一种应用高效液相色谱法同时测定植物蜕皮激素类物质的方法

摘要

本发明公开了一种应用高效液相色谱法同时测定植物蜕皮激素类物质的方法，其步骤包括：a、采用YMC250×4.6mm，S-5μm色谱柱；b、采用甲醇-水的流动相进行梯度洗脱；c、流速：1.0mL／min，进样量：20μL，柱温：38℃；d、波长：260nm，扫描波长：200-600nm。本发明操作简便，分离快速，灵敏度高，无需更换色谱柱，而且结果稳定性好、重复性高。

权利要求

1.一种应用高效液相色谱法同时测定植物蜕皮激素类物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别制备20-羟基蜕皮甾酮、α-蜕皮甾酮、2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮和7-脱氢胆固醇的标准溶液母液和混合标准溶液母液；

(2)取上述制备的混合标准溶液母液，按照倍比稀释的方法，配成5种浓度，稀释溶剂为甲醇，经0.45μM微孔滤膜过滤后，各取20μL进样分析；

(3)进行高效液相色谱分析：

实验仪器：美国沃特世液相色谱仪的系统：四元输液泵P4000、在线真空脱气机、全自动进样器AS1000、二极管阵列检测器UV6000LP；

色谱条件：采用YMC 250×4.6mm，S-5μm色谱柱；采用甲醇-水的流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为0-30min，甲醇30％→95％；30-40min，甲醇95％→100％；40-60min，甲醇100％；60-65min，甲醇100％→30％；65-70min，甲醇30％；流速：1.0mL/min，进样量：

20μL，柱温：38℃；波长：260nm，扫描波长：200-600nm；

(4)定性定量分析

将上述5种倍比浓度的20-羟基蜕皮甾酮、α-蜕皮甾酮、2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮和7-脱氢胆固醇的混合标准溶液进样检测，每个浓度进样3次，进行相关性回归分析。

说明书

一种应用高效液相色谱法同时测定植物蜕皮激素类物质的

方法

技术领域

[0001] 本发明属于于分析化学领域。涉及一种色谱检测的方法，具体涉及一种应用高效液相色谱法同时测定植物蜕皮激素类物质的检测方法。

背景技术

[0002] 蜕皮激素是一类非常重要的植物次生代谢产物，具有昆虫蜕皮活性的天然甾体化合物，在植物抵抗植食性昆虫侵害中扮演着十分重要的角色。因此，阐明植物蜕皮激素的生物合成途径，不仅在基础研究上具有理论意义的突破，而且在生产上为农业害虫防治提供新技术。

[0003] 在植物蜕皮激素生物合成的途径中，20-羟基蜕皮甾酮是其终产物，7-脱氢胆固醇、2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮和α-蜕皮甾酮为中间产物，上述化合物均具有7-烯-6-酮结构，可吸收一定波长的紫外线，故多采用高效液相色谱紫外法检测其含量。此法不仅操作简便、分析速度快，灵敏度高，而且结果稳定性好、重复性高。

[0004] 然而，国内外现有的检测方法均不能在同一色谱条件下同时检测上述多种蜕皮激素类物质。目前，尚未见应用高效液相色谱紫外法同时检测蜕皮激素合成的中间产物和终产物含量的报道，只有对某一种蜕皮激素类物质检测的研究。因此，建立一种应用高效液相色谱紫外法同时检测蜕皮激素合成的中间产物和终产物含量的方法，对于研究蜕皮激素的生物合成途径具有重要的应用价值。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种应用高效液相色谱法同时测定植物蜕皮激素类物质的方法，本发明可以同时测定植物蜕皮激素类物质。分别选择强极性以20-羟基蜕皮甾酮为代表、中极性以α-蜕皮甾酮和2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮为代表、和弱极性以7-脱氢胆固醇为代表的蜕皮激素类物质。其具体技术方案为：

[0006] 一种应用高效液相色谱法同时测定植物蜕皮激素类物质的方法，包括以下步骤：

[0007] (1)分别制备20-羟基蜕皮甾酮(20E；20-Hydroxyecdysone)、α-蜕皮甾酮(E；Ecdysone)、2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮(2D-20H，2-deoxy-20-Hydroxyecdysone)和7-脱氢胆固醇(7-DHC，7-Dehydrocholesterol)的标准溶液和混合标准溶液；

[0008] (2)取上述制备的标准液母液，按照倍比稀释(梯度浓度)的方法，配成5种浓度，稀释溶剂为甲醇，经0.45μM微孔滤膜过滤后，各取20μL进样分析；

[0009] (3)进行高效液相色谱分析。

[0010] 实验仪器：美国沃特世液相色谱仪的系统：四元输液泵P4000、在线真空脱气机、全自动进样器AS1000、二极管阵列检测器(DAD)UV6000LP；

[0011] 色谱条件：采用YMC250×4.6mm，S-5μm色谱柱；采用甲醇-水的流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为0-30min，甲醇30％→95％；30-40min，甲醇95％→100％；40-60min，甲醇100％；60-65min，甲醇100％→30％；65-70min，甲醇30％；流速：1.0mL／min，进样量：20μL，柱温：38℃；波长：260nm，扫描波长：200-600nm；

