一种提高衣康酸发酵产量的菌株及其构建和利用菌株生产衣康酸的方法

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种提高衣康酸发酵产量的菌株及其构建和利用菌株生产衣康酸的方法。所述菌株为土曲霉中插入乌头酸脱羧酶基因得到重组土曲霉。通过基因工程改造构建带有顺乌头酸脱羧酶基因表达盒PgpdAt1-cad-TtrpC的质粒，将其插入土曲霉中催化顺乌头酸得到过表达顺乌头酸脱羧酶得到重组土曲霉。本发明提供重组菌株的衣康酸发酵产量普遍高于出发菌株。

权利要求

1.一种提高衣康酸发酵产量的菌株，其特征在于：所述菌株为通过基因工程改造在土曲霉中插入乌头酸脱羧酶基因表达盒PgpdAt1-cad-TtrpC得到的重组土曲霉；

所述乌头酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述的提高衣康酸发酵产量的菌株的构建方法，其特征在于：通过基因工程改造构建顺乌头酸脱羧酶基因表达盒，将其插入土曲霉中得到含有顺乌头酸脱羧酶表达盒的重组土曲霉。

3.一种权利要求1所述的提高衣康酸发酵产量的菌株生产衣康酸的方法，其特征在于：

通过基因工程改造构建顺乌头酸脱羧酶基因表达盒，将其插入土曲霉中得到含有顺乌头酸脱羧酶表达盒的重组土曲霉，过表达顺乌头酸脱羧酶来加强催化顺乌头酸生成衣康酸的反应过程，进而提高衣康酸产量。

4.按权利要求3所述的提高衣康酸发酵产量的菌株生产衣康酸的方法，其特征在于：所述顺乌头酸脱羧酶表达盒由土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因、土曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子和构巢曲霉色氨酸合成酶基因终止子组成。

5.按权利要求3所述的提高衣康酸发酵产量的菌株生产衣康酸的方法，其特征在于：将所述重组土曲霉培养于发酵培养基中，所述发酵培养基为:140g L-1葡萄糖，2g L-1 NH4NO3，

0.2g L-1 (NH4)2HPO4，20mg L-1 FeSO4，0.4g L-1 MgSO4，40mg L-1 ZnSO4，40mg L-1 CuSO4和水，用硫酸调整pH至3.5，115℃灭菌10min。

说明书

一种提高衣康酸发酵产量的菌株及其构建和利用菌株生产衣

康酸的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种提高衣康酸发酵产量的菌株及其构建和利用菌株生产衣康酸的方法。技术背景

[0002] 衣康酸是一种重要的化工产品，被美国能源部认为是十二个重要高附加值化学品之一，主要用于腈纶化纤、树脂、橡胶、涂料、造纸、医药、农药、轻工、食品、丝绸等领域。目前国内外所有深层发酵生产衣康酸的工厂都采用土曲霉。如图1所示，在土曲霉中衣康酸的代谢途径是由三羧酸循环分流出来的，三羧酸循环中的顺乌头酸在顺乌头酸脱羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)的催化作用下脱羧形成衣康酸（Kanamasa,S.，Dwiarti,L.，Okabe,M.，Park E.Y.,Cloning andfunctional characterization of the cis-aconitic acid decarboxylase(CAD)gene from Aspergillus terreus.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2008,80,223-229）。Li等对土曲霉在高产和低产衣康酸两种条件下的基因转录差异进行了比较分析，发现翻译成顺乌头酸脱羧酶的cad基因在高产衣康酸条件下的转录水平显著提高（Li,A.,van Luijk,N.,Beek,M.,Caspers,M.,Punt,P.,van der Werf,M.,A clone-basedtranscriptomics approach for the identification of genes relevantfor itaconic acid production in 
Aspergillus.Fungal Genet.Biol.，2011,48,602-611），这一实验结果表明，顺乌头酸脱羧酶是衣康酸生物合成途径中的一个关键酶，在土曲霉中提高cad基因的表达水平将有助于提高衣康酸的发酵产量。

