 1.4观测指标

[0152] （1）国际前列腺症状评分（IPSS）、排尿症状对生活质量的影响（QOL）；（2）中医症状包括夜尿频数、排尿困难、腰膝酸软、小腹胀满等状况。（3）最大尿流率（MFR）检测（4）残余尿量（5）前列腺体积

[0153] 1.5统计方法

[0154] 采用SPSS11.5统计学软件进行数据分析，计量资料采用t检验或F检验，计数资料采用x2检验。

[0155] 2结果

[0156] 本阶段实验纳入的60例均为有效病例，无脱落或剔除。最后显效病例43例，其中治疗组23例，对照组20例。满足病例对照研究中的质量控制要求。在60例患者中，治疗组年龄最小63岁，最大76岁，平均（66.54±5.43）岁；对照组年龄最小52岁，最大80岁，平均（67.49±4.65）岁。经检验，P>0.05。说明两组在年龄分布上无显著性差异。具有可比性。

[0157] 2.1总疗效评定

[0158] 表10两组总疗效比较

[0159]

[0160] 从上表可以看出，治疗组有效率为76.7%；对照组有效率为66.7%。经Ridit分析，P<0.05，表明赛葵临床疗效优于癃闭舒。

[0161] 2.2IPSS评分及QOL评分治疗前后变化

[0162] 表11治疗前后IPSS评分及QOL评分变化

[0163]

[0164] 注:*p<0.05，治疗前vs治疗后;#p<0.05，治疗组vs对照组。

[0165] 经t检验：IPSS和QOL在治疗前与对照组对比无统计学意义(P>0.05)。治疗后，在治疗组和对照组之间，SPSS相比有统计学意义(P<0.05);QOL则无统计学意义(P>0.05)。说明赛葵对于改善患者国际前列腺症状评分的影响优于癃闭舒，但不能说明赛葵对于改善患者排尿症状对生活质量的评分的影响优于癃闭舒。

[0166] 2.3中医症状改善情况

[0167]

[0168] 注:与疗前比:**P<0.01;与对照比:△P<0.05。

[0169] 治疗组和对照组治疗后,夜尿频数、排尿困难、腰膝酸软、小腹胀满等症状均有显著改善(P<0.01);治疗组与对照组比较,改善腰膝酸软,治疗组优于对照组(P<0.05),而改善夜尿频数、排尿困难、小腹胀满,两组无明显差异(P>0.05)。

[0170] 2.4最大尿流率治疗前后比较

[0171] 表12治疗前后最大尿流率比较

[0172]

[0173] 注:*p<0.05，治疗前vs治疗后;#p<0.05，治疗组vs对照组。

[0174] 经t检验:两组患者的最大尿流率在治疗前无显著差异(p>0.05)。两组治疗前后比较，最大尿流率均显著提高，有统计学意义(p<0.05)，提示两种药物均可提高患者的最大尿流率。组间疗后最大尿流率差值比较有统计学差异(p<0.05)，提示赛葵在改善前列腺增生患者最大尿流率方面的效果优于瘾闭舒胶囊。

[0175] 2.5残余尿量的变化

[0176] 表13治疗前后残余尿量(mL)的变化

[0177]

[0178] 注:*p<0.05，治疗前vs治疗后;#p<0.05，治疗组vs对照组。

[0179] 经t检验:治疗前，两组残余尿量无显著差异(p>0.05)。两组治疗前后比较，残余尿量均有减少，有统计学意义(p<0.05)，提示两种药物均可降低患者的残余尿量。组间疗后残余尿量差值比较有统计学差异(p<0.05)，提示赛葵在减少残余尿量方面疗效优于瘾闭舒胶囊。

[0180] 2.6前列腺体积的变化

[0181] 表14治疗前后前列腺体积(cm3)的变化

[0182]

[0183] 注:*p<0.05，治疗前vs治疗后;#p<0.05，治疗组vs对照组。

[0184] 经t检验:治疗前后，两组前列腺体积比较均无显著差异(尸>0.05)。说明赛葵与瘾闭舒胶囊在试验期间均未能缩小BPH患者的前列腺体积。

[0185] 2.7安全性监测

[0186] 339例赛葵治疗组患者治疗前后,肝(GPT)、肾(Bun)、血、尿、心电图、血压、PSA检查,均无明显变化。

[0187] 试验例5赛葵提取物对前列腺癌细胞DU-145、PC-3细胞增殖的影响

[0188] 1材料与方法

[0189] 1.1材料

[0190] 1.1.1实验材料：

[0191] 赛葵提取物，分别配制成50mg／ml、100mg／ml、200mg／ml3个浓度）；细胞株：人前列腺癌DU-145和PC-3细胞株均购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库。

[0192] 1.1.2主要试剂：

[0193] HamF12培养基，Gibco公司；RPMI1640培养基，Gibco公司；胎牛血清（FBS)，杭州四季青生物制品有限公司；胰蛋白酶，美国SIGMA公司；青霉素、链霉素：山东鲁抗医药股份有限公司；氯仿等，国药集团化学试剂有限公司；

[0194] 1.2方法

[0195] 1.2.1赛葵提取物的制备

[0196] 称取赛葵20g，分别加入200ml的70%乙醇浸泡30min后，在水浴上加热回流提取2次.每次1h，趁热过滤，残渣用相应溶剂洗涤2～3次，合并滤液回收，干燥，备用。