[0012] (4)定性定量分析

[0013] 将上述5种倍比浓度的20-羟基蜕皮甾酮、α-蜕皮甾酮、2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮和7-脱氢胆固醇的混合标准溶液进样检测，每个浓度进样3次，进行相关性回归分析。

[0014] 进一步优选，所述蜕皮激素为20-羟基蜕皮甾酮、α-蜕皮甾酮、2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮和7-脱氢胆固醇。

[0015] 进一步优选，步骤b中采用甲醇-水的流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为0-30min，甲醇30％→95％；30-40min，甲醇95％→100％；40-60min，甲醇100％；60-65min，甲醇100％→30％；65-70min，甲醇30％。

[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0017] 1、本发明首次应用高效液相色谱紫外检测法，同时测定混合标准品中的20-羟基蜕皮甾酮、α-蜕皮甾酮、2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮和7-脱氢胆固醇的含量；

[0018] 2、本发明操作简便，分离快速，灵敏度高，且无需更换色谱柱；

[0019] 3、本发明经过长期、大量的试验，摸索出应用高效液相色谱紫外法同时测定混合标准品中的20-羟基蜕皮甾酮、α-蜕皮甾酮、2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮和7-脱氢胆固醇含量的色谱条件：流动相组分和梯度洗脱程序、流速、进样量、柱温和检测波长等；

[0020] 4、在一定检测范围内，四种物质标准曲线线性方程的R2值均大于0.99，表明线性关系较好。

附图说明

[0021] 图1混合标准品的色谱图。

具体实施方式

[0022] 下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

[0023] 一种高效液相色谱法同时测定植物蜕皮激素类物质的检测方法，包括以下步骤：

[0024] 1.采用YMC250×4.6mm，S-5μm色谱柱；

[0025] 2.采用甲醇-水的流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为0-30min，甲醇30％→95％；30-40min，甲醇95％→100％；40-60min，甲醇100％；60-65min，甲醇100％→30％；65-70min，甲醇30％；

[0026] 3.流速：1.0mL／min，进样量：20μL，柱温：38℃；

[0027] 4.检测波长：260nm，扫描波长：200-600nm；

[0028] 5.分别制备20-羟基蜕皮甾酮(20E；20-Hydroxyecdysone)、α-蜕皮甾酮(E；Ecdysone)、2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮(2D-20H，2-deoxy-20-Hydroxyecdysone)和7-脱氢胆固醇(7-DHC，7-Dehydrocholesterol)的标准溶液和混合标准溶液；

[0029] 6.混合标准品的检测：

[0030] 20-羟基蜕皮甾酮、α-蜕皮甾酮、2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮和7-脱氢胆固醇标准品溶液的配置采用色谱级甲醇溶解和稀释，并采用超纯水配置成混合标准溶液。

[0031] 7.进行高效液相色谱分析。

[0032] 实验仪器：Waters Vaccum degasser，P4000pump，AS1000auto sampler，UV6000LP Photo Diode Array detector；

[0033] 色谱条件：采用YMC250×4.6mm，S-5μm色谱柱；采用甲醇-水的流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为0-30min，甲醇30％→95％；30-40min，甲醇95％→100％；40-60min，甲醇100％；60-65min，甲醇100％→30％；65-70min，甲醇30％；流速：1.0mL／min，进样量：20μL，柱温：38℃；波长：260nm，扫描波长：200-600nm。

[0034] 试剂：20-羟基蜕皮甾酮、α--蜕皮甾酮、2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮和7-脱氢胆固醇标准品均购自Sigma公司；甲醇色谱级，购自德国Merck公司。

[0035] 一、混合标准溶液的配制

[0036] 首先配置标准混合溶液母液，其浓度分别为20-羟基蜕皮甾酮100mg/L、α-蜕皮甾酮100mg／L、2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮100mg/L和7-脱氢胆固醇200mg／L，溶剂为甲醇，分装后置于-20℃冰箱中备用。

[0037] 取上述制备的标准液母液，按照倍比稀释(梯度浓度)的方法，配成5种浓度，稀释溶剂为甲醇，经0.45μM微孔滤膜过滤后，各取20μL进样分析。

[0038] 二、定性定量分析

[0039] 将上述5种倍比浓度的20-羟基蜕皮甾酮、α-蜕皮甾酮、2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮和7-脱氢胆固醇的混合标准溶液进样检测，每个浓度进样3次，进行相关性回归分析。得出：20-羟基蜕皮甾酮的线性范围是6.25-100.00mg／L，回归方程为：2
y=62.196x-57.386，相关系数R=0.9998；α-蜕皮甾酮的线性范围是6.25-100.00mg／L，
2
回归方程为：y=13.77x+79.4，相关系数R=0.9973；2-脱氧-20-羟基蜕皮甾酮的线性范围
2
是6.25-100.00mg/L，回归方程为：y=16.368x+316.93，相关系数R=0.9911；7-脱氢胆固醇
2
的线性范围是12.50-200.00mg/L，回归方程为：y=0.0122x+0.0136，相关系数R=0.9926。

[0040] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。