[0003] 关于通过基因工程提高衣康酸发酵产量的研究至今仅有两篇报道。Tevz等通过在土曲霉A156中过量表达6-磷酸果糖激酶突变体解除了针对磷酸果糖激酶的反馈抑制，强化了糖酵解途径，把衣康酸的产量提高了大约2倍，同时发酵周期缩短(Tev,G., M.,M.,Enhancing itaconic acid production by Aspergillus terreus.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2010,87,1657-1664)；Lin等通过在土曲霉NRRL1960中过量表达透明颤菌血红蛋白，提高了菌株对低氧的耐受性，并把衣康酸的发酵产量提高了17%（Lin,Y.H.,Li,Y.F.,Huang,M.C.,Tsai,Y.C.,Intracellular expression of Vitreoscilla hemoglobin inAspergillus terreus to alleviate effect of a short break in aerationduirng culture，Biotechnol.Lett.，2004，26,1067 1072）。但是，关于通过在土曲霉中过表达顺乌头酸脱羧酶提高衣康酸发酵产量的研究，至今未见报道。

发明内容

[0004] 本发明目的在于提供一种提高衣康酸发酵产量的菌株及其构建和利用菌株生产衣康酸的方法。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

[0006] 一种提高衣康酸发酵产量的菌株，所述菌株为通过基因工程改造在土曲霉中插入乌头酸脱羧酶基因表达盒PgpdAt1-cad-TtrpC得到的重组土曲霉。

[0007] 提高衣康酸发酵产量的菌株的构建方法，通过基因工程改造构建顺乌头酸脱羧酶基因表达盒，将其插入土曲霉中得到含有顺乌头酸脱羧酶表达盒的重组土曲霉。

[0008] 利用提高衣康酸发酵产量的菌株生产衣康酸的方法，通过基因工程改造构建顺乌头酸脱羧酶基因表达盒，将其插入土曲霉中得到含有顺乌头酸脱羧酶表达盒的重组土曲霉，过表达顺乌头酸脱羧酶来加强催化顺乌头酸生成衣康酸的反应过程，进而提高衣康酸产量。

[0009] 所述顺乌头酸脱羧酶表达盒由土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因、土曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子和构巢曲霉色氨酸合成酶基因终止子组成。将所述重组土曲霉培养于发酵-1 -1 -1培养基中，所述发酵培养基为:140g L 葡萄糖，2g L  NH4NO3，0.2g L（NH4）2HPO4，20mg L-1 FeSO4，0.4g L-1 MgSO4，40mgL-1 ZnSO4，40mg L-1 CuSO4和水，用硫酸调整pH至3.5，115℃灭菌10min。

[0010] 本发明所具有的优点：本发明提供的基因工程改造土曲霉以提高衣康酸发酵产量的方法，相较于传统的物理、化学等诱变方式，本发明方法目的明确，可操作性强，便于筛选。本发明提供重组菌株的衣康酸发酵产量普遍高于出发菌株，其中产量最高的菌株C27比出发菌株提高了约7g/L（9.5%），具有很强的应用价值。

附图说明

[0011] 图1为本发明背景技术中提到的土曲霉产衣康酸代谢途径图。

[0012] 图2为本发明实施例提供的载体pSGF957质粒图谱,hph-casette为潮霉素抗性元件；sgfp为绿色荧光蛋白基因；TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；Pmgpd为红曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子。

[0013] 图3为本发明实施例提供的载体pJJL-2质粒图谱,其中PgpdAt1为土曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子。

[0014] 图4为本发明实施例提供的载体pXH-1质粒图谱，PgpdAt1为土曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子；TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子。

[0015] 图5为本发明实施例提供的载体pXH-3质粒图谱，PgpdAt1为土曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子；TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子，cad为顺乌头酸脱羧酶脱羧酶基因。

[0016] 图6为本发明实施例提供的载体pXH-4质粒图谱，PgpdAt1为土曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子；TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；hph为潮霉素磷酸转移酶基因，该质粒含有能在土曲霉中过表达hph基因,从而赋予宿主菌潮霉素抗性。

[0017] 图7为本发明实施例提供的重组土曲霉菌株摇瓶发酵产衣康酸能力的比较效果图，WT为出发菌株CICC40205。

[0018] 图8为本发明实施例提供的HPLC分析菌株发酵液中衣康酸的纯度。a：衣康酸标准品；b：出发菌株CICC40205的发酵液；c:重组菌株C27的发酵液；d：重组菌株C5的发酵液。

[0019] 图9为本发明实施例提供的PCR分析部分重组菌株中cad基因表达盒的整合情况。M：200bp DNA maker；1：重组菌株C5;2：重组菌株C12;3：重组菌株C25;4：重组菌株C27;5：重组菌株C28;6：重组菌株C38;7：pXH-3（阳性对照）；8：出发菌株CICC40205（阴性对照）。