[0197] 1.2.2细胞増殖抑制率的测定

[0198] 釆用MTT法进行检测。取对数生长期的前列腺癌细胞制成悬液，接种至96孔板，每孔200μL，于5%CO2，37℃贴壁4h，然后分别加入酶解多肽溶液，每个浓度设3个平行孔，同时设不加药对照组，置5%CO2，37℃培养箱中孵育，培养结束加入180μL MTT和20μL PBS继续培养4h，吸弃96孔板的液体，加入150μL的DMSO，充分混合。置酶联免疫检测仪在570nm测吸光度，计算细胞增殖抑制指数（IR)，按下列公式计算。

[0199] IR=[(对照组A值-药物组A值)/对照组A值]×100%

[0200] 1.2.3数据处理

[0201] 实验结果以表示 应用SPSS16.0软件进行数据统计分析。

[0202] 2结果

[0203] 2.1赛葵提取物对DU-145和PC-3细胞增殖抑制作用

[0204] 将赛葵提取物配成5mg/ml、lOmg/ml、15mg/ml、20mg/ml和25mg/ml五个浓度组，分别测定作用24h和48h后，对DU-145和PC-3细胞增殖的影响。结果如下表15。

[0205] 表15赛葵提取物对前列腺癌细胞DU-145、PC-3细胞增殖的影响

[0206]

[0207] 与同种细胞最小抑制率比较：*表示;P<0.01

[0208] 由上表可知，赛葵提取物对DU-145细胞和PC-3细胞均具有抑制作用，且和浓度与作用时间有关系。且25mg/ml样品作用两种细胞48h后抑制率分别达到了82.19%和81.77%。

[0209] 试验例6赛葵提取物治疗前列腺癌142例临床观察

[0210] 1临床资料

[0211] 观察病例均为2009年1月-2012年5月本院住院和门诊患者共142例，病理诊断为前列腺癌。年龄18～90岁，平均72.1岁;病理诊断腺癌134例，鳞癌3例，小圆细胞癌l例，未分化癌4例;临床分期T3一4NxMIc患者21例，其中同时合并骨转移、肺转移、盆腔广泛转移(包括侵犯膀胱、精囊、腰肌、臀部肌群等)8例，合并骨转移、肺转移12例，单l例;T3一4NxMlb期患者110例;TI一2N0M0期患者11例。Gleason评分8-10分48例，7分69例，5-6分22例，2-4分3例。病程l-51月。

[0212] 2治疗方法

[0213] 2.1西医治疗参照《中国泌尿外科疾病诊断治疗指南一前列腺癌诊断治疗指南》中的推荐治疗方案。具体如下:Tl-2N0M0期患者行耻骨后前列腺癌根治术。所有患者均行全雄激素阻断治疗，采用最大雄激素阻断或间歇内分泌阻断;双侧翠丸切除术;并加非类固醇类抗雄激素药物氟他胺，每次250mg，每天3次，口服;或康士德，每次50mg，每天1次，口服。骨转移骨痛患者采用同位素放射治疗，或唑来磷酸治疗。

[0214] 2.2中医治疗:给予赛葵提取物，水煎服（水煎煮约2h，水提取物中总黄酮含量以芦丁计平均为41%）。

[0215] 3观察项目与统计学方法

[0216] 3.1观察项目观察患者治疗前后前列腺特异性抗原(PSA)3项、血清游离睾酮(FT)、血细胞分析、全身骨放射性核素扫描(ECT)、QLQ-C30量表的变化情况，并统计总生存率、总体中位生存期、总体无进展中位时间。

[0217] 3.2统计学方法使用SPSS16.0统计软件数据包进行处理，计量资料分析用两样本均数比较的t检验，计数资料分析用卡方检验。

[0218] 4疗效标准与治疗结果

[0219] 4.1QLQ-C30量表评分疗效标准显效:治疗后标准分较治疗前增加20分以上;有效:标准分增加10-20分;无变化:标准分增加0-9分;加重:标准分较治疗前减少10分以上。

[0220] 4.2QLQ-C30量表评分疗效治疗12月症状改善有效115例，有效率81.0%;潮热症状发生率22.4%;骨质疏松发生率13.8%;乳房肿痛发生率11.7%。

[0221] 4.3生存率及PSA复发情况142例患者随访1-50月，观察期间死亡16例，总生存率88.73%；总体中位生存期27.7月；总体无进展中位时间25.2月。其中T3-4NxMlc期21例患者总体无进展生存期24.3月;去势后PSA最低值0，PSA复发时间(23.9土19.2)月，PSA倍增时间(24.1土20.4)月。T3-4NxMlb期110例患者总体无进展生存期24.3月;去势后PSA最低值。，PSA复发时间(20.1士15.2)月，PSA倍增时间(22.3士17.4)月。

[0222] 4.4骨转移灶及ECT转移灶情况T3-4NxMlb期骨转移灶:骨转移灶消失4例，缩小、变淡79例，无扩散、无增多18例，出现新的转移灶9例。ECT转移灶:ECT转移灶数目治疗前为(7.6士4.7)个，治疗12月后为(3.4土1.7)个，24月后为(2.6士1.4)个，36月后为(4.8士2.1)个。

[0223] 4.5治疗前后血细胞分析变化比较见表16。治疗第24、36月，白细胞(WBC)明显升高，与治疗前比较，差异有非常显著性意义(P<0.01);治疗第12、24、36月血红蛋白(Hb)、血小板(BPC)均明显升高，与治疗前比较，差异有非常显著性意义(P<0.01)。

[0224] 表16治疗前后血细胞变化比较

[0225]

[0226] 与治疗前比较，*P<0.01。