具体实施方式

[0020] 载体（vector）是指能够将DNA片段转移到受体细胞中的一种能自我复制的环状DNA分子。

[0021] 启动子（promoter）定义为一种结合RNA聚合酶并指导聚合酶到达编码序列的正确的转录起始位点从而起始转录的DNA序列。RNA聚合酶能有效的催化与编码区适当DNA链互补的信息RNA的装配。启动子还可以理解为包括用于转录mRNA后用于翻译5’非编码区（介于启动子和转录起始位点之间），cis-作用转录调控元件，如增强子和能与转录因子相互作用的其他核酸序列。

[0022] “同一性”或“同一性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，以最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的同一性百分比是由这些序列共有的相同位置的数目的函数（即，同一性百分数＝相同位置的数目/位置的总数（例如，重叠位置）×100)。例如，“同一性百分比”通过下列方式来计算：在比较窗中比较两个经最佳比对的序列，测定在两个序列中出现相同核苷酸碱基或相同氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目（即，窗的大小），并且将结果乘以100从而产生序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述来进行：例如，Smith和Waterman（Smith,T.F.andWaterman,M.S.,Comparison of biosequences,Adv.Appl.Math.,1981,2,482-489）的局部同源性算法；Needleman和Wunsch（Needleman S.B.andWunsch C.D.,A general method applicable to the search forsimilarities in the amino acid sequence of two proteins,J.Mol.Biol.,1970,48,443-453.）的同源性比对算法；Pearson和Lipman（Pearson W.R.,Lipman D.J.,Improved tools for biological sequence comparison,Proc.Natl.Acad.Sci.,1988,85,2444-2452.）的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施（例如，Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA）；或手工比对和目测检查（参见，例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology（1995增刊）。

[0023] 以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。

[0024] 本发明中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I试剂盒（D6942-01）,DNA片段回收是采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒（D6492-01）,凝胶回收是采用OMEGA公司Gel Extraction Kit试剂盒（D2500-01）。土曲霉CICC40205菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

[0025] 实施例1 土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因cad表达盒的构建

[0026] 1.1 表达载体pXH-1的构建

[0027] 以TtrpC-F(5’-cagacatgtagatctaagcttgcggccgcacttaacgttactgaaatc-3’)和TtrpC-R(5’-gtcgtgccagtcgactctaga-3’)为引物对，以质粒pSGF957（由Seoul National university得到，构建质粒图谱如图2，Kim,J.G.，Choi,Y.D.，Chang,Y.J.，Kim,S.U.，Genetictransformation of Monascus purpureus DSM1379，Biotechnology Letters，2003，25,1509–1514）为模板进行PCR扩增TtrpC片段，产物经Pci I（Fermentas,Catalog No.:#ER1871）和Xba I酶切并纯化。pJJL-2是将PgpdAt1启动子片段克隆在pMD18-simple载体上（Takara,Catalog No.:D103A），然后通过定点突变除去pMD18-simple质粒上的Pci I酶切位点所获得(质粒图谱参见图3)，其具体构建方法参照中国专利：一种丝状真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（gpd）的启动子及其应用（申请号201210116163.7）。用Pci I和Xba I对质粒pJJL-2进行酶切，回收载体片段。将回收的pJJL-2片段和TtrpC片段经T4连接酶连接得到质粒pXH-1（参见图4）。

[0028] 1.2 土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因的克隆

[0029] 本发明所使用的土曲霉CICC40205菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物cad-F1( 5’-
gcattccatgaccaa acaatctgcggacag c-3’)和cad-R1（5 ’-
ggcggatccttataccagtggcgatttcacgg-3’），以土曲霉CICC40205的cDNA为模板扩增土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测长度约为1500bp的条带为目的产物，目的条带产物经割胶回收纯化后TA克隆至pMD18-T载体（TaKaRa,Catalog No.:D101A）中，测序后得到质粒pXH-2。测序结果显示克隆的DNA条带为土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因，核苷酸序列为SEQ ID NO.1，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。与已完成基因组测序的土曲霉NIH2624菌株的基因ATEG_09971相比较，同源性为96%，与Kanamasa等人克隆的cad基因(GenBank:AB326105.1)的同源性为100%（Kanamasa,S.，Dwiarti,L.，Okabe,M.，Park E.Y.,Cloning andfunctional characterization of the cis-aconitic acid decarboxylase(CAD)gene from Aspergillus terreus.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2008,80,223-
229）。

[0030] SEQ ID NO.1：

[0031]atgaccaaacaatctgcggacagcaacgcaaagtcaggagttacgtccgaaatatgtcattgggcatccaacctggccactgacgacatcccttcggacgtattagaaagagcaaaataccttattctcgacggtattgcatgtgcctgggttggtgcaagagtgccttggtcagagaagtatgttcaggcaacgatgagctttgagccgccgggggcctgcagggtgattggatatggacagaaactggggcctgttgcagcagccatgaccaattccgctttcatacaggctacggagcttgacgactaccacagcgaagcccccctacactctgcaagcattgtccttcctgcggtctttgcagcaagtgaggtcttagccgagcagggcaaaacaatttccggtatagatgttattctagccgccattgtggggtttgaatctggcccacggatcggcaaagcaatctacggatcggacctcttgaacaacggctggcattgtggagctgtgtatggcgctccagccggtgcgctggccacaggaaagctcctcggtctaactccagactccatggaagatgctctcggaattgcgtgcacgcaagcctgtggtttaatgtcggcgcaatacggaggcatggtaaagcgtgtgcaacacggattcgcagcgcgtaatggtcttcttgggggactgttggcccatggtgggtacgaggcaatgaaaggtgtcctggagagatcttacggcggtttcctcaagatgttcaccaagggcaacggcagagagcctccctacaaagaggaggaagtggtggctggtctcggttcattctggcatacctttactattcgcatcaagctctatgcctgctgcggacttgtccatggtccagtcgaggctatcgaaaaccttcaggggagataccccgagctcttgaatagagccaacctcagcaacattcgccatgttcatgtacagctttcaacggcctcgaacagtcactgtggatggataccagaggagagacccatcagttcaatcgcagggcagatgagtgtcgcatacattctcgccgtccagctggtcgaccagcaatgtcttttgtcccagttttctgagtttgatgacaacctggagaggccagaagtttgggatctggccaggaaggttacttcatctcaaagcgaagagtttgatcaagacggcaactgtctcagtgcgggtcgcgtgaggattgagttcaacgatggttcttctattacggaaagtgtcgagaagcctcttggtgtcaaagagcccatgccaaacgaacggattctccacaaataccgaacccttgctggtagcgtgacggacgaatcccgggtgaaagagattgaggatcttgtcctcggcctggacaggctcaccgacattagcccattgctggagctgctgaattgccccgtgaaatcgccactggtataa

[0032] （a）序列特征：

[0033] ●长度：1473bp

[0034] ●类型：碱基序列

[0035] ●链型：双链

[0036] ●拓扑结构：线性

[0037] （b）分子类型：DNA

[0038] （c）假设：否

[0039] （d）反义：否

[0040] （e）最初来源：土曲霉（Aspergillus terreus）

[0041] （f）特异性名称：顺乌头酸脱羧酶基因(cis-aconitic acid decarboxylasegene，cad)

[0042] SEQ ID NO.2：

[0043]MTKQSADSNAKSGVTSEICHWASNLATDDIPSDVLERAKYLILDGIACAWVGARVPWSEKYVQATMSFEPPGACRVIGYGQKLGPVAAAMTNSAFIQATELDDYHSEAPLHSASIVLPAVFAASEVLAEQGKTISGIDVILAAIVGFESGPRIGKAIYGSDLLNNGWHCGAVYGAPAGALATGKLLGLTPDSMEDALGIACTQACGLMSAQYGGMVKRVQHGFAARNGLLGGLLAHGGYEAMKGVLERSYGGFLKMFTKGNGREPPYKEEEVVAGLGSFWHTFTIRIKLYACCGLVHGPVEAIENLQGRYPELLNRANLSNIRHVHVQLSTASNSHCGWIPEERPISSIAGQMSVAYILAVQLVDQQCLLSQFSEFDDNLERPEVWDLARKVTSSQSEEFDQDGNCLSAGRVRIEFNDGSSITESVEKPLGVKEPMPNERILHKYRTLAGSVTDESRVKEIEDLVLGLDRLTDISPLLELLNCPVKSPLV

[0044] （a）序列特征：

[0045] ●长度：490aa

[0046] ●类型：氨基酸序列

[0047] （b）分子类型：蛋白质

[0048] （c）假设：否

[0049] （d）反义：否

[0050] （e）最初来源：土曲霉（Aspergillus terreus）

[0051] （f）特异性名称：顺乌头酸脱羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase，CAD)[0052] 1.3目的基因cad表达载体和筛选标记hph表达载体的构建

[0053] 分别提取质粒pXH-2和质粒pXH-1，pXH-2质粒用限制性内切酶BspH I（Fermentas，Catalog No.:#FD1284）和BamH I（Fermentas，CatalogNo.:#FD0054）进行酶切，质粒pXH-1用限制性内切酶Pci I（Fermentas,Catalog No.:#ER1871）和Bgl II（Fermentas,Catalog No.:#ER0081）进行双酶切，分别进行割胶回收，其中pXH-2的酶切产物回收大小约为1.5kb的cad基因条带，pXH-1的酶切产物回收大小约为6.5kb的条带。将回收的片段用T4连接酶（Fermentas,Catalog No.:#EL0011）进行连接，转化后挑取阳性克隆子进行验证，测序正确后得到含有一个PgpdAt1-cad-TtrpC表达盒的质粒pXH-3（参见图5）。

[0054] 以引物hph-F(5’-cattcatgactgaactcaccgcgacgtc-3’)和hph-R（5’-gacggatcctattcctttgccctcggacgag-3’）为引物对，以质粒pSGF957为模板，PCR扩增大小约为1019bp的潮霉素磷酸转移酶基因(Hygromycin Bphosphotransferase gene，hph)，纯化后的PCR片段用BspH I和BamH I进行双酶切，割胶回收hph基因条带，将回收的hph基因与前面经Pci I和Bgl II酶切后回收的pXH-2用T4连接酶进行连接，转化后挑取阳性克隆子进行验证，测序正确后得到质粒pXH-4（参见图6）。pXH-4是一个能在丝状真菌中表达hph基因的载体，可为丝状真菌共转化提供潮霉素抗性筛选标记。

[0055] 实施例2 制备含有PgpdAt1-cad-TtrpC表达盒的重组土曲霉

[0056] 2.1土曲霉CICC40205原生质体的制备

[0057] 1）将土曲霉CICC40205的孢子悬液接种至50mL液体培养基ME中（培养基ME为每升-1 -1 -1 -1 -1水中20g L 葡萄糖，2g L  NH4NO3，20mg L（NH4）2HPO4，20mg L FeSO4，0.4g L MgSO4，
4.4mg L-1 ZnSO4），浓硫酸调节pH至3.5，使孢子浓度约为107个/mL，在200rmp、32°C培养12-
18h。

[0058] 2）用无菌单层200目尼龙布过滤收集长出的菌丝，并用灭菌的0.6MMgSO4溶液冲洗三次，压干后置于无菌的50ml三角瓶中；按称取1g菌丝，加入10ml酶解液，在30°C、60rpm处理1-3h。酶解液成分为：0.8%纤维素酶（Sigma，Catalog No.：C1184）、0.8%裂解酶（Sigma，Catalog NO.：L1412）、0.4%蜗牛酶(上海生工，Catalog No.：SB0870)、0.6M MgSO4，经由0.22μm的无菌过滤器过滤除菌。

[0059] 3）将上述酶解后的混合液先用2层无菌的擦镜纸过滤，再用5层擦镜纸过滤，收集滤液。4°C离心收集原生质体，用预冷1.0M山梨醇溶液洗涤一次，再用预冷的STC(STC为1.0M山梨醇，50mM Tris·HCl-pH 8.0，50mM CaCl2)洗涤一次，最后把原生质体重悬于150μl预冷的STC，并用STC将原生质体浓度调整为5×107个/mL，得到原生质体悬液。

[0060] 2.2 pXH-3与pXH-4共转化土曲霉

[0061] 1）在上述原生质体悬液中加入约5μg（体积不超过10μl）线性化的pXH-3质粒和1μg线性化的pXH-4质粒，再入50μl PTC(PTC为40％PEG4000，50mM Tris-HCl pH8.0，50mM CaCl2)，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL PTC，混匀后室温放置20min；然后与上层琼脂混合后倾注于再生筛选培养基平板PDA-SH上（3.9g马铃薯右旋糖琼脂培养基（DifcoTMPotato Dextrose Agar）(BD,LOT:1165825)和22g山梨醇（Sigma,LOT:071M00271V）溶解在100ml蒸馏水中，灭菌，冷却至约55°C时加入潮霉素（Solarbio，Catalog No.：M419099）至终浓度为100μg/mL，制备平板），在30°C、黑暗条件下培养3－4天。

[0062] 2）从平板上将转化子转接至筛选平板PDA-H上（称取4g马铃薯右旋糖琼脂培养基溶解于100ml蒸馏水中，灭菌，冷却至约55°C时加入潮霉素至终浓度为100μg/mL，制备平板），在30°C培养3-5天，即重组菌株。

[0063] 3)将所得重组菌株转接到PDA-H平板上进行传代培养，传代3次。然后再分别收集孢子用并生理盐水进行适当的梯度稀释，取100μL涂布于PDA-H平板上，使其长出独立的单菌落，即为单孢分离。再从单菌落上取孢子再次进行单孢分离，共进行4次单孢分离传代培养。

[0064] 实施例3 重组土曲霉发酵产衣康酸

[0065] 3.1 重组菌株产衣康酸的摇瓶筛选

[0066] 1）配制衣康酸发酵培养基IPM:140g L-1葡萄糖，2g L-1 NH4NO3，0.2gL-（1 NH4）2HPO4，20mg L-1 FeSO4，0.4g L-1 MgSO4，40mg L-1 ZnSO4，40mgL-1 CuSO4，用硫酸调整pH至3.5，115℃灭菌10min。

[0067] 2）将上述所得重组菌株，以及重组菌株传代后稳定的重组土曲霉菌株分别接种至土曲霉产孢斜面培养基（10g L-1葡萄糖，2gL-1 NaNO3，0.2gL-1,KH2PO4，20mg L-1 FeSO4，5g L-1 MgSO4，0.5g L-1 NaCl，40mg L-1 ZnSO4，40mgL-1 CuSO4，0.5%麸皮，1.5%琼脂糖，115℃灭菌15min，然后分装至试管，再115℃灭菌25min，制备斜面），32℃培养6天获得成熟的孢子。再分别将各个培养至成熟的孢子接种至衣康酸发酵培养基中（500ml三角瓶中装有55ml衣康酸发酵培养基），每株菌做两瓶平行，37℃，220rpm发酵72h。过滤除去发酵液中的菌丝，发酵上清液则进行酸碱滴定，测定发酵液中的总酸。由于发酵液中的主要有机酸是衣康酸，因此通常将测得的总酸认为是衣康酸的量，并以此来计算衣康酸的含量（刘建军，衣康酸发酵的研究，天津科技大学博士学位论文，2003）。除少数几株菌株产酸明显下降外，其余绝大部分菌株产酸都优于出发菌株（参见图6）。

[0068] 3）根据产酸结果，选取22株产酸较好的菌株再进行复筛，每株菌做三瓶平行。测定总酸，结果如图7所示，22株重组菌株的产酸普遍高于出发菌株CICC40205(WT)，其中最高的菌株C27比出发菌株提高了7g/L（9.5%）。

[0069] 3.2 发酵液中衣康酸的纯度分析

[0070] 选取重组菌株C5、C27和出发菌株CICC40205的发酵上清液进行高效液相色谱分析（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），以分析比较发酵液中衣康酸的纯度。色谱柱:Bio-rad Aminex HPX-87-H,300mmx7.8mm；流动相：4mmol/L硫酸；流速：0.8ml/min；
温：30℃；检查温度：30℃；紫外检测器（210nm）。结果如图8所示，保留时间在13.317min的峰为衣康酸，分析结果表明，重组菌株C5和C27发酵液中的衣康酸纯度与出发菌株CICC40205相比没有显著变化，都在99%以上。

[0071] 实施例4 高产衣康酸重组土曲霉菌株基因型验证

[0072] 挑取产酸较高的重组土曲霉菌株接种于PDA-H平板上培养孢子，然后分别将孢子接种于ME液体培养基中进行培养，收集菌丝提取基因组，以PgpdAt-seqF（5’-gctctgtagcttttgccccgtc-3’）和TtrpC-seqR（5’-cgagatcctgaacaccatttgtctc-3’）为引物对进行PCR，扩增转化载体中的PgpdAt1-cad-TtrpC元件，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，验证转化子中PgpdAt1-cad-TtrpC元件的整合情况。PgpdAt-seqF引物位于PgpdAt1启动子上，cad基因起始密码子上游约260bp处，TtrpC-seqR引物位于TtrpC终止子上，cad基因终止密码子下游约120bp处，因此PCR扩增产物比cad基因约大380bp，即约1850bp（参见图9）。电泳结果显示挑选的转化子中都能扩增到1850kb的条带，以野生型土曲霉CICC40205菌株基因组DNA模板作为阴性对照，没有扩增到DNA片段。因此，证明这些转化子中都成功整合了PgpdAt1-cad-TtrpC表达盒。